J Reprod开发。2015年4月；61(2): 145–153.
胶原蛋白复合物提高成年小鼠成纤维细胞生成iPS细胞的效率
,1,* ,2,*和2
Byung-Soo CHANG公司
1）韩国中南汉森大学美容系356-706
蔡云中（Yun-Jung CHOI）
2)大韩民国首尔143-701孔国大学动物生物科学与技术学院动物生物技术系
金浩KIM
2)大韩民国首尔143-701建国大学动物生物科学与技术学院动物生物技术系
1）韩国中南汉森大学美容系356-706
2)大韩民国首尔143-701建国大学动物生物科学与技术学院动物生物技术系
*B-S Chang和Y-J Choi对这项工作做出了同等贡献。
2014年6月25日收到；2014年12月25日接受。
这是一篇根据知识共享署名非商业无衍生品（by-nc-nd）许可条款发布的开放存取文章。
- 补充资料
补充表
GUID:3B104BDC-A4BE-457F-8856-7EB3DEABBFDC
补充图
指南：02CD7098-C5DA-441E-8591-58D61148065E
摘要
正在测试不同的干预措施，以恢复成年鼠源性成纤维细胞的青春活力。然而，一些基本问题仍未解决，例如成年小鼠源性成纤维细胞活性随年龄增长而下降。因此，在本研究中，我们研究了胶原蛋白复合物治疗对成年小鼠源性成纤维细胞的再生或重新编程是否有有利影响。此外，我们研究了用总胶原蛋白复合物治疗期间成年小鼠源性成纤维细胞的再生机制。我们从幼年小鼠的尾部分离出总胶原蛋白复合物，并培养成年小鼠衍生成纤维细胞（含或不含胶原蛋白复合体）。与不含胶原蛋白复合物培养的成纤维细胞相比，含胶原蛋白复合体培养的成年成纤维细胞在连续五代中表现出更年轻的状态，扩张速度更快，并表现出减少的自发细胞死亡。培养于胶原蛋白复合物的存在也显示了细胞周期相关基因（如PCNA）启动子区域的广泛去甲基化，增加了增殖，减少了衰老。此外，与单独培养的成人成纤维细胞相比，年轻和成年成纤维细胞通过重组成纤维细胞成为诱导多能干细胞的效率明显更高。此外，机制证据表明，参与抗增殖途径的基因包括墨水4a/Arf基因座和第53页在胶原复合物暴露的成纤维细胞中表达下调。有趣的是，我们的结果表明，再生过程是通过α2β1整合素依赖的Bmi-1途径介导的。因此，胶原蛋白复合物既能刺激成纤维细胞增殖，又能抑制细胞死亡和生长停滞，这似乎是一种很有希望的提高成纤维细胞效率的方法重新编程。
关键词：衰老、胶原蛋白复合物、诱导多能干细胞（iPS）、小鼠、再生、重编程
通过病毒转导四种转录因子，即Oct4（POU域5类转录因子1；Octamer-4）、Sox2（性别决定区Y-box 2）、C-myc（禽骨髓细胞瘤病毒致癌基因同源物）和Klf4（Krüppel-like factor 4），小鼠和人体细胞可被重编程为诱导多能干细胞（iPS）[1,2,三,4,5,6]. 这一发现的临床实用性最初受到两个问题的严重影响：细胞发生恶性转化的倾向[7]事实上，只有一小部分经过处理的细胞表达所有四种因子[8]. 逆转录病毒拷贝的随机整合导致遗传异质性，只有0.001%至0.01%的感染细胞重编程为多能状态。随后，根据内源性多能性基因的重新激活选择重新编程的细胞[7,9]或使用形态学标准[2,8].
最近，二次重编程系统已经将重编程细胞之间的遗传变异降至最低。鼠标[10]和人类[11]携带一种表达Oct4、Sox2、Klf4和C-myc的多西环素（Dox）诱导慢病毒的体细胞已被成功重新编程，生成了效率更高的二级iPS细胞。鉴于iPS细胞避免了免疫排斥问题和与胚胎干细胞（ESCs）相关的伦理问题，这提高了将其用于患者特定再生医学的可能性。然而，最近的一项研究表明，四种重编程因子的表达通过上调衰老墨水4a/Arf位点基因表达，第53页和CDK抑制剂第16页墨水4a和第21页CIPI公司[12]. 因此，iPS电池效率低推导仍然是一个重大挑战。
多重稳态信号的一个来源体内是细胞外基质（ECM），它为组织提供支架并调节许多基本的细胞过程，如增殖、存活、迁移和分化[13,14,15]. 另一个研究小组报告称，溶解I型胶原可以促进大鼠骨髓干细胞的分化[16]. 内源性胶原蛋白的抑制导致ESC特性的逐渐丧失[17]. 此外，苏和韩[18]据报道，I型胶原蛋白刺激小鼠胚胎干细胞的自我更新。
细胞衰老涉及基因组不稳定、端粒丢失、氧化损伤、基因编程和细胞死亡[12]. 最近，研究人员开始对设计有效的方法来生成和重新编程iPS细胞感兴趣。因此，在本研究中，我们首先研究了胶原蛋白复合物治疗对成年小鼠皮肤成纤维细胞的再生是否有有利影响。其次，采用衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-βgal）和细胞增殖试验评估细胞衰老。第三，我们探讨了胶原蛋白复合物在提高成年小鼠源性成纤维细胞重编程效率中的作用。最后，我们研究了胶原蛋白复合物促进成纤维细胞增殖、减少衰老、抑制细胞死亡和生长停滞的机制。
材料和方法
动物伦理学
所有动物实验均按照孔雀大学动物护理和实验委员会的指导方针（IACUC批准号：KU11035）进行。小鼠被安置在22±1℃的铁丝笼中，在70%湿度下进行12小时的光-暗循环。用标准饮食喂养小鼠随意.
实验设计
为了检测成年小鼠皮肤成纤维细胞再生的有益效果，我们制备了含有山梨四因子的转基因小鼠，然后制备了同时含有四因子和四因子的双转基因小鼠10月3/4-GFP基因与Oct3/4-GFP小鼠交配。从这些双转基因小鼠中分别获得成年（A，1岁以上）和年轻（Y，1个月大）小鼠来源的成纤维细胞，以避免转染变异。在涂有胶原复合物的培养皿上培养的A成纤维细胞被称为“Ac-fibroblasts”。接下来，使用衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）测定、细胞增殖测定、TUNEL测定和第16页mRNA表达分析。最后，通过计算诱导性多能干细胞的数量来检测成年小鼠源性成纤维细胞在胶原蛋白复合物处理前后重新编程的效率菌落。
pTET-CKOS质粒的构建
c-Myc-2A型,Klf4-2A公司，以及10月4-2A日将含有口蹄疫病毒2A序列的PCR产物（5′-aga gcc gag ggc agg gga agt ctt cta aca tgc ggg gac gtg gag gaa aat ccc ggg ccc-3′编码的2A肽RAEGRGSLLTCGDVEENPGP）插入pTracer-EF/V6-His A载体（美国加利福尼亚州山景城CLONTECH），生成pMyc-2A，pKlf4-2A和pOct4-2A载体使用来自猪胚泡或胚胎组织的互补DNA和基因特异性引物：c-Myc公司-F类(千磅我-巴姆HI），5′-ggt acc gga tcc ATG CCC CTC AAC GTC AGC TTC A-3′，c-Myc公司-R（SpeI），5′-act agt GGG CCC GGG ATT TTC CTC CAC GTC CCC GCA TGT TAG AA-3′和c-Myc-2A-R；Klf4公司-F（SpeI），5′-自动液位计动作GCT GTC AGC GAC GCA CT-3′，Klf4型-R（右）(生态RI），5′-gaa ttc GGG CCC GGG ATT ttc CTC CAC GTC CCC GCA TGT TAG AA-3′和Klf4-2A-R(生态RI）：5′-gaa ttc GGG CCC GGG ATT ttc CTC CAC GTC CCC GCA TGT TAG AAG ACT TCC CCT CTC GGC TCT AAA ATG CCT CAT GTG TAA GCC-3′，用于pKlf4-2A；和，10月4日-F类(生态RI），5′-gaa ttc ATG GCG GGA CAC CTG GCT T-3′，10月4日-R（右）(生态RV），5′-gat atc GGG CCC GGG ATT TTC CTC CAC GTC CCC GCA TGT TAG AA-3′和Otc4-2A-R(生态RV），5′-gat atc GGG CCC GGG ATT TTC CTC CAC GTC CCC GCA TGT TAG AAG ACT CCT GCC CTC GGC TCT GTT TGA ATG CAT GGG GGA GCC-3′，用于pOct4-2A。使用基因特异性引物构建包含唯一终止密码子的pSox2载体：Sox2系统-F类(生态RV），5′-门ATG TAC AAC ATG GAG ACG GAG-3′，以及Sox2系统-R（右）(不是一） ，5′-gcg gcc gcT CAC ATG TGA GAGAGA GGC AGT-3′。为了构建pc-Myc（2A）-Klf4（2A生态将来自pKlf4-2A载体的RI限制性内切酶连接到pMyc-2A中以产生用生态RI和生态将来自pOct4-2A载体的RV限制性内切酶连接到pc-Myc（2A）-Klf4（2A生态RV和不是将I限制性内切酶连接到pc-Myc（2A）-Klf4（2A。这些cDNA-2A-cDNA-2A-cDNA-2A-cDNA-STOP构建物最终被插入巴姆HI和Xho公司生成pTet-CKOS质粒的pTet-GRTW的I位点(补充图。1安培)，一种逆转录病毒载体质粒，设计用于表达四种转录因子基因(c-Myc公司,Klf4公司,Sox2系统，以及2004年10月3日)在四环素启动子的控制下，该启动子是通过修改前面描述的pGWRT质粒构建的[19,20]. pCKOS质粒的详细信息见补充图1.
杂合和纯合转基因小鼠的产生
如前所述生产转基因小鼠[21]. 为了产生纯合转基因小鼠，将杂合的雄性和雌性B6D2F-1转基因小鼠交配。通过PCR证实了杂合和纯合转基因小鼠。使用的引物见补充表1（仅限在线）。
胶原蛋白复合物的提取及最佳浓度的测定
将组织切成小块，悬浮在30体积的含2%胃蛋白酶的0.5 mol/l乙酸中，在4℃下悬浮48 h。通过在10000×g下离心15 min，在4 C下收集提取液的上清液，以去除不溶性物质，然后使用0.7 mol/l NaCl盐析。通过离心收集所得沉淀物，将其溶解在0.5 mol/l乙酸中，并在4℃下用0.1 mol/l醋酸透析三天。胶原蛋白浓度由羟脯氨酸浓度间接测定，使用Bergman和Loxyler方法进行分析[22]. 为了确定合适的浓度，我们使用SA-β-半乳糖试验检测了不同浓度（10、25、50和100μg/ml）的胶原蛋白复合物对成年小鼠源性成纤维细胞增殖的影响。根据这些实验结果，我们确定50μg/ml是最合适的集中精力进行实验。
细胞增殖试验
在本研究中，我们在TREmCMV启动子和Oct3/4启动子（OG）控制下，从年轻（1个月龄；Y-成纤维细胞）和成年（1岁；A-成纤维纤维细胞）双转基因小鼠的皮肤组织中制备了小鼠成纤维细胞，其中含有四种Yamanaka因子基因。成纤维细胞在含有10%胎牛血清（Invitrogen）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM；Invitrogen，Grand Island，NY，USA）中培养。通过测量DNA合成过程中5′-溴-2′-脱氧尿苷（BrdU）的掺入量，采用比色免疫分析法测定细胞增殖，以量化细胞增殖。根据制造商（美国印第安纳波利斯罗氏应用科学公司）提供的方案进行BrdU分析。
衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-βgal）测定
SA-βgal活性的细胞化学检测需要在pH 6.0的缓冲液中培养固定的Y-、Ac-和A-成纤维细胞与显色βgal底物X-gal。在37°C下孵育12–16小时后，形成蓝色。染色后，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗细胞，并用明视野或相差显微镜观察。SA-βgal活性阳性细胞的比例通过计算总人口中蓝色细胞的数量来确定。
蛋白质印迹分析
用M-PER（Thermo Scientific，Pittsburg，PA，USA）辅以蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche）对处于半融合状态的细胞进行裂解。通过在8%SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离10微升细胞裂解物，然后转移到硝酸纤维素膜（Millipore，Billerica MA，USA）上。用Tris缓冲盐水吐温-20（TBST）清洗每个膜，该盐水由10 mM Tris–HCl（pH 7.6）、150 mM NaCl和0.05%吐温-20组成，用5%脱脂牛奶在室温下封闭1 h，并用以下主要抗体进行探测：胶原蛋白III（Abcam Ab7778）、胶原蛋白IV（Abcam-Ab6586）、胶原酶II（Abcam-Ab34712）、，胶原蛋白I（Abcam Ab34710）、整合素α2（Abcam112310）、Notch（Abcam-52301）、Bmi（Abcam/38295）、Gli（Abcan-ab49314）、PCNA（Abcam-ab19166）、p16（Abcar-ab51243）、cyclin D1（Abcam ab7958）、pRb（Abcam.ab47763）和β-actin（Abca-mab8227）。用抗小鼠IgG HRP（1:3000，Abcam）或抗兔IgG HRP检测信号（1:2000，Abcam）。使用增强化学发光试剂盒（美国宾夕法尼亚州匹兹堡热电科学公司）对色带进行可视化。
小鼠iPS细胞衍生
成纤维细胞在含有10%胎牛血清（Invitrogen）的DMEM中培养。每孔10万个细胞被镀在六孔板分层的MEF馈线上。48小时后，用补充了强力霉素（2µg/ml）的小鼠ESC培养基替换成纤维细胞培养基。无GFP+在缺乏Dox的培养物中观察到生长。绿色荧光粉+Dox诱导四周后对iPS细胞形成进行评分。代表性实验一式三份。
流式细胞术
将细胞进行胰蛋白酶化，在PBS中洗涤一次，然后在荧光活化细胞分选（FACS）缓冲液（PBS+5%FBS）中重新悬浮。100万个细胞在含有2 mg/ml碘化丙啶的PBA（含有0.1%BSA和0.01%叠氮化钠的磷酸盐缓冲盐溶液）中重新悬浮。使用流式细胞仪（BD Bioscience，Franklin Lakes，NJ，USA）进行流式细胞术分析。
实时定量逆转录聚合酶链式反应（RT-qPCR）
总mRNA是通过硫氰酸胍-苯酚-氯仿萃取（TRIzol，Qiagen，Hilden，Germany）分离出来的，并根据制造商的方案使用易逆转录酶（Qiangen）进行逆转录。使用2X easy SuperMix（Thermo）对不同基因进行PCR扩增。使用的引物见补充表1.
免疫荧光
室温下用4%甲醛在PBS中固定细胞20–30分钟。固定后，室温下用0.4%Triton X-100在PBS内处理细胞5分钟。在用10%FBS封闭30分钟后，用一级抗体在室温下4℃孵育细胞过夜，然后在PBS中清洗，并用相应的二级抗体在常温下孵育1小时。细胞核用4′6-二氨基-2-苯基吲哚（Invitrogen）染色。对于免疫荧光，使用的主要抗体如下：白蛋白（Abcam ab112971）、α-SMA（Abcam-ab5694）、NSE（Abcam-ab53025）、SSEA-1（Millipore FCMAB117P）、Oct4（Abcan-ab19857）、Sox2（Abcamab97957）、Nanog（Abca-mab80892）和c-myc（Abcas-ab32072）。二级抗体（Abcam）是罗丹明标记的驴抗兔IgG。
联合硫酸氢钠限制性分析和硫酸氢盐序列分析
根据制造商的方案和我们之前的报告，使用EZ DNA甲基化试剂盒（美国加利福尼亚州奥兰治市，Zymo Research），用硫酸氢钠处理基因组DNA，将所有未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶残基[23]. 使用该模板，我们用特异引物（PCNA的5′-TTATTTTGAAATTGTTTTTTTT-3′和5′-AAACTAACTACCAAATCCC-3′；Oct4的5′-GGTTTTAGAGAGGATGTGGTG-3′和5'-TCACACATACCATCCC-3′）通过PCR扩增了指示的差异甲基化区域（DMR）。PCR产物用指示的限制性内切酶（Aci 1）消化，该酶具有在原始未转化DNA中包含CpG的识别序列。使用ImageJ评估消化带的强度(http://rsbweb.nih.gov/ij/).
畸胎瘤形成
约1×106将重组细胞注射到5周龄免疫缺陷裸鼠的皮下或睾丸中，以评估畸胎瘤的形成。对于对照组，将小鼠ES细胞注射到一些小鼠体内。5-6周后，将畸胎瘤固定在多聚甲醛中，嵌入石蜡中并切片进行组织学检查。
统计分析
所有结果均以平均值±标准偏差（SD）表示。使用学生的t吨使用统计分析系统（SAS.9.13软件包）进行检验、单因素方差分析（ANOVA）、Bonferroni校正和Tukey检验。P值<0.05被认为是显著的。
结果
表达四环素诱导的干性因子基因的转基因小鼠的产生
pTet-CKOS，一种逆转录病毒载体质粒，用于表达干细胞因子CKOS(c-Myc公司,Klf4公司,2004年10月3日，以及Sox2）基因受四环素启动子基因，通过克隆的多个步骤构建，如pTet-CKOS载体包含一个带有2A肽序列的多顺反子盒CKOS，以产生不同的多肽。设计逆转录病毒载体，在四环素诱导启动子和CMV公司启动子基因。CKOS的转录由四环素反应元件序列（TREmCMV）中的最小巨细胞病毒启动子驱动。使用机械手将pTet-CKOS载体注入原核。共有280个微注射的双细胞胚胎被转移到9只受体小鼠体内。其中，5只受体发育到足月，自然分娩了42只小鼠。为了确认这些是转基因小鼠，我们设计了PCR引物来扩增和测序每个基因侧翼的基因组DNACKOS公司基因。结果表明，42只小鼠中有8只是转基因小鼠(). 八创始人小鼠表现出正常的表型，因为在没有反式激活因子表达的情况下，转基因不活跃。此外，所有转基因品系都能正常生产幼崽。如所示Dox诱导后，来自转基因小鼠的成纤维细胞显示Yamanaka干细胞因子的表达增加，表明载体工作良好。
构建逆转录病毒载体以产生转基因小鼠。（A） 设计逆转录病毒载体，通过四环素介导的诱导表达四种干细胞因子。有关更多详细信息，请参阅方法部分。（B） 用四因子PCR确认转基因小鼠。红色虚线表示转基因小鼠。（C） 用四环素介导的诱导作用对对照组和转基因小鼠来源的成纤维细胞中的四种干细胞因子进行Western blotting分析。通过添加强力霉素分离和培养成纤维细胞10天，然后使用每种抗体进行Western blot分析。
小鼠尾源性总胶原蛋白复合物促进细胞增殖并清除细胞衰老效应物
我们从年轻和/或成年小鼠的尾部分离出总胶原蛋白复合物。使用Sircol胶原蛋白分析评估的总胶原蛋白水平[22]幼龄小鼠全尾为11.7 mg/ml，老龄小鼠尾为0.96 mg/ml。由于这两种制剂对成年小鼠成纤维细胞的再生能力没有差异，因此我们使用来自幼年小鼠尾部的胶原蛋白进行进一步研究(补充图2A：仅在线）。在我们制备胶原蛋白复合物的过程中，四种胶原蛋白成分的含量从I型胶原蛋白的30%到IV型胶原蛋白含量的一半不等(补充图2B和C).
小鼠成纤维细胞由年轻（1个月大；Y成纤维细胞）和成年（1岁；A成纤维细胞；双转基因小鼠制备而成。这些转基因小鼠衍生细胞含有四个转录因子基因，受TREmCMV公司发起人和绿色荧光蛋白受…控制的基因2004年10月3日启动子（OG）基因。在培养皿上没有胶原复合物涂层（Y和A成纤维细胞）或存在胶原复合物的情况下培养来自幼年和成年动物的细胞。
为了评估成纤维细胞群中的细胞衰老，我们对SA-βgal进行染色，这是衰老的常见标志(). A成纤维细胞培养物中SA-βgal阳性细胞较多（32.1±1.75%）与。8.98±1.06%）比Y和Ac成纤维细胞（4.6±0.72%）与. 8.98 ± 1.06%). 为了确定SA-βgal阳性细胞数量的下降是否与细胞周期阻滞同时发生，我们测量了Y和A成纤维细胞的增殖指数。BrdU掺入试验显示，Ac成纤维细胞的增殖指数（2.7±0.14）高于A成纤维细胞（1.8±0.08）(). 总之，这些实验表明，作为细胞外基质存在的胶原蛋白复合物可以调节成纤维细胞的生长。
对胶原复合物衰老和凋亡的影响。A） Y、Ac和A-成纤维细胞的衰老相关β-半乳糖苷酶染色（蓝色）。放大倍数，×200。B） 细胞增殖试验。数据为三次试验的平均值±SEM，p值<0.05。C） 根据胶原类型对A型成纤维细胞进行衰老相关β-半乳糖苷酶染色。D） 通过FACS分析测定凋亡的Y-、Ac-和A-成纤维细胞。（向下）数据来自三个独立实验（平均值±SD；下面板；P<0.05）。标有不同字母（a–c）的组之间存在显著差异，P<0.05。
为了确定防止细胞衰老的胶原蛋白复合物的成分，我们检测了与不同类型胶原蛋白培养的A-成纤维细胞中的SA-β-半乳糖苷酶阳性。将商用的涂有I、II、III和IV型胶原蛋白的盘子与涂有胶原蛋白复合物的盘子进行比较（Ac，总量）(). 每种类型的胶原蛋白都显著减少了A型成纤维细胞中Sa-βgal阳性细胞的数量，胶原蛋白复合物（总量：8.9±1.06%）和I型胶原蛋白制剂（10.96±1.12%）的效力高于II型和III型胶原蛋白制品（24.5±1.75与。27.4 ± 0.72; P<0.05）。这表明胶原蛋白复合体可以重置A-成纤维细胞的再生。
α2β1整合素依赖的Bmi-1通路诱导用胶原复合物治疗的成纤维细胞再生而不去分化
为了确定胶原复合物处理是否阻断A成纤维细胞的凋亡，通过流式细胞术分析了Y、Ac和A成纤维细胞的凋亡。使用Annexin V-FITC染色进行流式细胞术分析表明在体外培养A-成纤维细胞使凋亡细胞的百分比显著增加（19.9±3.2%）(). 相反，在成纤维细胞中观察到Annexin V阳性细胞的频率显著降低（11.9±2.8%）。用胶原复合物培养5天后，成纤维细胞存活率达到Y成纤维细胞水平。
为了研究总胶原复合物复兴成纤维细胞的分子机制，通过Western blot分析检测整合素途径的蛋白表达水平，特别是整合素α2、Notch、Gli-1和Bmi-1(). Ac成纤维细胞的整合素α2、Notch、Gli-1和Bmi-1水平高于A成纤维细胞，这些增加的水平与Y成纤维细胞相匹配。同样，在胶原复合物培养的第5天，Ac成纤维细胞中cyclinD1、ppRB和PCNA蛋白的水平高于A成纤维细胞(). 胶原复合物治疗五天后，成纤维细胞表达第15页,第16页，以及第21页与Y型成纤维细胞相似。值得注意的是，第19页和第53页与Y成纤维细胞相比，mRNA的表达显著增加，但与A成纤维细胞相比较，mRNA表达显著降低。这与胶原蛋白复合物通过抑制A-成纤维细胞中p16蛋白水平诱导细胞周期蛋白D1、PCNA和ppRB蛋白表达增加相一致。虽然PCNA公司在胶原复合物存在下培养5天的老年成纤维细胞中，基因启动子区的低甲基化程度高于Y型成纤维细胞，两者的蛋白水平相似。(补充图3B：仅在线）。因此，Ac-fibroblast增殖受表观遗传修饰调控。总之，成人年龄衍生体细胞的再生可能部分通过α2β1整合素依赖的Bmi-1途径进行调节().
胶原复合物培养成人成纤维细胞中α2β1整合素依赖性Bmi-1调控分析。（A） Y、Ac和A-成纤维细胞的Western blot分析。（B） Y、Ac和A-成纤维细胞中细胞周期调节蛋白的Western blot分析。（C） Y-、Ac-和A-成纤维细胞中Ink4/Arf抑癌基因表达的RT-qPCR分析。RT-qPCR标准化为GAPDH水平。标有不同字母（a–c）的组之间存在显著差异，P<0.05。（D） 胶原复合物涂层培养皿上老年成纤维细胞的再生模式。
胶原复合物治疗小鼠成纤维细胞生成的iPS细胞因Ink4a/Arf位点基因表达低而高效
我们使用了含有四种多潜能相关因子的纯合转基因小鼠10月3/4-GFP避免基因转染变异。为了评估Y-、Ac-和A-成纤维细胞的脱分化能力，将细胞在含血清的培养基中培养1、3和5天，然后分析其基因的表达情况墨水4a/Arf位点，如CDK抑制剂，第15页,第16页墨水4a,第19页阿尔夫，以及第21页据报道，它们会导致造血干细胞和神经干细胞老化[24,25]，使用定量实时RT-qPCR分析。mRNA表达第15页（8.6±2.4和8.2±3.6），第16页墨水4a（6.7±2.4和6.7±2.1），第19页阿尔夫（9.4±2.1和8.08±2.1），第21页（13.1±1.8和13.2±2.3），以及第53页Ac和Y成纤维细胞的（11.1±2.0和10.3±2.3）低于A成纤维细胞(第15页, 15.16 ± 2.4;第16页墨水4a，11.47±2.4；第19页阿尔夫, 11.9 ± 1.6;第21页, 16.4 ± 1.6; 和第53页, 15.5 ± 0.83) (). 在本研究中，阿克特（3.7±0.12和4.14±0.55），高级工程师（5.2±0.12和5.67±0.07），地图2K1（4.73±0.25和4.5±0.45），以及mTOR公司Ac-和Y-成纤维细胞中（7.82±0.19和8.16±0.23）的表达显著高于A-成纤维纤维细胞（分别为1.7±0.17、3.17±0.43、2.29±0.22和6.37±0.07）(). 此外，流式细胞术分析表明，成年小鼠源性成纤维细胞（Ac-fibroblast）经胶原处理后，p-Akt和p-mTOR的表达高于A-成纤维细胞(). 考虑到Akt通过PI3K/Akt-雷帕霉素哺乳动物靶点（mTOR）途径促进细胞周期蛋白D1和c-Myc的表达，并抑制第15页,第16页,第19页和第21页这些发现表明，Ink4a/Arf基因座的基因下调可能是由PI3K/Akt过度表达引起的。
AKT/mTOR相关基因表达的实时RT-qPCR和流式细胞术分析。A） Y、Ac和A衍生成纤维细胞中Akt、Src、Map2K1和mROR mRNA的表达。使用GAPDH看家基因对基因表达进行标准化。B） 使用流式细胞术比较Y-、Ac-和A-来源的成纤维细胞中p-Akt和p-mTOR的表达。
还对培养物中的自噬进行了评估。为了规范RT-qPCR反应效率，GAPDH公司被用作内部标准。正常化后，Ac成纤维细胞中自噬特异性mRNA的浓度与Y成纤维细胞的浓度相等，但与A成纤维细胞相比显著增加(补充图4：仅在线）。这些观察结果表明，防止衰老细胞的细胞衰老与上调自噬相关基因的表达密切相关。
接下来，我们研究了Dox对Y、Ac和A成纤维细胞重新编程的动力学。在未经Dox治疗或治疗不到10天的平板上未检测到菌落（数据未显示）。在首次添加Dox后的20或25天，挑选并扩大类似mESCs的菌落，即那些具有高核质比、显著核仁和明确的相界的菌落。重编程效率定义为每10000个Y、Ac和A-成纤维细胞接种的GFP阳性菌落数。Y和Ac成纤维细胞的重编程效率（1.01±0.05%和0.82±0.05%）显著高于A成纤维细胞（0.22±0.02%）。
多能性标记分析显示外源性10月4日,Sox2系统,Klf4公司，以及c-Myc公司Y-、A-和Ac-iPS细胞中的基因相似。在Y-、A-和Ac-iPS细胞中也检测到类似水平的其他ES标记物（Nanog、Utf1、Rex1、Fbx15、Dax、e-Ras和Cripto）()与Oct3/4、Klf4、Sox2、c-Myc、Nanog和SSEA-1抗体染色的(). 亚硫酸氢盐基因组测序分析揭示了Y-、Ac-和A-iPS细胞之间的进一步相似性。的启动子区域2004年10月3日iPS细胞中的基因高度去甲基化（1.9%；2/105），而2004年10月3日成纤维细胞的启动子基因区域高度甲基化（75.7%；78/103）(补充图3C).
iPS细胞的生成。A） 使用c-myc、Nanog、Oct3/4、Sox2和SSEA-1等多能性标记进行免疫染色分析。细胞核用DAPI染色。B） 多能性标记表达。底漆用于10月4日,Sox2系统,Klf4公司,c-Myc公司,纳克,超1,雷克斯1,Fbx15型,Dax公司,电子Ras，以及克里普托特异性检测mRNA转录物。
我们对Y-、Ac-和A-iPS细胞进行自发分化，以确定它们的多能性和/或去分化为完全再生细胞的能力。通过在低附着板上的分化培养基中培养三个iPS细胞来进行类胚体（EB）的形成。我们通过RT-PCR分析或在体外微分(). 接下来，我们将iPS细胞注射到裸鼠睾丸中。由此产生的畸胎瘤包含无组织和混合类型的组织，横纹肌（中胚层）组织随机分布，形成许多岛屿(). 它们包括分泌上皮（即内衬杯状细胞的上皮、内胚层）和神经上皮（外胚层），表明iPS细胞是功能性多能干细胞。
iPS细胞的分化在体外和体内.A）三个胚层（内胚层）分化标记的RT-PCR分析、GATA4和α-甲胎蛋白; 中胚层，短梗和GATA2协议; 和外胚层，内斯廷和βIII-管蛋白). 值得注意的是，蒸馏水中BMP4 RT-PCR产物的微弱信号可能是由电泳过程中的流动引起的，该流动是由a衍生iPS细胞产生的RT-PCR产品引起的。Y、 Ac、A和DW分别表示Y、Ac、A-衍生iPS细胞和蒸馏水。B） 期间典型iPS细胞系的免疫细胞化学分析在体外利用三种生殖层标记（外胚层，微管蛋白；中胚层，短梗；内胚层，HNF3b）进行分化。C） 畸胎瘤形成分析。组织切片用H&E染色和免疫组织化学检查。内胚层衍生物，上皮细胞表达高水平的β-catenin。中胚层衍生物以横纹肌和平滑肌为例（中部）。外胚层谱系的组织，包括神经上皮，表达胶质纤维酸性蛋白（GFAP）。
讨论
本研究提供了证据表明，从幼年小鼠尾部制备的具有生物活性的胶原蛋白复合物可以减少来自老龄小鼠的成纤维细胞培养物中的细胞衰老。这是通过测量SA-β-半乳糖阳性的频率来证明的，这是衰老的标志。与Ac或Y成纤维细胞制剂相比，A成纤维细胞制品具有更多的SA-βgal阳性细胞(). 如BrdU掺入试验所测，胶原蛋白复合物也增强了增殖能力。成纤维细胞的增殖指数高于成纤维细胞()这与之前的研究结果一致[26].
为了深入了解Ac成纤维细胞再生的机制，我们检测了整合素α2和整合素相关蛋白Notch、Gli-1和Bmi-1的表达，它们位于Bmi-1通路中α2β1整合素的下游。成纤维细胞高度表达这些蛋白(). 此外，总胶原蛋白复合物制剂和商业I型胶原蛋白单独诱导了类似的效果(). 先前的研究报告称，在I型胶原上培养的胚胎干细胞（ESCs）的增殖能力依赖于Notch信号[27,28,29,30]. 本研究与之前的研究一样[26]，表明胶原蛋白复合体中的I型胶原蛋白挽救了A-成纤维细胞的增殖能力。
最近的一项研究[31]据报道，抑制自噬会增加细胞凋亡率，这是p53对外源性Yamanaka转录因子过度表达的另一种调节反应，可显著降低重编程效率。如果在细胞衰老过程中诱导了自噬，那么在细胞重新编程为iPS细胞的过程中，自噬将成为一个关键的障碍。然而，胶原蛋白复合物引起的自噬是否能显著增强iPS细胞的生成尚不清楚。如所示补充图4自噬特异性mRNA在Ac和Y成纤维细胞中的表达显著高于A成纤维细胞。此外，我们的结果表明，A成纤维细胞自噬特异性mRNA的减少与整合素α2依赖性Gli-1通路的失活一致。我们发现基因的表达Ink4a/Arf位点（CDK抑制剂），例如第15页,第16页墨水4a,第19页阿尔夫和第21页成纤维细胞中的，低于A成纤维细胞(). 如所示,阿克特Ac成纤维细胞的基因表达高于A成纤维细胞。由于阿克特基因过度表达，地图2K1,高级工程师，以及mTOR公司基因表达，位于阿克特基因，在Ac成纤维细胞中显著高于A成纤维细胞。这一发现表明阿克特也促进了周期D1和c-Myc公司通过PI3K/Akt-哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR）通路，抑制第15页,第16页,第19页和第21页.第16页墨水4a蛋白质通过抑制CDK4/6细胞周期蛋白复合物和防止pRB磷酸化来抑制细胞周期进程，而p19阿尔夫蛋白质在p53通路的调节中起重要作用[32]. 众所周知，随着年龄的增长，细胞衰老的增加与生理衰老有关，其特征是不可逆的细胞周期停滞，如p53/p21和p16/pRb途径的激活[33]. 先前的研究表明，Ink4/Arf基因座的遗传抑制对iPS细胞生成效率有着深远的积极影响，增加了新出现的菌落数量[34]. 此外，细胞周期相关的基因启动子区域，如PCNA，与之相比，在成纤维细胞中广泛去甲基化A-成纤维细胞(补充图2). 综上所述，通过胶原蛋白复合物治疗，成年动物成纤维细胞的再生可能是由以下原因引起的：1）通过α2β1整合素依赖的Bmi-1途径激活细胞周期促进基因，2）细胞周期促进因子（如PCNA基因启动子）去甲基化，3）重置为Y成纤维细胞状态的A成纤维细胞数量增加，以及4）阻止A成纤维纤维细胞的凋亡。
在这项研究中，Y型和Ac型成纤维细胞的诱导多能效是原始研究的40-50倍，这些研究结合了c-Myc公司,Klf-4型,Sox-2，以及2004年10月3日基因[2,35]. 此外，iPS菌落的发育效率与四因子转基因小鼠的原始数据相当[36]. 已经发表了一系列提高重编程效率的方法，包括：1）使用改变染色质结构的化学物质，如丙戊酸[37]; 2） 5-氮杂胞苷的使用[38]; 3） BIX和BayK的组合使用[39]; 4） 使用信号通路抑制剂，如TGF-β抑制剂[40]和一个组合MEK和GSK3抑制剂[39,41]; 5） 衰老拮抗剂的使用，如p53抑制剂[42,43]; 6） 维生素C的使用[44]; 7） 缺氧的使用[45]和8）使用Cdh1（E-cadherin）[46]. 在这项研究中，我们证明，与A成纤维细胞相比，在胶原复合物涂层板上连续生长五代以上的A成纤维纤维细胞更年轻，扩张速度更快，自发细胞死亡更低().
胶原蛋白是最丰富的细胞外基质蛋白，以前被认为在维持茎干中起关键作用。内源性胶原蛋白的抑制导致ESC特性的逐渐丧失[16]. 另外，另一个研究小组报告称，溶解I型胶原可以促进大鼠骨髓干细胞的分化[47]. 最近的一项研究表明，胶原受体α2β1整合素调节人类结直肠癌细胞的干细胞命运[48]I型胶原抑制分化并促进人类结直肠癌细胞和mESCs中干细胞样表型的维持[18]. 总之，胶原蛋白复合物可以刺激A型成纤维细胞的增殖，抑制细胞死亡和生长停滞。此外，CDK抑制剂的基因表达，如第16页墨水4a,第19页阿尔夫，以及第21页CIPI公司，在成纤维细胞中显著下调。由于这些修饰，Y和Ac成纤维细胞的诱导多能干（iPS）细胞效率显著高于a成纤维细胞，这表明胶原蛋白复合物处理可能为高效生产iPS细胞提供了一种替代和安全的来源。
致谢
这项工作得到了大韩民国农村发展管理局（RDA）的Woo Jang-Choon项目（PJ007849）的支持。
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