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神经化学杂志。作者手稿；2018年4月1日PMC发布。
以最终编辑形式发布为：
神经化学杂志。2017年4月；141(2): 195–207.
2017年3月15日在线发布。 数字对象标识：10.1111/约13958
预防性维修识别码：第5383517页
美国国立卫生研究院：NIHMS845029
PMID：28099989

饮食酮类酯对阿尔茨海默病3xTgAD小鼠模型海马糖酵解和TCA循环中间产物及氨基酸的影响

罗伯特·鲍洛斯基,1 马丁·肯佩尔,1 吉祥英雄卡西瓦亚,1 M.托德·金,1 马克·马特森,2和理查德·韦奇1
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

在阿尔茨海默病（AD）患者和三重转基因（3xTgAD）AD小鼠模型中，大脑中的低血糖代谢先于记忆力丧失和认知能力下降。大脑中酮的代谢绕过了糖酵解，因此可以纠正与葡萄糖低代谢相关的几种缺陷。将由D-β-羟基丁酸酯和R-1，3丁烷二醇组成的膳食补充剂（称为酮类酯（KE））纳入啮齿类动物的饮食中，并喂给3xTgAD小鼠8个月。在16.5个月大时，对动物实施安乐死并解剖大脑。对海马和额叶皮层进行糖酵解和TCA（三羧酸）循环中间产物、氨基酸、氧化脂质和蛋白质以及酶的分析。与对照组相比，KE喂养的小鼠海马中D-β-羟基丁酸的浓度更高，其中TCA循环和糖酵解中间体以及能量相关生物标志物n-乙酰天冬氨酸的浓度也更高。在受控喂养动物的海马中，游离线粒体[NAD+]/[NADH]比率被高度氧化，而KE-fed动物的线粒体减少。此外，与对照组相比，氧化蛋白和脂质的水平更低，ATP水解的能量更大。与对照组相比，维持在KE补充饮食中的3xTgAD小鼠糖酵解和TCA循环代谢物浓度更高，线粒体氧化还原电位更低，海马中氧化脂质和蛋白质的数量更低。KE提供了一种潜在的治疗方法，可以对抗患者和转基因模型常见的基本代谢缺陷。

关键词：酮体、海马、细胞能量学、线粒体、糖酵解

图形摘要

我们假设，在阿尔茨海默病（AD）三转基因（3xTG AD）小鼠模型中，饮食中补充酮类物质（D-β-羟基丁酸酯和R-1,3丁二醇）会升高血酮，克服脑葡萄糖代谢不足，挽救线粒体功能，并减少β-淀粉样蛋白的生成。这项研究是首次尝试全面量化3xTG模型中的神经化学缺陷，并提供了治疗AD代谢缺陷的新方法。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为nihms845029u1.jpg

介绍

过去几十年来，在两名阿尔茨海默病（AD）患者身上进行的研究占优势(库纳等。2011)在AD动物模型中(丁等。2013年a,姚明等。2009,丁等。2013年b)已经证明，在明显的认知能力下降和记忆缺陷之前，大脑葡萄糖代谢低下往往是明显的。早期报告估计，基于18PET显像对“老年性阿尔茨海默病型痴呆”患者氟脱氧葡萄糖摄取的研究(德莱昂等。1983,弗拉科威克等。1981). 虽然低血糖代谢在大脑中发生的差异很大，但它主要与影响学习、记忆和行为的区域有关。利用酮体的葡萄糖替代疗法可以恢复与低糖代谢相关的能量不足，并为延缓和/或减少症状前期个体的认知功能下降提供潜在的治疗优势(莫斯科尼等。2008,威奇等。2001,Veech and King，2016年).

使用β-羟基丁酸酯（KE）的酮类膳食补充剂，在动物8.5个月大时，再给三重转基因AD小鼠株（3xTgAD）喂食8个月。这些动物在12个月和15个月时接受了一系列与记忆和焦虑相关的行为范式，并在研究结束时进行了组织学分析(卡西瓦亚等。2013). 据报道，KE-fed动物表现出行为和学习能力的改善，海马区淀粉样β（Aβ）和磷酸化Tau（p-Tau）蛋白的含量显著降低。为了评估KE饮食干预对细胞代谢的影响，我们现在利用稳定同位素稀释质谱法和同组动物的氧化应激特征（蛋白质和脂质氧化），对糖酵解和TCA循环中间产物和氨基酸进行定量测定。由于Aβ的积累可能部分受到细胞氧化还原环境（游离[NAD]）的影响+]/[NADH]和[NADP+]/[NADPH]比率），因为这些对的还原形式恢复了细胞抗氧化剂的还原能力(快克等。2011)，我们还确定了自由[NAD+]/[NADH]和[NADP+]/[NADPH]比率。在这些分析中，选择海马和额叶皮层作为Aβ和p-Tau蛋白积累相对较高和较低的区域进行比较(Kashiwaya等人，2013年).

材料和方法

动物程序、饮食和组织采集

所有程序均由国家老龄研究所动物护理和使用委员会批准。以前曾报道过3xTgAD小鼠的初始生成和特征Kashiwaya等人（2013）。本研究中使用的小鼠来自一个已经回交到C57BL/6基因背景上8代的群体。如前所述Kashiwaya等人（2013），有11至15只雄性3xTgAD小鼠，在标准的12小时昼夜节律周期下，每笼2至3只小鼠为一组。当它们8.5个月大时，使用简单的随机化程序将小鼠分配到两个饮食组中的每一组，通过随机化方法将动物随机分配，以便在每组15只小鼠的对照饮食组和酮酯饮食组（酮酯，KE；或对照，CON）之间平均分配窝友。此外，每个饮食组的动物平均体重KE-fed（37.1+/-1.8 g）和CON-fed（375+/-0.8 g）接近总样本的平均体重（37.3+/-1.1 g）。小鼠不是成对喂食，而是在每天大约06:00时接受4-5克颗粒（10.8-13.5千卡）。在整个研究过程中，定期测量体重。这两个饮食组的小鼠都具有类似的活性，如Kashiwaya等人（2013）喂食KE的动物在野外试验中明显更活跃，表明摄入了足够的卡路里。CON和KE饮食已在前面充分描述(Kashiwaya等人，2013年). 简要地，CON和KE日粮是按照定制程序在内部生产的，包括将纯化的膳食大量营养素与额外的营养素和维生素混合物混合，并与水混合，以获得符合美国营养研究所制定的啮齿动物维持日粮营养指南（AIN-93）的半固体颗粒(Kashiwaya等人，2013年). CON和KE日粮的热量含量均为2.7 kcal/g。CON和KO日粮中的碳水化合物含量分别为64.9%和43.5%的热量。KE饮食还包括以酮类酯的形式额外摄入21.5%的热量。对照日粮含有137g玉米淀粉/1000 g和0g KE。KE日粮含有85g淀粉/1000 g和125g KE/1000 g。KE由D-β-羟基丁酸和R-1,3-丁二醇合成(Kashiwaya等人，2013年). 从8.5个月龄开始，随意给动物喂食CON或KE饮食，再喂食8个月。喂食KE饮食的动物保持体重，这些测定的进一步细节已公布(Kashiwaya等人，2013年). (Kashiwaya等人，2013年). 在16.5个月大时对小鼠实施安乐死，移除皮层和海马体，一半的组织立即在液氮中冷冻，并在−80°C下储存，直到分析，另一半作为报告的大脑进行组织学分析(Kashiwaya等人，2013年). 由于微波固定可以改变柠檬酸盐浓度并影响ATP水平，因此选择快速冷冻大脑作为组织保存方法(斯里瓦斯塔瓦等。2012年a). 然后使用冷冻脑组织进行蛋白质和代谢物分析，如下所述。

材料

试剂和仪器

稳定同位素标记(13C-和2H-）有机酸标准品和氨基酸（乳酸、丙酮酸、柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、富马酸和苹果酸）均来自CDN同位素（魁北克省Pointe-Claire）。这个13C-标记的磷酸烯醇丙酮酸盐从剑桥同位素实验室（马萨诸塞州剑桥）获得(Srivastava等人，2012年a). 标记的24（S）-羟基胆固醇（d6）来自阿凡提极性脂质（Alabaster，AL）。如前所述，在室内合成了标记的磷酸二羟丙酮（DHAP）、3-磷酸甘油酯（3PG）和异柠檬酸盐(Srivastava等人，2012年a). 这个13C-乙酰-CoA和13C-葡萄糖-6-磷酸从Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯）获得。标签4-HNE来自开曼化学公司（密歇根州安阿伯）。N-甲基-N-（叔丁基甲基硅基）三氟乙酰胺（MTBSTFA）与1%叔丁基二甲基氯硅烷（TBDMCS）试剂和双三甲基氟甲基硅基（BSTFA，购自Pierce（Rockford，IL）。根据之前制定的程序，使用安捷伦1100系列带有电喷雾电离的二元泵（安捷伦，威明顿，德国）在安捷伦5973四极GC-MS（安捷伦特，威明敦）或安捷伦毛细管电泳离子阱质谱仪（Ultra）上分析样品(Srivastava等人，2012年a,卡西瓦亚等。2010).

血糖和酮类分析

根据之前的方法，使用葡萄糖和酮棒以及精密X射线仪（美国伊利诺伊州雅培公园雅培实验室）分析解冻小鼠血浆中的葡萄糖和β-羟丁酸(Kashiwaya等人，2013年).

高氯酸（PCA）萃取

将冷冻脑组织（20–40 mg）提取到3.6%的PCA溶液中，并用KHCO中和三（3 M）根据上述方法(Kashiwaya等人，2013年). 提取物的最终体积为100μL。

有机酸的气相色谱-质谱

取20微升提取物用于测定乳酸、丙酮酸、柠檬酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、β-羟基丁酸和乙酰乙酸，以及等量的C13-或2添加H标记的内标物（超过内源性代谢物的2到3倍），以通过气相色谱-质谱进行定量分析。将样品样品的水溶液在氮气流（99.99%）下还原至干，并根据先前描述的方法与叔丁基二甲基甲硅烷基氯反应以形成甲硅烷基酯和醚(Srivastava等人，2012年a). 将一微升衍生样品注入30米毛细管气相色谱柱，并在四极质谱仪上以电子碰撞模式进行分析。使用未标记化合物的最显著离子片段的面积数与标记内标物的类似离子的面积数之比对单个代谢物进行量化。

磷酸化糖酵解中间体的气相色谱-质谱分析

取20微升提取物用于测定葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）、二氢丙酮-磷酸（DHAP）、3-磷酸甘油酯（3PG）和磷酸烯醇丙酮酸（PEP）。在电子碰撞模式下，使用GC-MS分析磷酸化化合物作为其三甲基硅醚衍生物（TMS），并使用13根据先前发布的程序，每个分析物的C标记内部标准(Srivastava等人，2012年a).

谷氨酸、天冬氨酸、N-乙酰天冬氨酸酯、γ-氨基丁酸和4-羟基壬醛（4-HNE）的气相色谱-质谱

用冷冻脑的高氯酸提取物测定谷氨酸、天冬氨酸、N-乙酰天冬氨酸酯、γ-氨基丁酸（GABA）和4-HNE。它们作为硅醚衍生物进行分析，使用13如前所述，使用气相色谱-质谱法对每种分析物进行C标记标准(帕洛斯基等。2010).

乙酰辅酶A的毛细管电泳质谱

酰基辅酶a化合物的测定脑组织样品使用改良的氯仿-甲醇提取程序提取，并根据先前描述的方法通过CE-MS进行分析(Kashiwaya等人，2010年)添加了13C-标记乙酰辅酶A内部定量标准，如前所述(Pawlosky等人，2010年).

24（S）-羟基胆固醇的气相色谱-质谱分析

为了测定24（S）-羟基胆固醇的浓度，将200μl解冻血浆添加到6μl 24（S”-羟基胆固醇（d6）（52 ng/μl）中，并用3:4:2水：氯仿：甲醇溶液萃取。样品涡流2分钟，并在4°C下离心，以使氯仿和水层分离。去除氯仿层，取20μl溶液，并在氮气流下蒸发，以便根据先前发布的程序进行GC-MS分析(坎佩尔等。2015)并通过比较标记内标物的假分子离子与天然化合物的峰面积比直接进行定量。

蛋白质和蛋白质分析

通过添加5μL/mg组织冰冷裂解缓冲液（20mM HEPES、1%Triton x-100、1%脱氧胆酸钠、1mM DTT、1%SDS、1X蛋白酶抑制剂（Thermo Scientific Pierce Protein Biology）、1mM NaF、5mM EDTA、10mMβ-甘油磷酸和250μM Na）制备全细胞裂解液三VO（旁白）4)并在冰上超声3次，持续5秒，在4°C下以15000×g离心12分钟进行澄清，并在−80°C下保存，直至使用。使用与洗涤剂兼容的蛋白质定量试剂盒（Biorad）测量蛋白质浓度，并使用50 mM DTT（Life Technologies）在LDS样品缓冲液（Life Technologies）中以4μg/μL蛋白质制备最终加载样品。将60μg全细胞裂解液加载到NuPAGE NOVEX 4–12%Bis-Tris凝胶的每个孔中，并将其转移到Immobilon-FL PVDF（Millipore）上。使用5%牛奶在TBS+0.1%吐温20中的溶液来阻断和稀释一级和二级抗体（1:5000，LiCor Biosciences，与IRdye偶联的兔抗体800，与IRdye偶联的小鼠抗体680），使用LiCor Odyssey扫描仪进行扫描和定量。主要抗体包括：ADAM10（Rb 1:1000，Abcam ab1997）、GFAP（Rb 1:50000，Abcam-ab7260）、Actin（Ms 1:2000，Abcam ab3280）、BACE1（Rb 1-1000，Abcam ab2077）。

蛋白质氧化产物的定量

根据制造商的说明使用Oxyblot蛋白质氧化检测试剂盒（Millipore，USA）。在每个样品中使用15μg组织裂解液，将所得衍生/中和溶液的一半用于下游印迹。简单地说，NuPAGE Bis-Tris 4–12%凝胶（生命科技）使用MES运行缓冲液（生命技术）运行，转移到Immobilon-FL PVDF（Millipore）上，与荧光二级抗体（兔，LiCor Biosciences，1:5000 in 1%BSA/PBST）孵育；使用LiCor Odyssey床扫描仪扫描斑点（有关更多详细信息，请参阅肯珀等。(2013)作为衍生蛋白的自荧光对照，首先扫描不含二级抗体的印迹，在不含二次抗体的任何印迹中均未观察到信号。非衍生控制具有极低的信号，用于量化目的的背景。

草酰乙酸浓度、ATP水解ΔG、游离[NAD的计算+]/[NADH]比率和游离[NADP+]/[NADPH]比率(佐藤等。1995,伯格曼等。2010).

苹果酸脱氢酶催化草酰乙酸(盖恩等。1973)

K（K）中密度脂蛋白=2.86×10-12M（M）=[草酸酯][H（H）+][马拉特]×[NADH公司][纳德+]细胞质的[草酸酯]=2.86×10-12M（M）×[马拉特][H（H）+]×[纳德+][NADH公司]细胞质的

其中pH=7.2，[H+] = 6.31×10−8M（M）

ATP水解ΔG(Bergman等人，2010年,威廉姆森等。1967)

ΔG公司=ΔG公司°+RT公司(自然对数([纳德+][NADH公司])×10-710-酸碱度自然对数([问][QH（质量健康）2]))纳德+NADH公司=[ACAC公司]×[H（H）+][BHB公司]×k个BHBDH公司问QH（质量健康）2=[琥珀酸盐][富马酸盐]×k个SDH公司ΔG公司=ΔG公司°+RT公司(自然对数([ACAC公司]×[H（H）+][BHB公司]×k个比伯度)×10-710酸碱度-自然对数([琥珀酸盐][富马酸盐]×k个SDH公司))

其中kBHBDH公司= 4.93×10−9M、 k个SDH公司=171.84，pH=7.2，[H+]=6.31×10−8M、 ΔG°=−81.05kJ/mol

免费[NADP+]/【NADPH】(Londesborough&Dalziel 1968年)

[α公斤2-]×[一氧化碳2][Isocit公司三-]×[纳德ph][NADP公司+]=K（K）ICDH公司=1.17M（M）

因此

[NADP公司+][纳德ph]=[α公斤2-]×[一氧化碳2][Isocit公司三-]×1K（K）ICDH公司

其中[CO2]=【HCO】三−]×[H+]/(10−6.1)=1.986mM，pH 7.2，含[HCO三−]=2500万通过亨德森·哈塞尔巴赫

免费[NAD+]/[NADH]-细胞溶质(Williamson等人，1967年)

[梨-][拉克-]×[NADH公司][纳德+]=K（K）乳酸脱氢酶=1.11×10-4

重新安排

[纳德+][NADH公司]=[梨-][拉克-]×1K（K）乳酸脱氢酶

免费[NAD+]/[NADH]-线粒体(Williamson等人，1967年)

K（K）β重型肝炎=[β血红蛋白][纳德+][ACAC公司][NADH公司][H（H）+]=4.93∗10-9M（M）[纳德+][纳德]=[ACAC公司][H（H）+][β血红蛋白]K（K）β重型肝炎

统计

所有数据值均以平均值±SEM表示。统计差异通过GraphPad Prism 6中的Student t检验确定。所有病例的统计显著性均设定为P≤0.05。

结果

饮食对动物体重的影响

动物体重在研究期间波动，但在大约12个月时，两种饮食组的体重似乎都达到了平稳期(Kashiwaya等人，2013年). 在整个研究过程中，KE-fed动物保持体重不变，但体重低于CON-fed小鼠。CON-fed和KE-fed小鼠14个月龄时的平均体重分别为40.3+/-2.1和37.0+/-1.2克。开始进食时，所有动物的平均体重为37.3+/-1.1。在16.5个月时，KE-fed组小鼠的平均体重比对照组低9–10%（41.5+/-2.5 vs 37.1+/-0.5）(Kashiwaya等人，2013年).”

组织分析、血糖和酮类水平以及24-s-胆固醇

总共有24个海马和皮层组织样本可用，并在这些分析中进行了评估（KE饮食=12）（CON饮食n=12）。由于高氯酸提取会破坏蛋白质，因此将样品分为两组，一组用于蛋白质分析（治疗组和对照组的n=5或6），另一组用于糖酵解磷酸化中间体、TCA循环酸、氨基酸、乙酰辅酶A和4-羟基壬醛（4-HNE）的分析（n=5和6，在每个治疗组中为对照组）。

血糖、β-羟基丁酸（β-HB）和24-S-羟基胆固醇浓度

各组间血糖浓度无差异（CON:155±8.5和KE:152±9.0 mg/dl）。KE-fed组的血β-HB浓度显著高于KE-fed组（CON:0.14 mM±0.01 vs KE:0.72±0.13 mM；p<0.05）。Meidenbauer等人所述的葡萄糖酮指数（GKI）是血糖浓度与血β-羟基丁酸浓度的比值。CON喂养组的GKI为72.0+/−25.1，KE喂养组的GKI为19.4+/−14.4，p<0.001，这表明KE喂养的小鼠处于治疗性酮症状态(梅登鲍尔等。2015). 在KE-fed小鼠中，24-S-羟基胆固醇（脑胆固醇转换的生物标志物和长期增强调节剂）的血浆浓度较高，（CON:0.135±0.016 vs KE:0.212±0.018 nmol/mL；n=8，p<0.05）。分析了KE-fed和CON-fed小鼠组合脑区（海马和皮层）中24-S-羟基胆固醇的浓度。与CON-fed动物相比，KE-fed小鼠中该代谢物的浓度为CON:33.0+/-3.7 vs KE:40.9+/-5.0 pMol/mg组织，n=10，p<0.06

糖酵解中间体

在KE-fed小鼠的皮层中，G-6-P的浓度与对照组相比略低（−10%）（CON:0.064±0.002 vs KE:0.058±0.002μmol/G；P<0.05），而DHAP的浓度则显著较低（CON:0.80±0.012 vs KE:0.052±0.005μmol/G；P<0.05）(图1A). 两组间其他糖酵解中间体3PG、PEP或丙酮酸的浓度没有差异(图1A). 有趣的是，与CON饮食的小鼠相比，KE-fed小鼠大脑皮层中乳酸与丙酮酸的比率（16.2±3.0）更低（p<0.05），这似乎是KE-fed组丙酮酸浓度高于对照组的结果（CON:0.057±0.014 vs KE:0.087±0.015μmol/g）而不是乳酸（CON:1.35±0.20 vs KE:1.31±0.10μmol/g）（参见表1). 与皮质中这些代谢物的浓度相比，对照小鼠海马中G-6-P、DHAP、3PG和PEP的浓度明显较低。在KE-fed小鼠的皮层和海马中，这些中间产物的浓度相似(图1A和B). 此外，在CON组和KE组小鼠的海马中，糖酵解中间产物的浓度显著低于CON组小鼠中的G-6-P（−39%）、DHAP（−29%）、3PG（−34%）、PEP（–34%）和丙酮酸（−34%）。

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KE饮食对糖酵解和TCA循环中间产物浓度的影响。使用同位素稀释质谱法在喂食酮酯（KE）或对照（CON）饮食的3XTgAD小鼠的皮层（A，C）和海马（B，D）中测量这些代谢物。草酰乙酸（OAA）的计算方法如方法部分所示。绘制的值为平均值±SEM，n=5–6，*在学生t检验中显示显著性（p<0.05）。

表1

KE饮食对细胞溶质和线粒体氧化还原电位以及用于测定它们的代谢物浓度的影响。使用代谢产物乳酸、丙酮酸、β-羟基丁酸、乙酰乙酸、异柠檬酸和α-酮戊二酸对喂食对照饮食（CON）或含有β-羟基丁酸酯（KE）的饮食的小鼠的皮层和海马进行测定。μmol/g组织中的数量以平均±SEM的形式列出，n=5–6，*在学生t检验中显示显著的p<0.05。

Cortex公司海马
反对的论点韩国反对的论点韩国
乳酸（μMol/g）1.31 ± 0.1441.35 ± 0.071.80 ± 0.211.58 ± 0.07
丙酮酸（μMol/g）0.057 ± 0.0970.087 ± 0.0110.076 ± 0.0070.116 ± 0.016*
细胞NAD/NADH230 ± 21388 ± 58*250 ± 23411 ± 48*
β-羟基丁酸酯（μMol/g）0.112 ± 0.0080.103 ± 0.0010.116 ± 0.0270.182 ± 0.011*
乙酰乙酸（μMol/g）0.034 ± 0.0030.038 ± 0.0050.084 ± 0.0080.048 ± 0.008*
线粒体NAD/NADH3.97 ± 0.484.74 ± 0.609.27 ± 0.843.44 ± 0.64*
异柠檬酸盐（μMol/g）0.0045±0.00090.0072 ± 0.0011*0.0087 ± 0.00390.0139 ± 0.0020*
α-酮戊二酸（μMol/g）0.073 ± 0.0130.052 ± 0.0040.132±0.0220.280 ± 0.040*
NADP+/NADPH0.034 ± 0.0080.014 ± 0.003*0.032 ± 0.0080.039 ± 0.008
ΔGATP水解（千焦/摩尔）−62.3 ± 0.5−61.6 ± 0.2−59.3 ± 0.4−64.3 ± 0.5*

TCA循环中间产物

在KE-fed小鼠的皮层中，只有柠檬酸盐显著升高（CON:0.089±0.010 vs KE:1.14±0.008μmol/g；p<0.05）。其他TCA循环中间产物异柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、富马酸和苹果酸没有差异(图1C). 值得注意的是，在KE喂养的小鼠海马中，柠檬酸盐（+100%）、异柠檬酸盐（+60%）、α-酮戊二酸盐（+112%）、琥珀酸盐（+80%）、富马酸盐（+127%）和乙酰辅酶A（+103%）的浓度均高于CON喂养的动物(图1D).

氨基酸

在两种饮食的小鼠大脑皮层中，氨基酸、谷氨酸（CON:7.0±0.6 vs KE:6.4±0.3μmol/g）、天冬氨酸（CON:3.9±0.2 vs KE:4.1±0.8μmol/g/g）n-乙酰天冬氨酸酯（CON:6.5±0.8 vs KE:5.9±0.5μmol/g）、GABA（CON:0.19±0.03 vs KE:0.24±0.41μmol/g）的浓度相似(图2A). 相反，在喂食KE饮食的小鼠海马中，天冬氨酸（+63%，CON:2.13±0.22 vs KE:3.48±0.52μmol/g；p<0.05）和n-乙酰天冬氨酸酯（+59%，CON:8.42±0.44 vs KE:13.01±1.08(图2B). 海马体中n-乙酰天冬氨酸水平低与人类的焦虑和抑郁水平较高有关(Matthew S.J.等人，2008年). 因此，我们利用了之前从相同的3xTgAD小鼠中获得的数据，这些小鼠是通过使用高架平台和符号迷宫（如Kashiwaya等人，2013年并将两个饮食组中每只小鼠花费的时间百分比与海马n-乙酰天冬氨酸的浓度进行关联(图3). 与闭臂或中心相比，在迷宫开放臂部分停留时间更长的动物被认为表现出较低的总体焦虑。据报道，与控制饮食的小鼠相比，KE-fed小鼠在迷宫开放臂部分的时间明显更长(Kashiwaya等人，2013年). 我们现在报告了海马n-乙酰天冬氨酸的数量与个别动物在KE-Fed（R=0.862）和对照-Fed（R=0.789）迷宫开放臂部分停留的时间百分比之间的强正相关相反，海马n-乙酰基天门冬氨酸与小鼠留在迷宫闭臂和中央部分的时间百分比呈负相关（KE-fed，R=−0.769）（对照-fed，R=−0.805）。酮酯饮食显著增加了海马中n-乙酰天冬氨酸的浓度，而KE-fed动物更有可能留在迷宫的开放臂部分(图3). 维持两种饮食的小鼠海马中的谷氨酸浓度相似（CON:9.2±1.1 vs KE:10.5±0.9μmol/g）。有趣的是，与对照组相比，喂食KE饮食的动物海马GABA较低（CON:0.32±0.05 vs KE:0.17±0.03μmol/g；p<0.05）。最近的研究表明，受AD影响的大脑区域GABA水平的异常升高与星形胶质细胞和其他神经胶质细胞的Aβ活化有关(乔等。2014). 结合在KE-fed小鼠中观察到的较低GABA水平，我们观察到，与喂食CON小鼠的小鼠相比，KE-fed动物海马裂解物中活化的星形胶质细胞标记物胶质纤维酸蛋白（GFAP）的数量显著降低（-27%，N=5-6，p<0.05）(图2C).

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KE日粮对氨基酸含量的影响；谷氨酸、天冬氨酸、n-乙酰天冬氨酸酯和γ-氨基丁酸（GABA）。使用同位素稀释质谱法对喂食KE或CON饮食的3XTgAD小鼠大脑皮层（A）和海马（B）中的这些氨基酸进行定量。用免疫印迹法测定海马（C）中活化星形胶质细胞的标志物GFAP，量化GFAP和肌动蛋白带之间的荧光强度比。绘制的值为平均值±SEM，n=5–6，*表示在学生t检验中p<0.05时具有显著性。

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线性相关图描述了3xTgAD小鼠的海马n-乙酰天冬氨酸（NAA）与每只动物在封闭臂和中心（a）或开放臂（B）中停留的时间百分比之间的关系，这些小鼠以酮酯饮食（n=7）或控制饮食（n=7）维持一期试验中高架（距地面60厘米）和标志形平台迷宫的区域(Kashiwaya等人，2013年). 海马NAA浓度与动物在迷宫任一区域的时间百分比之间有很强的相关性。对照组饮食喂养的小鼠海马NAA浓度较低，在闭合臂中停留的时间较长，而吃酮类酯类饮食的小鼠更喜欢迷宫的开放区部分。

细胞质和线粒体氧化还原状态、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸库和ATP水解的ΔG

胞浆游离[NAD+]/[NADH]比率由糖酵解中间体乳酸浓度与丙酮酸浓度之比确定。这些计算的更多细节在以前的报告中概述(Sato等人，1995年,Bergman等人，2010年,Kashiwaya等人，2010年). 大脑皮层和海马体中这些中间产物的浓度与冷冻脑组织相当，这表明组织处理程序保持了样品的完整性(Sato等人，1995年,Bergman等人，2010年,Kashiwaya等人，2010年). 在KE-fed小鼠的皮层和海马中，细胞质被显著氧化（游离[NAD大约增加65%+]/[NADH]），而向氧化方向的转变主要是由于丙酮酸浓度增加(表1). 值得注意的是，在每个饮食组中，海马体和皮层的细胞液氧化还原电位是相似的。

线粒体游离[NAD+]/[NADH]比率是使用β-羟基丁酸盐（βHB）与乙酰乙酸盐（AcAc）浓度的比值来确定的，乙酰乙酸是一种由β-HB脱氢酶催化的近平衡反应(Bergman等人，2010年,Williamson等人，1967年). 在两种饮食中保持的小鼠皮层中，线粒体游离[NAD+]/[NADH]比率相似(表1). 此外，KE-fed小鼠的海马和皮层具有类似的氧化还原状态。值得注意的是，线粒体[NAD+]/与KE-fed小鼠相比，喂食CON饮食的小鼠海马中的[NADH]氧化还原状态被高度氧化（+127%）(表1).

自由[NADP+]/[NADPH]比率是通过异柠檬酸与α-酮戊二酸（αKG）的浓度比来确定的，这是一种由异柠檬酸脱氢酶催化的反应(Bergman等人，2010年,威奇等。1969). 在KE-fed小鼠的皮层中，游离[NADP+]/[NADPH]比率显著降低，表明NADPH的可用性增加(表1). 尽管KE-fed小鼠海马中异柠檬酸和αKG的浓度显著高于KE-fed鼠，但游离[NADP+]/[NADPH]氧化还原状态没有不同。

与ATP水解的ΔG相关的能量是通过ATP的末端磷酸键断裂释放的能量。该值以kJ/mol为单位，通过线粒体游离[NAD+]/[NADH]比率和Q/QH2氧化还原状态(Bergman等人，2010年,Sato等人，1995年). Q/QH2氧化还原状态由琥珀酸与富马酸的浓度之比决定，富马酸是由琥珀酸酯脱氢酶催化的反应(Bergman等人，2010年). 饮食对皮层ATP水解的ΔG没有影响（CON:-62.3±0.5 vs KE:-61.6±0.2 kJ/mol），与健康脑组织的观察结果相似(Kashiwaya等人，2010年). 在海马中，与对照组相比，KE-fed小鼠的ATP水解ΔG能量显著增加（CON:−59.3±0.4 vs KE:−64.3±0.5 kJ/mol；p<0.05）。与受损脑区酮代谢相关的ATP水解能量的显著增加对恢复细胞工作功能至关重要。水解能量的增加与酮体代谢导致ATP水解的能量ΔG增加并恢复衰竭心脏模型中的功输出的另一个例子在数量上相似(Sato等人，1995年).

酮代谢对脂质和蛋白质氧化的影响

酮代谢的一个后果是NADP系统的氧化还原电位降低(Veech等人，1969年)它控制谷胱甘肽的减少，谷胱甘苷在这种小鼠菌株中已被氧化(高希等。2014,Veech 2004年). 我们观察到，与CON-fed小鼠相比，喂食KE饮食的小鼠海马中的蛋白质羰基化量较低（−19%，p<0.05），这是由二硝基苯基肼（DNP）反应性和4-HNE（减少3倍，p<0.05）决定的(图4). 蛋白质羰基化和脂质过氧化分别是由羟基自由基对蛋白质或膜不饱和脂肪酸的攻击引起的。有趣的是，两种饮食中的小鼠大脑皮层的蛋白质羰基化和4-HNE生成水平相似，这也与KE-fed小鼠海马中观察到的数量相当，表明酮代谢在减少ROS损伤易发区域的自由基损伤方面非常有效。

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KE饮食对喂食KE或CON饮食的3XTgAD小鼠大脑皮层和海马中蛋白质羰基化和4-羟基壬醛（4-HNE）浓度的影响。蛋白质羰基的DNP衍生化用western blotting检测。（A） 饮食对海马DNP染色影响的代表性印迹包括用于背景定量的未激活通道。（B） 显示了这些斑点相对于对照水平的定量。（C） 采用同位素稀释质谱法对大脑皮层和海马中的4-HNE进行定量。绘制的值为平均值±SEM，n=5–6，*在学生t检验中显示显著性（p<0.05）。

酮代谢对分泌酶蛋白水平的影响

这些喂食KE的小鼠的海马区域先前被证明具有较低水平的Aβ斑块(Kashiwaya等人，2013年). 淀粉样蛋白积累量减少的部分原因可能是通过改变分泌酶ADAM10（α-分泌酶）或BACE1（β-分泌酶）的活性或数量来改变淀粉样前体蛋白（APP）的代谢。使用海马裂解物的western blot测定这些酶的蛋白质水平，发现与对照组相比，KE-fed动物的ADAM10高21%（p<0.05），BACE1低23%（p<0.05。在Aβ斑块堆积水平无差异的皮层样品中未观察到显著变化(Kashiwaya等人，2013年).

讨论

使用放射性标记的葡萄糖类似物（如fDG）进行的PET研究一致表明，AD患者大脑中与处理记忆有关的区域（如海马、后扣带回、颞叶和顶叶）的葡萄糖代谢率较低（低20-30%）(Kapogiannis和Mattson 2011,Cunnane等人，2011年). 在AD（3xTgAD）转基因小鼠模型中，丁及其同事观察到老年海马对fDG的摄取降低，神经元单羧酸转运体MCT 2升高(Ding等人2013b). 此外，姚和同事发现酮类代谢酶增加；琥珀酰辅酶a:3-酮酸辅酶a转移酶（SCOT）和乙酰辅酶a乙酰转移酶1（ACAT1）在转基因小鼠中的表达(Yao等人，2009年). 有趣的是，使用同位素标记的β-羟丁酸冬眠啮齿类动物已被证明通过上调MCT1（持续进入觉醒状态）来增加其大脑对酮类作为首选能量底物的利用(安德鲁斯等。2009). 胰岛素抵抗、脑血流量减少、GLUT转运体抑制、糖酵解酶抑制和淀粉样蛋白刺激的PDH磷酸化均导致临床AD和转基因模型中的糖代谢降低(普林斯2008,Frackowiak等人，1981年,Cunnane等人，2011年,Kapogannis&Mattson 2011年). 由于我们的研究不包括野生型对照组，因此大脑代谢物的浓度仅适用于此处使用的老龄转基因小鼠模型。此外，由这些浓度衍生的胞质和线粒体氧化还原电位可能与其他小鼠品系无关。

低糖代谢导致NAD和NADP氧化还原池氧化(高希等。2012)最终，在限制受损生物分子和细胞器积累的同时，执行基本功能的能力降低。据我们所知，这是首次在AD小鼠模型中检测循环β-羟基丁酸盐的特异性直接升高对一系列神经化学物质的影响的研究，也是首次全面详细的报告，涵盖了糖酵解和TCA循环途径的广泛代谢物，其中一些用于测定细胞能量和氧化还原电位，以及衍生的神经递质和氨基酸，以及通过其ROS产物测量海马（一个区域）的相关蛋白质和脂质损伤，与使用维持高血酮水平的KE饮食的大脑皮层相比，其受Aβ和p-Tau积累的影响较大。在这里，我们报道饮食中的KE可以纠正能量缺乏的几个关键标志，例如减少线粒体游离[NAD]+]/[NADH]池和增加ATP水解的ΔG(表1)主要位于海马体。这里提出的许多积极结果都与海马中的酮代谢有关，此前有报道称，与对照组喂养的动物相比，相同KE-fed小鼠海马区域的免疫反应性淀粉样细胞数量较少(Kashiwaya等人，2013年)同样，这些动物的海马区包含的免疫反应性p-Tau细胞数量远高于两种饮食中小鼠的皮层(Kashiwaya等人，2013年). 使用这种阿尔茨海默病动物模型将稳定同位素标记的酮类酯纳入研究设计，将有助于阐明不同受累脑区利用酮类满足能量需求和合成目的的程度，例如合成氨基酸和脂质。这些分析中使用的组织取自安乐死小鼠，并迅速冷冻，以减少缺氧的影响，正如在乳酸与丙酮酸的比率中观察到的那样，该比率与冷冻吹塑的脑组织相符，这是一种保持体内状态的程序(Kashiwaya等人，2010年).

尽管许多研究表明，AD患者或AD动物模型中fDG的摄取减少，但在两种饮食的小鼠皮层中G-6-P的浓度没有显著差异（CON:0.064或KE:0.058μMol/G组织；图1A). 这与之前对健康大鼠进行的饮食干预研究一致，在该研究中，补充KE的饮食对整个大脑中G-6-P的浓度没有影响(Kashiwaya等人，2010年). 相反，我们发现在KE-fed 3xTgAD小鼠的海马中观察到较高浓度的β-HB(表1)，包括G-6-P、DHAP、3PG、PEP、丙酮酸和计算的草酰乙酸在内的几种糖酵解中间产物也有升高(图1B、D). 该区域的β-HB水平较高可能是由于MCT2转运增加，这已被证明在老年3XTgAD小鼠的海马中增加(Ding等人2013a)和KE饮食小鼠血酮升高。KE-fed小鼠海马中TCA循环代谢物、柠檬酸盐、异柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸和富马酸以及乙酰辅酶A的浓度也显著升高(图1D). 在KE-fed小鼠海马中观察到的TCA循环中间产物浓度增加可能是由于线粒体功能增加或线粒体生物生成增加。之前，我们观察到，与对照组相比，在30天两人一组给C57BL/6J小鼠喂食液体KE后，动物肩胛间棕色脂肪组织中线粒体数量增加，线粒体生物基因调节蛋白水平升高(Srivastava，S.等人，FASB J.2012). 海马糖酵解中间产物浓度的升高可能是由于糖酵分解不受抑制，或可能是由于碳底物流量增加，以及酮类通过苹果酸或柠檬酸盐向胸膜炎途径的转运进入胞浆的线粒体代谢当量减少。胞浆游离[NAD相对氧化的观察支持了后一种观点+]/KE-fed小鼠的[NADH]池(表1)表明NAD相关的细胞溶质酶如甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）发生逆转。此外，KE-fed小鼠海马中细胞溶质草酰乙酸的表观浓度增加（+53%）与柠檬酸和苹果酸在细胞溶质中代谢从而增加草酰乙酸水平的假设一致，草酰乙酸是ATP-柠檬酸裂解酶和苹果酸脱氢酶的产物。然后，草酰乙酸被磷酸-烯醇-丙酮酸羧激酶（PEPCK）利用，以产生磷酸烯醇丙酮酸（PEP），在KE-fed小鼠中，PEP增加50%，随后3PG、DHAP和G-6-P增加(图1B). 这些细胞溶质代谢物在维持KE-fed小鼠海马区细胞内稳态方面发挥着关键作用，包括信号级联、生成细胞溶质NADPH和核苷酸合成。

我们已经证明，在KE-fed小鼠中，线粒体游离[NAD+]/[NADH]氧化还原状态变得更加减少，有利于NADH(表1). 根据以下结果对这些结果进行更广泛的检查Ghosh等人（2012年）证明酮的代谢在本质上是拯救高度氧化的线粒体氧化还原状态。通过挽救氧化还原电位，与KE-fed小鼠的皮层相比，该细胞更能预防和/或修复氧化损伤，导致海马组织中的脂质和蛋白质氧化产物显著减少(图4). 自由[NADP+]/[NADPH]氧化还原偶在电池中的最大电化学电位为−0.42V。这反过来又促使谷胱甘肽、抗坏血酸和生育酚对还原到各自的还原状态。而[NADP+]/]酮代谢未显著改变海马中的NADPH]比率(表1)我们观察到氧化损伤减少(图4A-C)表明NADPH的利用以及淀粉样斑块的减少(Kashiwaya等人，2013年). 此外，此处观察到的NAD和Q氧化还原状态的变化有利于NAD的减少和Q的氧化，这表明酮类代谢也通过降低线粒体超氧化物的主要来源半氧化Q-半醌类物质的数量减少了破坏性ROS的产生(机会等。1979).

细胞氧化还原状态的改变和氧化损伤的增加可通过诱导BACE1/β-分泌酶刺激病理性淀粉样前体蛋白（APP）向Aβ代谢(Kwak等人，2011年). 3xTgAD小鼠产生高水平的APP，其代谢依赖于一个称为α、β和γ分泌酶的蛋白酶家族。两种主要的分解途径是通过α-分泌酶或β/γ分泌酶。后者与毒性Aβ聚集和疾病进展有关，而前者与神经元保护和APP处理有关(马特森2004). 这里，我们已经表明，维持KE饮食的小鼠海马中α-分泌酶增加，但β-分泌酶降低(图5)这与之前在相同动物中发现的Aβ蓄积量较低一致(Kashiwaya等人，2013年)以及之前对雌性3xTgAD小鼠进行的研究，这些小鼠一直保持2脱氧葡萄糖饮食，以增加血酮(姚明等。2011).

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KE饮食对淀粉样代谢酶ADAM10（α-分泌酶）和BACE1（β-分泌酶蛋白水平的影响。使用Western Blot法，通过靶带和肌动蛋白之间的荧光强度比，在喂食KE或CON饮食的3XTgAD小鼠的海马中测量ADAM1（A）和BAcel（B）的水平。显示了具有代表性的斑点。绘制的值为平均值±SEM，n=4-6，*表示学生t检验中显著P<0.05。

通过利用NADPH的原位生物合成，通过CYP36A1氧化将其作为24-S-羟基胆固醇去除，从而维持大脑中的膜胆固醇稳态。在几种脑疾病和病理学中，与正常对照组和野生型小鼠相比，患有AD的人类受试者和通过基因工程积累磷酸化-Tau的转基因动物、脑膜失衡导致24-S-羟基胆固醇的血浆浓度降低(布雷蒂隆等。2000,比洛等。2015). 在这里，我们证明了维持KE饮食的小鼠血液中24-S-羟基胆固醇的浓度几乎高出2倍。还分析了KE-fed和CON-fed小鼠大脑组合区域（海马和皮层）中24-S-羟基胆固醇的浓度。这种代谢物的浓度在KE-fed动物中似乎有所升高（CON:33.0+/-3.7 vs KE；40.9+/-5.0 pMol/mg组织，n=10，p<0.06）；然而，这并没有达到显著水平，因此留下了一个悬而未决的问题，即大脑中酮的代谢是否能够通过其更为降低的细胞氧化还原电位来维持膜内稳态(表1)以及提供活性炭基板(图1D)脂质生物合成所必需的。在对CYP36A1的单独分析中，我们发现各组之间海马体中的酶水平没有差异（数据未显示）。

给3xTgAD小鼠喂食KE饮食对皮层中的氨基酸浓度没有任何显著影响(图2A). 之前，我们已经证明，与对照组动物相比，将大鼠维持在补充KE或高脂肪饮食14天会导致全脑谷氨酸和GABA浓度降低(Kashiwaya等人，2010年). 然而，在KE-fed 3xTgAD小鼠的海马中，GABA的水平显著降低，GABA是主要的抑制性神经递质，对应于星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的低水平。在AD小鼠模型中，较低水平的星形胶质细胞释放GABA与海马体长期增强的改善和更好的记忆结果有关(Jo等人，2014年). 与之前报道的对照组相比，KE-fed小鼠海马中GABA水平较低可能在一定程度上解释了记忆改善和探索行为结果增加的原因(Kashiwaya等人，2013年). KE饮食是否会提高非转基因小鼠的认知能力尚不清楚。然而，在使用八臂径向迷宫进行的测试中，与其他饮食的大鼠相比，使用KE-diet的大鼠的认知功能有所改善(Murray等人，2016年). 此外，在KE-fed小鼠的海马中，天门冬氨酸和n-乙酰天门冬胺酸的浓度都较高。海马中能量连接的n-乙酰天冬氨酸浓度较高，这是因为TCA循环衍生的乙酰辅酶A的可用性增加(图1)以及通过草酰乙酸从天冬氨酸中衍生出的碳单位(图2)这也可能揭示了KE饮食对小鼠的强大的抗焦虑作用，即KE饮食可以显著降低小鼠在高架加号迷宫开放臂部分停留更长时间的焦虑(图3).

由于衰老3xTgAD小鼠海马中酮类摄取的潜在增加(Ding等人2013b,Yao等人，2009年)，人们尝试使用非特异性的生酮饮食来治疗AD，因为生酮饮食可以提高人体摄入脂肪中的一系列脂质和其他营养素(克里科里亚语等。2012)在动物模型中(布朗洛等。2013,贝克特等。2013). 由于饮食配方、动物年龄和遗传菌株的差异，结果有点好坏参半。两项独立于基因型的小鼠研究表明，生酮饮食在提高握力方面具有重要意义，但在异常蛋白质积累和记忆效应方面没有明显变化。然而，我们注意到，在之前维持KE饮食的老年3xTgAD小鼠中，记忆出现中度积极变化，焦虑显著减轻，探索行为增加(Kashiwaya等人，2013年). 此外，这些变化与海马细胞能量学的改善、更有利的氧化还原电位、ROS损伤的减少和GABA水平的降低相一致。为了产生可比较的血酮浓度，布朗洛及其同事在两种替代的AD小鼠模型中消除了引起血糖下降的膳食碳水化合物。与这两种模型中的任何一种不同，3xTgAD小鼠菌株已被证明具有增加的酮代谢能力(Yao等人，2011年,Ding等人2013a)并通过改善淀粉样蛋白加工来应对酮的利用(Yao等人，2011年). 酮酯在APOe4阳性的阿尔茨海默病患者中取得了显著的成功(纽波特等。2015). 即使单次给药或在5天内重复给药将血酮升高到5-6mM，KE也没有明显毒性(克拉克等。2012). 在这里，我们已经证明，在3xTgAD小鼠中补充KE可使血浆β-HB增加5倍，并纠正海马体中的能量不足，这已被生物标记物的改善和氧化损伤的减少所证实。KE补充剂可以治疗临床疾病，因为它可以解决人类和转基因动物的基本代谢缺陷。

致谢

这项工作由国家酒精滥用和酒精中毒研究所和国家老龄研究所（NIA）的校内研究项目资助。R.L.Veech可能会从牛津大学国立卫生研究院和牛津大学为使酮酯商业化而成立的TdeltaS有限公司拥有的专利中获得版税。我们非常感谢国家老龄研究所瑞钱湾的技术援助。

缩写词表

第三方集团3-磷酸甘油酯
4-HNE公司4-羟基壬烯醛
Aββ淀粉样蛋白
AD公司阿尔茨海默病
ADAM10型一种去整合素和金属蛋白酶结构域蛋白10
BACE1公司β分泌酶1
β-HBβ-羟基丁酸酯
DHAP公司磷酸二羟基丙酮
fDG公司氟脱氧葡萄糖
GFAP公司胶质纤维酸蛋白
G-6-磷酸6-磷酸葡萄糖
韩国酮酯或（R）-（（R）-3-羟基丁基）3-羟基丁酸酯
PCA公司高氯酸
政治公众人物磷酸烯醇丙酮酸盐
问辅酶Q或泛醌
TCA公司三羧酸

脚注

人类受试者：否

如果是：获得知情同意和伦理批准：

=>如果是，请确保方法中包含“所有受试者都获得了知情同意，并且实验得到了当地伦理委员会的批准。”。

已遵循到达指南：

是的

=>如果否，跳过整个句子

=>如果是，请插入“所有实验均按照ARRIVE指南进行。”

利益冲突：RL Veech可能从酯的潜在商业化中获得版税=>如果“无”，插入“作者无需声明利益冲突”

=>否则插入信息，除非已经包含

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