母亲肥胖导致子代脂肪肝规划中的氧化应激和脂质稳态改变

摘要

代谢的流行在过去几十年里，疾病急剧增加，尤其是在发达国家和发展中国家。生活方式、饮食和体力活动的改变虽然促成了这种流行病，但并不能解释发病率的迅速增加。许多流行病学研究都强调了出生前和出生后营养暴露在增加晚年代谢疾病风险方面的重要性(2,15). 随着全球育龄期超重和肥胖女性人数的增加，肥胖的周期性、跨代传播令人担忧。已经建立了母亲肥胖模型，以了解导致这些后代肥胖的机制，这可能导致干预、治疗或预防。

肥胖的发展往往会导致进一步的代谢并发症，包括胰岛素抵抗和心血管疾病，统称为代谢综合征。代谢综合征的肝脏表现(20)非酒精性脂肪肝（NAFLD）是西半球最常见的肝病，患病率高达30%(19). 在几种母亲饮食诱导肥胖的动物模型中观察到成年后代（包括NAFLD）代谢综合征的特征(4,23,28).

已经提出了许多NAFLD的致病机制；然而，一个明确而一致的病因模型尚待阐明。肝脏脂质沉积主要归因于脂质稳态失调，这可能是由于脂肪组织脂肪酸输送增加、通过从头开始的脂肪生成增加脂肪酸合成、线粒体β-氧化减少或这些因素的综合作用所致(25). 在不同的代谢状态下，每个因素的相对重要性可能不同(9,10). NAFLD也与胰岛素抵抗有关，胰岛素抵抗被认为是其发病机制的核心(20). 然而，由于肥胖是胰岛素抵抗的有力预测因素，它混淆了对潜在机制的研究。

氧化应激被认为是胰岛素抵抗和肝脂肪变性发病的可能触发因素(8,29). 研究表明，氧化应激标记物与肥胖、胰岛素抵抗和糖尿病之间通过胰岛素信号的干扰有着广泛的联系(13,26,39). 在胰岛素抵抗发生之前，已经观察到胰岛素反应组织（肝脏和脂肪组织）中活性氧（ROS）生成和氧化应激途径的上调(22)可以通过饮食限制或补充抗氧化剂来抑制(5,7,16). 此外，据报道，肥胖糖尿病孕妇胎盘中存在氧化应激标记物和炎症基因表达(30)这表明氧化应激在为后代提供异常发育环境中起着作用，这可能会导致不利的代谢影响。

在本研究中，我们旨在研究饮食诱导肥胖小鼠后代中NAFLD发病的机制。迄今为止，研究母亲营养过剩对后代代谢疾病影响的动物研究已经对3个月及以上的后代进行了研究。然而，到了3个月大的时候，体重已经发生了变化，肥胖母鼠的后代比对照组更重更胖，从而混淆了潜在机制的研究(4,24,28). 因此，我们选择研究子代肥胖差异前的一个时间点——8周龄，以研究母亲饮食诱导肥胖导致肝脂肪变性的病因。这让我们更好地了解了NAFLD发病机制中多种机制因素之间的相互作用。鉴于新生脂肪生成在促进肝脏脂质沉积方面的重要性以及动物模型中氧化应激在胰岛素抵抗和肝脂肪变性发病中的意义，我们也在我们的营养规划模型中研究了这些促进NAFLD发病的机制。

材料和方法

结果

后代表型。

母亲的饮食不会影响孩子的体重出生后第3天（对照组1.76±0.06 g vs.Mat-Ob 1.63±0.12 g，n个=11）或产仔数（对照组7.6±0.3 vs.Mat-Ob 6.0±0.7，n个= 11). 8周龄时，对照组和Mat-Ob组后代的体重、身体成分和肝脏重量没有显著差异(表2). 断奶至第8周两个实验组之间相似（对照组107.6±4.0 g vs.Mat-Ob 111.8±3.4 g，n个=8和n个分别=7）。在这个年龄段，两个后代组的葡萄糖、甘油三酯和FFA水平没有显著差异。与对照组相比，Mat-Ob后代的空腹总胆固醇和HDL胆固醇显著降低(P（P）< 0.05) (表3). 然而，与对照组相比，Mat-Ob组的空腹胰岛素水平显著升高(图1A类,P（P）< 0.05).

表2。

8周龄雌性的身体成分

	控制	Mat-Ob公司
总体重，g	20.85 ± 0.98	19.16 ± 0.78
脂肪质量，g	3.24 ± 0.17	3.20 ± 0.26
精益质量，g	15.04 ± 0.12	14.77 ± 0.61
骨量密度，g/cm2	0.04 ± 0.00	0.06 ± 0.02
%脂肪质量	17.74±0.63	17.83 ± 0.78
%精益质量	83.03 ± 0.69	82.08 ± 0.68
肝脏重量，g	1.12 ± 0.04	0.98 ± 0.06
%肝脏重量	5.37 ± 0.04	4.90 ± 0.08

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数据以平均值±SE表示；n个=每组6人。Mat Ob，母亲肥胖。

表3。

8周龄女性的血清特征

	控制	Mat-Ob公司
总胆固醇，mmol/l	2.55 ± 0.12	1.93 ± 0.07*
高密度脂蛋白胆固醇，mmol/l	0.99 ± 0.04	0.85 ± 0.04*
低密度脂蛋白胆固醇，mmol/l	0.94 ± 0.07	0.76 ± 0.06
甘油三酯，mmol/l	0.75 ± 0.05	0.70 ± 0.11
游离脂肪酸（毫摩尔/升）	1.03 ± 0.08	0.87 ± 0.05
葡萄糖（喂食），mmol/l	9.5 ± 1.1	10.2 ± 1.1
葡萄糖（禁食），mmol/l	6.7 ± 0.3	5.9 ± 0.6

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数据以平均值±SE表示；n个=每组6个，

^*P（P）< 0.05. 高密度脂蛋白；低密度脂蛋白；游离脂肪酸。

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图1。

胰岛素和氧化应激标记物。A类：空腹血清胰岛素浓度。B类：血清8-羟基-2-脱氧鸟苷（8-OH-dG）浓度。C类：肝脏3-硝基酪氨酸（3NT）浓度。天：肝脏4-羟基壬醛（4HNE）浓度。E类：肝肿瘤坏死因子-α（TNF-α）蛋白水平。数据以控制（白色条）和母亲肥胖（Mat-Ob）（灰色条）后代的平均值±SE表示。n个=每组6-8人*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01.

肝脏胰岛素信号。

我们研究了高胰岛素血症是否与肝脏胰岛素信号蛋白表达受损有关。然而，在8周龄母体肥胖对子代肝脏关键胰岛素信号分子的反应中没有发现差异(表4).

表4。

8周龄女性肝组织中胰岛素信号蛋白的表达

表达式，%平均值控制	控制	Mat-Ob公司
红外β	100 ± 3	102 ± 4
IRS1系统	100 ± 15	120 ± 15
p-IRS1（序列-307）	100 ± 16	109 ± 15
阿克特1	100 ± 10	91 ± 11
Akt2公司	100 ± 4	99 ± 5
p-Akt（丝氨酸-473）	100 ± 23	95 ± 30
p110β	100 ± 18	110 ± 11
p85α	100±4	92 ± 7
PKCζ	100 ± 4	103 ± 5

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数据以平均值±SE表示；n个=每组6人。

氧化应激损伤。

血清8-OH-dG和肝脏3NT分别作为DNA和蛋白质氧化损伤的标记物，在Mat-Ob后代中显著增加(图1,B类和C类,P（P）<0.01和P（P）分别<0.05）。肝脏4HNE是脂质氧化的标志物，在这个年龄段，两个实验组之间保持不变(图1天). 与对照组相比，Mat-Ob子代的肝脏TNF-α显著升高(图1E类,P（P）< 0.05).

氧化稳态。

参与氧化稳态的蛋白质被研究为氧化应激增加的可能因素。与对照组相比，8周龄Mat-Ob雌性大鼠的肝脏NADPH氧化酶4（NOX4）显著降低(图2A类,P（P）< 0.01). 抗氧化酶谷胱甘肽过氧化物酶-1（GPx1）也显著降低(P（P）<0.001），过氧化氢酶水平显著增加(P（P）与对照组相比，Mat-Ob组<0.05）(图2B类). 在研究的其他蛋白质中未观察到显著差异。

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图2。

氧化稳态。A类：氧化和硝化酶的蛋白质水平。内皮一氧化氮合酶；诱导型一氧化氮合酶；XO，黄嘌呤氧化酶；NOX4、NADPH氧化酶4。B类：抗氧化酶的蛋白质水平。锰超氧化物歧化酶；GPx1，谷胱甘肽过氧化物酶-1；GR，谷胱甘肽还原酶；铜锌超氧化物歧化酶；HO1、血红素加氧酶-1。C类：线粒体复合体活性。天：线粒体酶的蛋白质水平。COX4，细胞色素-c（c）氧化酶复合物IV；塞浦路斯c（c），细胞色素c（c）; 谷氨酸脱氢酶。数据以控制（白色条）和Mat-Ob（灰色条）后代的平均值±SE表示。n个=每组6-8个*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001.

线粒体氧化呼吸解偶联也可能是自由基的来源。与对照组相比，Mat-Ob后代的肝线粒体复合物I和II活性显著增加(图2C类,P（P）<0.001和P（P）分别<0.05）。虽然复合物IV的表达和活性没有不同，但我们观察到细胞色素的表达显著降低c（c）与对照组相比，饮食诱导肥胖母鼠后代中复杂的III-IV电子穿梭(图2天,P（P）< 0.01). 谷氨酸脱氢酶（GDH）是完整线粒体的标志物，在该组中升高(图2天,P（P）< 0.05).

肝脏脂质代谢。

我们测量了参与脂肪生成和脂肪分解的蛋白质水平，以确定肝脏脂质稳态的可能变化。PPARγ显著上调(P（P）<0.05），乙酰辅酶A羧化酶（ACC）蛋白水平增加了49%(P（P）= 0.08) (图3A类)与对照组相比，Mat-Ob子代的肝脏甘油三酯脂肪酶（ATGL）显著降低(P（P）< 0.05) (图3B类). 在研究的其他蛋白质中没有发现显著差异。根据脂质分析和组织学脂质含量分析，与8周龄的对照组相比，脂质稳态的这些变化与Mat-Ob肝脏中总脂质含量的增加有关(P（P）分别<0.05和0.001，图3,C–E类).

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图3。

肝脏脂质代谢。A类：脂肪生成酶的蛋白质水平。ACC，乙酰辅酶A羧化酶；丙酮酸脱氢酶；过氧化物酶体增殖物激活物受体γ；脂肪酸合成酶；SREBP1，固醇调节元件结合蛋白1。B类：脂解酶的蛋白质水平。过氧化物酶体增殖物激活物受体α；脂蛋白脂肪酶；脂肪甘油三酯脂肪酶；5-LO，5-脂氧合酶；CYP4A14，细胞色素P（P）-450 4A14。C类：从100 mg肝组织中测定的总肝脏脂质含量。天：具有代表性的Oil-red-O（ORO）和苏木精-伊红（H&E）组织学图像。比例尺为50μm。E类：脂滴染色定量。数据以控制（白色条）和Mat-Ob（灰色条）后代的平均值±SE表示。n个=每组6-8人*P（P）<0.05时***P（P）< 0.001.

肝糖原代谢。

与对照组相比，Mat-Ob组的总禁食肝糖原含量显著降低(图4A类,P（P）< 0.05). 糖原合成酶激酶-3（GSK-3）α和β蛋白水平在两个实验组之间相似，其磷酸化水平也没有差异(图4B类). 与对照组相比，Mat-Ob组中磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（PEPCK）和葡萄糖-6-磷酸酶（G6Pase）的表达水平降低，这是关键的葡萄糖异生酶(图4C类,P（P）分别为0.08和0.07）。

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图4。

肝糖原代谢。A类：肝糖原含量。B类：总糖原合成酶激酶-3亚型的蛋白质水平及其磷酸化水平。C类：糖异生酶的蛋白质水平。磷酸烯醇丙酮酸羧激酶；G6Pase，葡萄糖-6磷酸酶。数据以控制（白色条）和Mat-Ob（灰色条）后代的平均值±SE表示。n个=每组6-8人*P（P）< 0.05.

肝脏蛋白质含量。

与对照组相比，雌性Mat-Ob子代的肝脏总蛋白含量略有下降，但具有统计学意义（对照组为0.28±0.01 mg，Mat-Ob0.25±0.00 mg蛋白/mg组织，n个=6和n个分别=5，P（P）< 0.05).

讨论

怀孕期间肥胖在发达国家和发展中国家都是一个日益严重的问题。现在很明显，孕期母亲肥胖会增加后代患代谢性疾病的风险，包括糖耐量受损、胰岛素抵抗、肥胖和NAFLD。这种编程背后的机制尚不清楚，这些病理学之间的密切关系使得很难解剖出原发性代谢缺陷。因此，我们合理地认为，为了确定NAFLD的编程机制，我们需要在糖耐量异常和肥胖发生之前的早期研究后代。

我们发现，在8周龄时，对照组和Mat-Ob组的后代在体重或肥胖方面没有差异。因此，任何代谢差异都可以归因于代谢组织的差异编程。肥胖发病前Mat-Ob后代的高胰岛素血症表明他们在这个年龄段是胰岛素抵抗的。这可能是由脂肪组织中的胰岛素抵抗引起的(11)，因为在这个年龄段测量的关键胰岛素信号蛋白在肝脏的表达没有差异，表明肝脏对胰岛素敏感。Mat-Ob后代循环胆固醇水平降低的意义尚不清楚。然而，几乎没有证据表明血清胆固醇水平与肝脏脂肪沉积之间存在联系。一项研究报告了2型糖尿病患者肝脂肪变性与HDL胆固醇水平降低之间的关系(37)而另一项研究报告称，在纠正胰岛素抵抗后，这种关联变得不显著(17)这表明胰岛素抵抗是肝脏脂质沉积的一个重要因素。

我们认为，外周胰岛素抵抗导致Mat-Ob子代高胰岛素血症，促进肝脏基因（包括PPARγ）的转录上调，以促进肝脏从头开始的脂肪生成。在胰岛素治疗刺激PPARγ活性的情况下，先前已证明PPARγ活动的激素调节(40,41)此外，它的过度表达导致了肝脏脂肪变性(42). 除了刺激脂肪生成外，胰岛素还通过抑制脂肪分解促进脂质积累。在饮食诱导的肥胖母鼠的后代中，启动脂质水解第一步的酶ATGL的表达减少可能有助于肝脏脂质积累(14). 据报道，胰岛素通过mTOR途径下调哺乳动物脂肪细胞中ATGL的转录(6). 因此，饮食诱导肥胖母鼠后代早期出现外周胰岛素抵抗可能是通过调节正常条件下脂肪组织中主要表达的基因而导致肝甘油三酯积聚的驱动因素。

暴露于母亲肥胖的后代的肝脏胰岛素敏感性在12周龄时下降，此时胰岛素信号通路的关键成分（包括胰岛素受体和IRS1）的表达降低(1,21,28); 这可能会进一步加剧脂质积聚和肝脏损伤。由于我们在循环和肝脏中观察到氧化损伤标志物升高，我们进一步研究了氧化失调是否会导致NAFLD和胰岛素抵抗的后期发展；这证实了通过减少GPx1的表达，肝脏抗氧化能力受损。已观察到HFD喂养后的氧化应激先于胰岛素抵抗(22)可以通过在啮齿类动物中补充抗氧化剂来阻止其发展(5,7,16). 在编程模型中早在囊胚阶段就观察到炎症(34). 因此，本研究中观察到的肝脏TNF-α升高为氧化应激增强状态提供了进一步证据。在宫内暴露于HFD的猕猴胎肝中也报告了氧化损伤标记物8-OH-dG和4HNE增加(23).

值得注意的是，动物模型在饮食组成、时间和暴露时间方面的差异混淆了单一机械编程模型的发展。迄今为止，大多数关于母亲营养过剩对肝脏影响的研究都使用了HFD。在这项研究中，母鼠被喂食高脂肪、高糖的食物，以更好地反映西方产肥环境。之前已经注意到，喂食HFD和“自助餐厅”西方饮食的啮齿动物的代谢反应存在差异，尽管这两种饮食挑战都会导致肥胖和肝脂肪变性，但食堂喂养的大鼠脂肪和肝组织炎症增加(32). 因此，不能忽视来自不同饮食挑战的编程机制的特殊性，需要进一步研究。尽管如此，我们目前的研究结果与氧化应激相一致，氧化应激是饮食诱导肥胖母亲的后代易患NAFLD的早期机制。目前的研究结果表明，母亲高脂肪、高糖喂养导致的慢性氧化损伤是一种程序性反应，与肥胖增加无关，当与肝脏脂质沉积相结合时，可导致胰岛素抵抗、进行性肝脂肪变性和肝损伤。

在我们的母亲饮食诱导肥胖模型中，线粒体功能障碍可能是活性氧的来源之一。而Bruce等人(三)以前曾报道过HFD喂养的母鼠15周龄后代的肝脏线粒体复合体I、II/III和IV活性降低，在8周龄时，我们观察到Mat-Ob后代复合体I和II活性随着下游电子载体细胞色素表达的减少而增加c（c）。这种跨电子传输链的活性解耦可能会导致电子泄漏和自由基生成增加。此外，Mat-Ob子代肝线粒体中大量表达的谷氨酸脱氢酶的表达增加(27). 母亲饮食诱导的肥胖导致的肝脏升高可能意味着功能受损或肝细胞坏死导致的代偿性线粒体增殖（尽管本研究未对后者进行研究）。因此，我们假设线粒体功能障碍加上抗氧化能力降低是导致早期抗氧化环境的原因。过氧化氢酶是一种抗氧化酶，已知在氧化应激反应中上调(36). 因此，这种蛋白质在Mat-Ob肝脏中的升高表明对ROS暴露有进行性的代偿反应。有证据表明NAFLD的氧化还原中心致病理论，其中氧化还原状态/ROS可以调节脂质代谢以及胰岛素敏感性(33). 此外，线粒体代谢增加和复合III生成的ROS被发现可诱导PPARγ活性和脂肪细胞分化(38). PPARγ在肝细胞中的自由基生物学值得进一步研究，但表明氧化失调在NAFLD的潜在发病机制中发挥着进一步的作用。

我们观察到Mat-Ob子代的肝糖原和蛋白质减少。在喂食HFD的大鼠中也观察到了这种情况，其中肝甘油三酯和糖原含量之间的负相关与胰岛素抵抗有关(18)提示这是维持肝细胞完整性和功能的代偿反应。通过ATGL减少脂肪分解，通过PEPCK和G6Pase减少糖异生，表明糖原是Mat-Ob后代的主要能量来源。

赠款

这项研究得到了Wellcome Trust（致M.Z.Alfaradhi）、生物技术和生物科学研究委员会（致D.S.Fernandez-Twinn：BB/F015364/1型)英国心脏基金会（致M.S.Martin-Gronert和S.E.Ozanne）。S.E.Ozanne是剑桥大学MRC代谢疾病科的成员。导致这些结果的研究得到了欧盟第七框架计划的资助(FP7/2007–2013)，赠款协议编号为。289346.

披露

提交人未声明任何利益冲突，无论是财务还是其他方面。

作者贡献

作者贡献：M.Z.A.、D.S.F.-T、M.S.M.-G和S.E.O.研究的概念和设计；M.Z.A.、D.S.F.-T.和M.S.M.-G.进行了实验；M.Z.A.、D.S.F.-T.和M.S.M.-G.分析数据；M.Z.A.、D.S.F.-T.、B.M.、A.L.F.和S.E.O.解释了实验结果；M.Z.A.准备的数字；M.Z.A.起草的手稿；M.Z.A.、D.S.F.-T.、M.S.M.-G.、B.M.、A.L.F.和S.E.O.编辑和修订的手稿；M.Z.A.、D.S.F.-T.、M.S.M.-G.、B.M.、A.L.F.和S.E.O.批准了手稿的最终版本。

致谢

参考文献