儿科外科杂志。作者手稿；PMC 2011年6月1日发布。
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尼姆斯：NIHMS209705
Toll样受体4对新生鼠缺血再灌注肠损伤的保护作用
，医学博士，† 、医学博士、博士，‡ 、医学博士、博士，§*和，医学博士†‡,1,2
罗宾·洛伦茨
§伯明翰阿拉巴马大学病理学系
*伯明翰阿拉巴马大学微生物系
里德·A·迪米特
†伯明翰阿拉巴马大学儿科
‡伯明翰阿拉巴马大学外科
†伯明翰阿拉巴马大学儿科
§伯明翰阿拉巴马大学病理学系
*伯明翰阿拉巴马大学微生物系
‡伯明翰阿拉巴马大学外科
1通信地址：16007年，阿拉巴马大学伯明翰分校儿科Reed A.Dimmitt博士第个阿拉巴马州伯明翰ACC 618南大街，邮编35233。ude.bau@ttimmidr电话：205.939.9918。传真：205.939.9919 摘要
目的
服用益生菌的早产儿坏死性小肠结肠炎的发病率降低。这可能是由肠道细菌通过类toll-like受体（TLRs）2和4的信号传导介导的，以维持肠道内稳态。我们假设TLRs 2和TLRs 4对缺血再灌注（I/R）肠损伤具有保护作用。
方法
两周龄C57BL/6野生型（WT），B6.TLR2−/−、B6.TLR4−/−、B6.TLR2−/−4−/−和微生物减少（抗生素治疗）小鼠（MR）分别接受60分钟肠系膜上动脉闭塞（I）和90分钟再灌注（R）。采集小肠，用定量PCR分析微观损伤、凋亡和炎症基因表达。
结果
I/R后，B6.TLR4的组织损伤中位数得分−/−、B6.TLR2−/−4−/−和MR幼犬高于WT或B6.TLR2−/−根据TUNEL和激活的caspase-3免疫染色，对应较大凋亡的幼鼠。B6.TLR4−/−，B6.TLR2−/−4−/−MR也有组织固有免疫相关趋化因子和细胞因子表达升高
结论
TLR4缺失的新生小鼠，无论是单独的还是TLR2缺失的，以及那些缺乏正常肠道微生物组的小鼠，都更容易受到肠损伤I/R模型的影响。这些结果可能为共生菌介导的保护提供了一种机制，这可能有助于指导进一步的研究，以阐明益生菌的保护机制。
关键词：Toll样受体、坏死性小肠结肠炎、微生物群、缺血再灌注
介绍
坏死性小肠结肠炎（NEC）继续与极低出生体重（VLBW）婴儿的显著发病率和死亡率相关[1]。最近的临床试验表明，益生菌可以降低NEC的风险[2]。益生菌的理论基础来自这样一种理论，即极低出生体重婴儿几乎都会在延迟喂食的情况下接受广谱抗菌治疗，从而导致肠道微生物群异常。益生菌相关NEC预防的一个潜在机制是，这些细菌通过宿主类受体（TLR）发出信号来维持肠道内稳态。TLR是先天性免疫分子，作为特定细菌和病毒配体的受体发挥作用[三]。TLR缺陷的成年小鼠已被证明增加了实验性结肠炎[4]和NEC[5]但关于NEC新生儿模型的研究很少。
我们研究的目的是确定TLR2和TLR4在新生小鼠NEC缺血/再灌注（I/R）模型中的作用，TLR4是分别与革兰氏阳性和阴性细菌相关的细菌配体受体。此外，接受与极低出生体重儿出生后早期相似的广谱抗菌药物治疗的幼鼠接受I/R。我们假设2周龄的小鼠TLR2、TLR4、TLR2和4缺乏，与具有正常微生物群的野生型小鼠相比，肠道微生物群减少的小鼠会有更大的I/R肠道损伤。具体而言，我们假设实验组会增加粘膜坏死、凋亡和炎症免疫分子的表达。
方法
老鼠
成人C57BL/6野生型，B6.TLR2−/−、B6.TLR4−/−和B6.TLR2−/−4−/−用小鼠进行繁殖，获得2周龄的幼崽用于研究。B6.TLR2−/−和B6.TLR4−/−由日本大阪大学的Akira静雄博士和马萨诸塞大学的Doug Golenbock博士作为礼物提供。在我们的设施中培育出TLR2和4种缺陷组合小鼠，并使用引物序列进行PCR筛选：TLR2，GGTTCAGCCTTTCTTTA（正向），TGTGAGAAAAAAAGAGATTTC（反向）；对于TLR4，CAGAGTTTTCCTGCAATGGATCA（正向），TGCTTATCGAAGGTTGCACAT（反向）。繁殖者在特定的无病原体（SPF）条件下饲养，并在交配前2周适应我们的设施。幼崽是在常规条件下出生和饲养的，并在献祭前一直进行喂养。实验由伯明翰阿拉巴马大学动物护理和使用委员会批准，批准号为081107653。SPF条件列表位于http://main.uab.edu/sites/比较病理学/surveillance/.
微生物减少
使用Hans等人的改良剂将抗生素添加到饮用水中[6]。通过向无菌饮用水中添加硫酸链霉素（4.8 mg/mL）、氨苄西林（1.2 mg/mL），甲硝唑（1.2 mg/mL）和万古霉素（0.6 mg/mL）（西格玛，圣路易斯，密苏里州）来维持成年C57BL/6野生型微生物减少（MR）动物随意并双向改变。雌性在交配前5天接受治疗，在整个实验期间继续进行抗生素治疗。
粪便样品的PCR-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）分析
如前所述，从2周大的WT和MR幼崽获得的粪便样本的DNA提取用于PCR-DGGE分析[7]。引物用于针对16S rRNA的不同可变区的PCR扩增。正向引物序列为ACTACGTGCCAGCCCGCCGGGCCGGCCCGCCCGCCCGCGGGCACGGGACTACGTGCCAGCAGCC，反向序列为GGACTACCAGGTATCTAATCC。使用梯度变性凝胶对PCR产物进行分析，梯度变性凝胶使用GS-710校准成像密度计®（Bio-Rad Inc.，Hercules，CA）进行扫描。从凝胶中切除选定的条带，并通过压榨浸泡过程提取DNA。如前所述，使用上述与M13载体序列相连的引物将DNA用于额外的PCR[8]并使用密歇根州立大学微生物生态学中心提供的在线核糖体数据库项目对序列进行了分析(http://rdp.cme.msu.edu/).
诱导缺血再灌注（I/R）损伤
在通过Vapomatic™汽化器（a.M.Bickford，Inc，Wales Center，NY）吸入氧气和异氟烷（MWI，Meridian，ID）实现充分麻醉后，对2周龄C57BL/6野生型（WT）TLR 2进行中线剖腹产术−/−、TLR 4−/−，TLR 2−/−4−/−和MR小鼠。如前所述，通过在肠系膜上动脉上放置4cm直的微型血管瘤夹（Fine Science Tools，Inc.，Foster City，CA）来实现缺血[9]。使用3-0丝的单一简单连续缝合线闭合剖腹手术（Ethicon公司，新泽西州萨默维尔）。缺血60分钟后，如前所述取出夹钳并闭合剖腹术。在再灌注90分钟后，用过量吸入异氟醚处死小鼠，并经颈椎脱位证实死亡。采集中段空肠并放入Bouin固定液（Fisher Scientific，Kalamazoo，MI）和RNA中我ater®（Ambion，Inc.，德克萨斯州奥斯汀）分别用于组织学和实时聚合酶链反应（RT-PCR）分析。
来自每个队列的两周龄小鼠被用作I/R动物的模拟治疗对照。这些小鼠没有进行麻醉或剖腹手术。在献祭后，按照上述方法采集和处理组织。
受伤评分
将部分空肠中段包埋在石蜡中，切片切片，并用苏木精和伊红染色（西格玛-阿尔德里奇，圣路易斯，密苏里州），以分析I/R介导的损伤。使用Jilling等人根据受伤深度报告的改良评分系统，评分范围为0至5；0-无损伤；1-仅空泡化；2具长柔毛的顶端；3-中层具长柔毛；4-整个地穴；5至肌层[10]。评分由两位作者（PT、RD）以掩盖的方式独立进行。复合损伤评分基于每只小鼠五个不同肠道组织切片的多个评分，并作为损伤评分的中位数进行报告。
TUNEL免疫染色
使用ApopTag®试剂盒（Millipore Corp，Billerica，MA）进行末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP-FITC镍标记（TUNEL），标记与凋亡相关的特征DNA断裂，从而确定是否存在凋亡细胞。空肠中段脱蜡，并使用柠檬酸和柠檬酸钠加热溶液进行抗原回收。用蛋白酶K（密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）消化蛋白质后，用TUNEL反应溶液处理载玻片，用地高辛核苷酸标记DNA片段，并在37°C下培养1小时。然后将荧光素结合的抗地高辛抗体在黑暗中加入载玻片中30分钟，然后应用Hoechst（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）染料进行非特异性核染色。
活化caspase-3免疫染色
为了确定参与I/R损伤的特异性凋亡途径，进行了活化的胱天蛋白酶-3免疫染色。使用加热的目标回收溶液，高pH™（Dako，Inc，Carpintia，CA）对空肠中段切片进行脱蜡并进行抗原回收。在磷酸盐缓冲溶液（PBS）中用3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶10分钟。在用Avidin/biotin blocking Kit（Vector Laboratories Inc，Burlingame，CA）阻断内源性生物素活性后，用原代兔单克隆抗鼠激活caspase-3抗体（Invitrogen Corp，Carlsbad，CA）处理切片，在PBS+1%牛血清白蛋白中稀释至1:500，0.3%Triton®-X-100和0.2%奶粉（PBS-BB）（Fisher Scientific Inc，新泽西州Fair Lawn）。将载玻片在4°C的湿度室中培养过夜。将PBS-BB单独添加到对照载玻片中。将生物素结合的驴抗兔IgG二级抗体（Jackson ImmunoResearch Inc，West Grove，PA）在PBS-BB中稀释至1:1000，并在室温下添加到载玻片中1小时。链霉亲和素结合辣根过氧化物酶（Jackson ImmunoResearch Inc，West Grove，PA）在PBS-BB中以1:1000稀释，并添加到载玻片中30分钟。使用TSA™Plus Cyanine 3（PerkinElmer，Waltham，MA）在1:1000的黑暗中进行荧光扩增30分钟。用Hoechst染料（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）对载玻片进行非特异性核染色。
细胞凋亡定量
使用配备荧光成像滤光片和Zeiss Axiocam™（明尼苏达州Maple Grove市卡尔蔡司IMT公司）的蔡司Axioskop 2 mot plus显微镜，在100倍放大的条件下，对各组的活化caspase-3染色载玻片拍摄了五张具有代表性的数字图像。手动设置亮度以消除背景噪声并确保图像之间的相似性。使用Metamorph®（MDS Analytical Technologies，Sunnyvale，CA）测定总活化caspase-3染色，并用荧光强度表示。荧光强度被定义为视野中高于caspase摄取设定亮度阈值的百分比。各组的所有肠段大小相似，因此可以在各组之间进行直接比较。
RNA分离与基因表达
从模拟和I/R处理小鼠的空肠中段切取并放入RNA我ater®（Ambion，Inc.，德克萨斯州奥斯汀）用于分析炎症分子的表达。如{Chomczynski，1987年}所述，使用Trizol®分离RNA（Invitrogen®，加利福尼亚州卡尔斯巴德）。使用Turbo DNA去除基因组DNA污染-自由的该套件可从Applied Biosystems®（加利福尼亚州福斯特市）获得。使用罗氏转录器第一链cDNA合成试剂盒®（德国彭斯堡）将RNA转录成cDNA。使用TaqMan Universal PCR Mix®（Invitrogen®，Carlsbad，CA）结合Applied Biosystems®引物探针集进行实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）。使用RT循环器MX3000P®（Stratagene®，La Jolla，CA）读取的交叉阈值确定特定基因RNA水平，并表示为与初始荧光检测的对数差异。平均荧光阈值，生成一个基因特异性数字，然后将其归一化为18S看家基因的平均表达，并根据特定菌株和实验条件进一步分层。与对照菌株值相比，基因表达作为平均折叠变化进行计算，并在对数2标度上显示为相对于对照基线的折叠变化（=1）。此数据分析格式的协议在Applied Biosystems制造商的说明中提供（4371095 Rev A，PE Applied biosystem）。
统计分析
使用Sigma Stat 2.03（SPSS Inc.，Chicago，IL 60606 USA）软件进行数据分析。连续变量采用Student t检验和单因素方差分析，类别变量采用Fisher精确检验。采用Mann-Whitney检验进行非参数分析。使用Student检验分析基因表达差异，以比较实验动物和对照动物之间的ΔΔCT和标准差。一个第页值<0.05为显著性。
结果
使用抗生素减少微生物
为了评估接受抗生素治疗的小鼠的微生物减少程度，使用16s rRNA扩增分析了2周龄MR和SPF小鼠是否存在细菌。DNA提取和使用保守细菌16s rRNA引物进行PCR后，DGGE分析显示SPF粪便中的微生物种群相对不同(、车道D、E）与MR小鼠的比较(，车道A–C）。在MR小鼠中观察到一条表示单一细菌种类的带(，箭头）。序列分析显示该条带与铜绿假单胞菌当使用核糖体数据库项目进行查询时，其具有93%的序列相似性。因此，通过选择一种革兰氏阴性菌，接受抗菌治疗的母鼠饲养的小鼠共生细菌多样性显著降低。
2周龄MR和WT小鼠粪便的PCR-DGGE分析。车道A，B，C=MR，车道D，F=WT。黑色箭头表示在MR小鼠中观察到的持续带状模式。
肠缺血再灌注损伤
先前的研究表明，缺乏TLR的成年小鼠在结肠炎模型中具有更高的发病率和死亡率，我们的实验室已经表明成年小鼠B6.TLR2−/−与WT小鼠相比，I/R诱导的肠道损伤更大。因此，我们假设缺乏这些细菌信号分子的新生小鼠会增加I/R损伤。为了确定哪些TLR在I/R保护中很重要，C57BL/6 WT，B6.TLR2−/−、B6.TLR4−/−，和B6.TLR2−/−4−/−进行了研究。表示用于损伤评分的组织学结果（损伤评分分别为0-5）。病理结果主要是凝固性坏死和肠绒毛脱落，类似于人类NEC组织。中位数B6.TLR 4组的组织损伤评分显著高于−/−和B6.TLR2−/−4−/−小鼠与WT小鼠的比较(中位数为3 vs。2). MR小鼠表现出更高的损伤评分趋势（中位数3比.2），但没有达到显著性。B6.TLR2−/−小鼠的损伤评分与WT相似，损伤评分中位数为1。综上所述，这些数据表明，LPS信号分子TLR4缺陷的新生小鼠比WT小鼠具有更大的I/R损伤，而共生微生物多样性减少的小鼠趋向于更大的损伤。
I/R损伤后的组织损伤评分。使用Jilling报告的改进评分系统，评分范围为0到5[10]基于受伤深度；0-无损伤（A）；1-空泡化（B）；2-长柔毛尖端（C）；3-中长柔毛（D）；4-整个地穴（E）；5至肌层（F）。图像以200倍放大率拍摄。通过ANOVA分析每个菌株的中值得分*第页<0.05（G）。n=10只动物/株。
细胞凋亡
虽然H&E发现有坏死的证据，但I/R损伤也与细胞凋亡增加有关[10]。接下来，我们开始确定凋亡在NEC模型中的作用。核内TUNEL染色检查()接下来的I/R显示B6.TLR4细胞凋亡增加−/−、B6.TLR2−/−4−/−、和MR小鼠(分别），而WT和B6.TLR2−/−小鼠的凋亡细胞很少(). 为了确定可能与I/R损伤相关的凋亡途径，对从不同队列获得的小肠切片进行分析，以确定是否存在活化的caspase-3(). 主观上，在B6.TLR4中有更多激活的caspase-3染色−/−、B6.TLR2−/−4−/−、和MR小鼠(分别），对应于TUNEL染色结果。平均荧光强度的计算机辅助定量分析证实，与WT对照组相比，这些菌株中激活的caspase-3的数量明显更高。因此，这些实验表明，MR和TLR4缺陷小鼠具有更大的I/R药物凋亡，这可能是组织损伤增加的机制。
I/R损伤后的TUNEL免疫染色。每个图像代表了每个菌株（A）WT、（C）B6.TLR2的TUNEL阳性细胞的程度−/−，（D）B6.TLR4−/−，（E）TLR2−/−4−/−，（F）MR.放大100倍。（B） 200×图像显示细胞核内TUNEL染色提示细胞凋亡。绿色=TUNEL，蓝色=Hoechst
I/R损伤后激活的caspase-3免疫染色。每个图像代表了每个菌株（A）WT、（C）B6.TLR2的caspase-3阳性细胞的激活程度−/−，（D）B6.TLR4−/−，（E）TLR2−/−4−/−，（F）MR.放大100倍。（B） 200×图像显示激活的caspase-3染色。红色=半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3，蓝色=Hoechst。（G） 通过ANOVA分析每个菌株活化caspase-3染色的平均荧光强度*第页<0.05. n=5只动物/株
炎症分子基因表达的基线分析
接下来，我们着手确定炎症介质在防止I/R损伤中的作用以及这些细胞因子和趋化因子在疾病机制中的作用。我们假设缺乏TLR的小鼠比WT小鼠炎症介质基因表达更少。显示了16种与肠道炎症相关的细胞因子和趋化因子的RT-PCR分析结果。WT对照组和B6.TLR2组的这些分子中没有任何差异−/−、B6.TLR4−/−，或B6.TLR2−/−4−/−老鼠。相反，当正常化为WT小鼠时，MR小鼠的白细胞介素-23（IL-23a）、干扰素-γ（IFN-γ）和髓过氧化物酶（MPO）表达更高，但在其他炎症分子中没有表达。因此，TLR2、4或两者缺如的小鼠在I/R之前具有相似的基线小肠炎症。虽然MR小鼠具有更高的IL-23a、IFN-γ和MPO表达，但典型固有炎症分子的表达与WT小鼠相似，包括IL-6以及含有谷氨酸-亮氨酸-精氨酸和半胱氨酸-氨基酸-半胱氨酸（ELR+CXC）基序的趋化因子。这些趋化因子相当于人类IL-8。具体而言，小肠LPS诱导的CXC趋化因子（CXCL5，LIX）、巨噬细胞炎症蛋白-2（CXCL2，MIP-2）和角质形成细胞衍生的趋化因子（CXCL1，KC）没有显著差异。
表1
2周龄模拟对照小鼠基线肠细胞因子和趋化因子表达的比较。这些值表示为与野生型幼崽相比，每个菌株的折叠变化和范围。NS-不重要
| 细胞因子 | TLR 2型−/−(=10) | TLR 4级−/−（n=10） | TLR 2型−/−4−/−（n=10） | MR（n=10） | P值 |
|---|
| IL-1α | 0.26 (0.09–0.79) | 0.35 (0.06–2.10) | 0.15 (0.05–0.42) | 0.28 (0.05–1.55) | NS公司 |
| 白介素-2 | 0.48 (0.06–3.96) | 0.78 (0.34–1.8) | 0.15 (0.06–0.37) | 0.30 (0.07–1.30) | NS公司 |
| 白介素-4 | 1.20 (0.14–10.21) | 0.46 (0.19–1.13) | 0.32 (0.11–0.90) | 2.06 (0.40–10.74) | NS公司 |
| 白介素-6 | 1.18 (0.16–8.66) | 1.30 (0.22–7.83) | 0.10 (0.04–0.22) | 2.41 (0.53–10.94) | NS公司 |
| 白介素-10 | 0.68（0.18–2.60） | 0.31（0.06–1.49） | 0.14 (0.06–0.35) | 4.41 (1.39–13.95) | NS公司 |
| 白介素-17 | 2.22 (1.09–4.52) | 2.32 (0.73–7.40) | 1.62 (0.97–2.71) | 3.14 (0.88–11.26) | NS公司 |
| 白介素-22 | 3.70 (1.13–12.16) | 1.82 (0.58–5.68) | 1.40 (0.83–2.34) | 3.72（0.91-15.24） | NS公司 |
| 白介素-23a | 2.46 (0.55–11.04) | 0.80 (0.10–6.36) | 0.18 (0.05–0.66) | 21.35 (4.02–113.39)* | *第页<0.05 |
| 干扰素-γ | 1.92 (0.84–4.39) | 1.96 (0.52–7.40) | 1.49 (0.82–2.70) | 15.88 (1.93–130.50)* | *第页<0.05 |
| 转化生长因子-β | 0.65 (0.08–5.43) | 0.29 (0.05–1.75) | 0.32 (0.07–1.51) | 0.41 (0.10–1.72) | NS公司 |
| 肿瘤坏死因子-α | 0.45 (0.27–0.73) | 0.51 (0.11–2.28) | 0.37 (0.15–0.95) | 0.68 (0.22–2.08) | NS公司 |
| LIX公司 | 0.45 (0.27–0.73) | 0.46 (0.08–2.63) | 0.27 (0.10–0.73) | 1.99 (0.70–5.65) | NS公司 |
| KC公司 | 0.49（0.08–3.0） | 1.14（0.30–4.36） | 0.09 (0.02–0.52) | 3.83 (0.93–15.79) | NS公司 |
| MIP-2型 | 1.46 (0.89–2.39) | 0.33 (0.05–2.14) | 0.14 (0.01–1.28) | 0.45 (0.04–4.63) | NS公司 |
| 龙井 | 0.87 (0.31–2.43) | 0.30 (0.11–0.81) | 0.14（0.05–0.36） | 0.34 (0.06–2.50) | NS公司 |
| 多功能操作 | 3.53 (2.18–5.69) | 1.10 (0.37–3.32) | 0.63 (0.40–1.01) | 8.94 (3.35–23.85)* | *第页<0.05 |
I/R后固有和适应性炎症分子
由于NEC是一种急性肠道疾病，我们的模型会导致快速损伤，因此我们假设肠道损伤更严重的小鼠会有更多的先天性炎症介质表达。继I/R之后，B6.TLR4−/−小鼠MIP-2和IL-6的表达增加，而B6.TLR2的表达增加−/−4−/−与WT对照组相比，小鼠LIX、MIP-2、KC、IL-1α和IL-6的表达更高(). 此外，MR也增加了炎症基因表达（MIP-2、IL-6），而B6.TLR2中固有炎症介质的表达−/−与WT小鼠相比无显著差异。
定量RT-PCR分析菌株I/R损伤中固有免疫分子的表达。RT-PCR数据以对数表示2通过ΔΔCT计算I/R与模拟对照的对比度，并将其归一化为18S rRNA表达，通过方差分析进行分析*第页<0.05.，n=10只/株
当我们分析与适应性免疫功能相关的细胞因子的表达时，我们发现TLR缺陷小鼠和WT对照组的IL-4表达没有差异，但MR小鼠的IL-4和IFN-γ表达显著增加。此外，B6.TLR4−/−小鼠IL-10的表达增加，而B6.TLR2的表达增加−/−4−/−小鼠IL-2、IL-10和IL-23a表达增加().
菌株I/R损伤中适应性免疫分子表达的定量RT-PCR分析。RT-PCR数据以对数表示2规模并用ΔΔCT标准化为18S rRNA表达，将I/R与模拟对照进行比较，通过方差分析进行分析*第页<0.05，每个品系n=10只动物
综上所述，这些结果表明I/R损伤程度与炎症介质表达之间存在联系。具体而言，TLR或正常共生菌缺陷的新生小鼠的组织趋化因子生成量比WT增加。
讨论
NEC仍然是极低出生体重儿发病率和死亡率的主要原因。尽管VLBW婴儿的其他疾病有所进展，但NEC的发病率在过去20年中保持不变[11]。由于对NEC机制缺乏深入了解，因此难以开发旨在预防该病的治疗方法。虽然NEC的发病机制可能是多因素的，但与NEC相关的关键因素包括肠灌注不足[12]，异常细菌定植[13]免疫反应失调[14，15]和喂食[16].
肠道环境在出生时被认为是无菌的，在新生儿期，从环境中获得细菌并构成肠道微生物组的支架[17]。肠道粘膜免疫系统至少部分通过共生肠道细菌刺激TLRs产生耐受性[18]。TLR是先天免疫系统模式识别受体家族的跨膜成分[三]。通过识别细菌产物，肠道TLR通过平衡对共生菌群和致病菌群的促炎和抗炎免疫反应来维持体内平衡。这种免疫反应的失调与炎症性肠病有关[19]也可能在NEC的发病机制中起关键作用。
动物模型之前已经显示了类收费受体及其下游成分的保护作用。在右旋糖酐硫酸钠（DSS）结肠炎模型中，缺乏TLR或MyD88（与TLR相关的信号分子）的小鼠，以及缺乏肠道TLR信号所需细菌的微生物减少小鼠，已被证明具有明显更严重的损伤。然而，当这些微生物减少的小鼠被给予脂磷壁酸（LTA）和脂多糖（LPS）（分别刺激TLR2和TLR4）时，它们完全免受DSS诱导的死亡[4].
最近的临床研究表明，肠道益生菌可降低某些极低出生体重婴儿NEC的风险，但其确切机制尚不清楚。由于环境细菌的改变和抗生素的使用，早产儿出现了异常的肠道定植，这表明抗生素在功能上下调了TLR的表达（Dimmitt，2009年，提交出版）。通常在出生后获得的健康微生物组被致病微生物组所取代，该致病微生物组可能会将肠道免疫系统引导至更易引发炎症的状态。研究推测，益生菌TLR向树突状细胞发出的信号通过诱导免疫抑制调节性T细胞在免疫调节和耐受中发挥作用[20]。此外，同时刺激TLR2和TLR4对抗炎细胞因子的产生具有协同作用[21]。因此，益生菌对NEC的保护可能通过TLR发挥作用。
在当前的研究中，我们试图进一步研究在NEC缺血再灌注模型中刺激TLRs 2和TLRs 4的保护作用，以期进一步阐明益生菌给药的保护机制。虽然此模型中诱导的损伤与已建立的NEC模型相似，但应注意，这是一个缺血-再灌注模型，而不是NEC模型。我们的发现证实了先前的研究表明，无法通过TLRs 2和TLRs 4发出信号的小鼠对粘膜损伤的敏感性增加。微生物减少的小鼠缺乏微生物群来发出TLR信号，类似于正在接受抗生素治疗的VLBW婴儿[10]有加重损伤和增加细胞凋亡的趋势。
我们的免疫染色证明，凋亡是粘膜损伤的一种机制。与Jilling的发现类似，我们发现凋亡可能发生在肠坏死之前，因此可以解释管腔TUNEL和caspase-3标记物增加的原因。紧密连接蛋白已被证明可启动细胞凋亡[23]和TLR诱导某些紧密连接蛋白的表达[24]。因此，在正常宿主中，肠道细菌对TLR的刺激可能在降低损伤敏感性和随后的细胞凋亡中发挥作用。
我们在TLR缺乏和MR小鼠中发现的过度炎症反应可能是进一步加重缺血再灌注损伤的原因。我们的实验室之前已经证明，与WT小鼠相比，成年B6.TLR2缺陷小鼠的缺血再灌注诱导的肠损伤更严重[5]。目前对新生小鼠的研究发现，B6.TLR 2之间的粘膜损伤没有差异−/−和WT小鼠。这可能反映了新生小鼠与成年小鼠TLR的差异表达，这可能与微生物群的获得有关。微生物群的建立首先是由兼性厌氧革兰氏阴性菌定植开始的，因此TLR4的细菌信号在新生儿肠道中占主导地位[17]。直到后来获得真正的厌氧革兰氏阳性菌时，TLR2才会检测到。当肠道在新生儿期获得细菌时，TLR相对下调至成人水平[25，26]。这种下调可以防止对获得性细菌的过度炎症反应；然而，低水平表达可能是肠道正常发育所必需的。TLR 2的炎症反应增加−/−4−/−小鼠与TLR 4的比较−/−小鼠表明，TLR之间的相互作用可能促进低水平表达，TLR的发育作用和炎症作用之间的这种平衡的丧失可能导致粘膜损伤的增加。抗生素使用导致的细菌多样性减少可能会促进TLR表达的不平衡，从而改变肠道内稳态。
我们关于先天炎症介质的组织表达的结果与其他研究人员一致，表明急性损伤过程[15]。此外，关于适应性炎症介质的结果喜忧参半，在B6.TLR2中IL-17的表达没有显著增加，但IL-23a的表达更多−/−4−/−幼崽。在I/R损伤较大的菌株中发现IL-10增加，这是一种调节性和抗炎性细胞因子，这是意料之外的。先前的一项研究表明，肠I/R损伤后，组织IL-1增加导致IL-10增加，这可能解释了我们的结果，因为IL-10表达更高的小鼠IL-1α表达更高。[27].
总之，TLR4缺失的新生小鼠，无论是单独或与TLR2协同缺失，还是缺乏多种肠道共生微生物组的小鼠，都更容易受到肠粘膜损伤。因此，共生细菌TLR信号的存在可能会改善早期肠道内稳态。
致谢
我们要感谢杰米·麦克诺特（Jamie McNaught）和UAB消化疾病发展中心的细胞和分子病理学核心（Cell and Molecular Pathology Core）在组织学方面的协助，感谢佩吉·麦基·贝尔（Peggie McKie-Bell）在畜牧业方面的协助以及兰迪·布洛克（Randy Bullock）在RT-PCR和PCR-DGGE实验方面的协助。
脚注
出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们提供这份手稿的早期版本。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。
2这项工作得到了NIH拨款R01 DK059911、P01 DK071176、K08 HD46506和阿拉巴马大学伯明翰消化疾病研究发展中心拨款P30 DK064400的部分支持。PT获得了UAB Dixon Fellowship的部分支持。该项目的各个方面都是在生物医学研究空间进行的，该研究空间由国家卫生研究院拨款C06RR020136的部分资金支持。
工具书类
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