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核酸研究。2008年9月；36（16）：5362–5375。
2008年8月12日在线发布。 数字对象标识：10.1093/nar/gkn503
预防性维修识别码：PMC2532731型
PMID：18697815

剖析p53磷酸化在同源重组中的作用为获得功能突变体提供了新线索

Anja Restle公司,1 马丁·法伯,1 辛迪·鲍曼,1 迈克尔·贝林格,1 卡尔·海因茨·谢特曼,2 卡斯滕·穆勒·蒂杜（Carsten Müller-Tidow）,三和丽莎·维斯米勒1,2,*
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补充资料

摘要

同源重组调控（HR）代表了p53最具特征的DNA修复功能。p53磷酸化在DNA修复中的作用尚不清楚。这里，我们显示野生型p53以部分需要ATM/ATR磷酸化位点丝氨酸15的方式抑制HR对DNA双链断裂（DSB）的修复。Cdk介导的丝氨酸315磷酸化对这种抗重组作用是必不可少的。然而，如果没有HR底物的靶向裂解，丝氨酸315磷酸化对于p53激活依赖拓扑异构酶I的HR是必要的。此外，细胞周期蛋白A1的过度表达，模拟了肿瘤中的情况，在存在致癌p53突变体（而非Wtp53）的情况下，不适当地刺激了DSB诱导的HR。这种效应需要细胞周期蛋白A1/cdk介导的磷酸化才能与拓扑异构酶I形成稳定的复合物。我们得出的结论是，p53突变体失去了HR激活和抑制之间的平衡，这导致潜在诱变DNA重排的净增加。我们的数据为突变体p53在基因组不稳定中获得功能的机制提供了新的见解。

简介

由于p53作为看门人和看门人的中心作用，该蛋白必须受到复杂的控制机制的控制，这些机制协调p53在转录、细胞周期控制、凋亡诱导和DNA修复方面的多种功能(1,2). 通过蛋白磷酸化对p53进行翻译后修饰是最广泛研究的潜在功能转换机制，因为它发生在多个丝氨酸和苏氨酸残基上，以响应遗传毒性应激(三,4). 经证实，ATM和ATR对丝氨酸15的p53修饰可触发损伤诱导的磷酸化和乙酰化级联反应，这与蛋白质稳定和转录激活增强有关(三,4). 然而，对敲除小鼠模型的观察(5,6)表明丝氨酸18在细胞凋亡中起作用，但在Mdm2调控的蛋白质稳定性中不起作用。此外，在几项研究中，没有证据表明N-末端酪蛋白激酶1（CK1）和ATM/ATR磷酸化位点在损伤诱导的转录转录激活中发挥重要作用(7–9). 此外，当DNA复制被阻断时，p53在丝氨酸15上被磷酸化，但这并没有伴随着关键靶基因产物如p21的增加(10–12). 这表明在复制分叉停滞后，丝氨酸15上磷酸化的p53（p53pSer15）可能发挥与转录转录激活无关的其他功能。为了支持这一假设，共定位研究表明p53pSer15是RAD51特异性修复组件的组成部分(11–13)。

在过去几年里，大量证据表明p53直接参与DNA修复，特别是同源双链断裂（DSB）修复。首先，p53识别三股异源双链和四向Holliday连接，以及涉及错配、间隙或DNA末端的DNA损伤。核心结构域是连接DNA结合所必需的，并且还具有核酸外切酶活性，极端C末端在错配识别时刺激这些活性(15,2). 其次，p53在物理和功能上与关键酶和同源重组（HR）监测因子相互作用，即与RAD51、RAD54、MRE11复合物、BRCA1、BRCA2和BLM相互作用，并抵消RAD51催化的链交换。第三，使用不同的基于细胞的测试系统，几个小组同时发现Wtp53在被DSB或复制阻断剂触发时抑制分子间和分子内HR。相反，热点突变体未能下调这些HR活动。对功能分离突变的鉴定为p53在HR控制中的直接作用提供了进一步证据，这种突变失去了p53的转录激活和细胞周期调节能力，但保留了HR抑制，反之亦然(15,2). 最近的一份报告描述了RAD51系列通过Wtp53与启动子区域内的响应元件直接结合(16). 这种机制只能部分解释p53在HR中的作用，因为RAD51蛋白p53相互作用位点的突变会消除p53对HR的抑制(13). 此外，序列特异性DNA结合缺陷的p53（138V）保留了HR下调效应(17). 乍一看，这种针对相当安全的DNA修复途径的反常活动的生物学意义通过系统性底物变异揭示出来，这表明一种针对不同序列之间DNA交换过程的保真度控制机制（见15）。出乎意料的是，最近发现Wtp53在没有靶向底物裂解的情况下以依赖拓扑异构酶I（topo I）的方式刺激重组(18,19). 自发重组事件与增殖细胞中的正常DNA代谢相耦合，例如在绕过复制分叉处的低水平内源性损伤时，这些损伤不足以激活应激信号。

当暴露于电离辐射和产生高度重组DNA损伤（如DSB）时，丝氨酸6、15和315代表最显著的磷酸化p53残基(三). 另一方面，Subramanian和Griffith(20)与丝氨酸6或15相比，p53对Holliday连接DNA的识别对丝氨酸392的翻译后磷酸化特别敏感。为了确定磷酸化在重组修复的p53依赖性调节中的作用，我们将基于EGFP的重组测定与表达相应磷酸化位点突变体的细胞相结合。候选激酶通过药理学或shRNA-介导的抑制作用和调节亚单位的表达进行调控。我们发现，ATM/ATR的丝氨酸15磷酸化是p53对DSB修复监测的通道功能的一种贡献机制。丝氨酸315和cdk2是拓扑异构酶I依赖性重组所必需的，这涉及细胞核中p53和拓扑异体I之间的动态相互作用。总之，我们的数据表明，p53的位点特异性磷酸化在修复途径的微调中起着关键作用，对致癌p53突变体具有重要意义。

材料和方法

细胞和细胞周期分析

对于HR测量，在添加10%FCS和2 mM的RPMI 1640中，培养了来源于人类髓系白血病细胞系K562的KMV克隆和具有稳定整合HR-EGFP/3′EGFP底物的KMV（HR/3′）衍生物我-谷氨酰胺（Biochrom，德国柏林）(21). 从淋巴母细胞系WTK1中建立了稳定的WTK1（HR/3′）克隆，用于测量染色体上HR-EGFP和3′EGFP之间的HR(21)在RPMI 1640种植，含12%FCS和3 mM我-谷氨酰胺。当使用pSVp53her表达质粒时，细胞在转染前在无雌二醇的培养基中繁殖，然后在最终浓度为200 nM的雌二醇存在下培养，以完全激活融合蛋白90 kD内的p53部分(21)。

为了分析HR测量时间点的细胞周期相位和凋亡诱导，通过离心收集细胞，将其重新悬浮在1 ml HBSS中（25 mM HEPES，pH 7.4；173.3 mM NaCl；5.6 mM KCl；0.44 mM KH2人事军官4; 0.34 mM钠2高性能操作4; 5 mM葡萄糖；4 mM氯化钠三)并固定在10 ml固定液中（50%丙酮；40%乙醇；10%ddH2O；在−20°C）的冰块上放置15分钟。对于随后的染色，用2.5 ml冰镇PBS清洗固定细胞，补充0.2%EDTA，再悬浮在100μl碘化丙啶染色溶液（0.25 mg/ml RNAse A；50μg/ml PBS中Sigma的碘化丙锭）中，并在黑暗中培养15分钟。用200μl PBS和0.2%EDTA稀释悬浮液后，在FACS®Calibur流式细胞仪（德国海德堡Becton Dickinson）中分析染色细胞。测定了具有亚G1 DNA含量的细胞百分比，这表明细胞凋亡，并将存活细胞细分为细胞周期G1、S和G2期的细胞群。

质粒

先前描述了以下质粒：pSUPER-TopoI(19)，pSUPER-p53(22)，pcDNA3-细胞周期蛋白A1和pCMV-细胞周期蛋白A2(23)，SMRAD51嵌合表达质粒pcDNA3.1-Rad51SM(24)大鼠p53的pKEX表达结构(7)pCMV-I-SceI、pCMV-Wtp53、pCMV-p53（248W）、pSVp53her和pSVp53（1-333）her(21). pCMV-p53（315A）是由pCMV-p53（BD Biosciences Clontech，Heidelberg，Germany）构建而成，使用Quickchange（Stratagene Europe，Amsterdam，The Netherlands）引入点突变。pKD-cdk2-v5、pKD-E2F-1-v1和空载体购自Upstate。质粒pSUPER-WRN指导siRNA的合成，此前已证明siRNA可特异靶向WRN-mRNA(25). 按照鲍曼的pSUPER-TopoI所述，生成pSUPER-WRN等。(19)使用以下寡核苷酸（Thermohybaid，Ulm）：anti-WRNsiRNA-fwd，5′-GATCCCCTTCACTGGATCACATGTGTTCAGAGAGAAACACATGGAATTTTGGAAA-3′；抗WRNsiRNA-rev，5′-AGCTTTTCCAAAATTCACTGGATCCATGTTCTCGAAACAATGGAAGGG-3′。此外，我们新创建了pSV53（15A）her，用于表达丝氨酸15突变的p53her融合蛋白。PCR扩增依赖于pSV53her模板和引物5′-CTGGTACATGGAGGAGCCGCAGTCAGCTCTAGCGCGCCCTCTGGC公司TCAGGAAACATTTTCAGACC-3′，覆盖p53 cDNA的5′端（带下划线的突变碱基），5′-AGATGGCCATGGCGCCGCGCGG-3′，涵盖NcoI内部限制位点。将NcoI消化的PCR产物插入pSV53her中的pUC亚克隆XbaI片段中，经诱变后将其重新导入pSV53ther。使用ABi PRISM Big Dye Ready反应循环测序试剂盒和ABi 377测序仪验证了编码p53（15A）her的完整序列。

抗体探针

我们使用了以下单克隆抗体：针对p53 N末端的DO1，针对topo I的C21，针对cyclin A1的B88-2，针对WRN的BD611168，针对Becton Dickinson的p21的SX118，针对p53 C末端的Pab421（Calbiochem，Darmstadt，Germany），针对topoI的1D6（英国泰恩河畔纽卡斯尔的Novocastra Laboratories Ltd），E 67.1识别细胞信号中的细胞周期蛋白A2，FPS315识别p53pSer315（德国哥廷根MoBiTec/MBL），KH20和KH95识别E2F1（美国纽约州普莱西德湖Upstate Biotechnology Incorporated）。为了对大鼠p53进行免疫检测，我们使用了来自Novocastra的兔血清NCL-p53-CM5p，用于RAD51 H-92，用于来自美国加利福尼亚州圣克鲁斯生物技术公司的细胞周期蛋白A1 H-230，以及来自Upstate的cdk2 07-631。对于肌动蛋白的西方分析，我们使用来自Santa Cruz的亲和纯化山羊多克隆抗体I-19，用于微管蛋白单克隆抗体DM1A、TBP单克隆抗体1TBP18和来自德国Hiddenhausen Abcam的GAPDH ab9484。用于免疫沉淀研究的抗体为：人Scl-70血清（Topogen，Port Orange，FL，USA）、抗topo I的单克隆抗体1D6（Novocastra）和抗p53的兔血清CM1（Novocatra）。抗山羊、兔、人和小鼠IgG的过氧化物酶结合亲和纯化抗体来自德国汉堡的Dianova或Biomol。

细胞提取、免疫沉淀和免疫印迹分析

2×10的总匀浆5制备KMV（HR/3′）细胞，按照说明在Immobilon-P膜（Millipore，Bedford，MA，USA）上进行SDS-PAGE（8-15%）和western blot转移(21). 过滤器用含有0.2%吐温-20和5%脱脂奶粉的PBS中的抗体染色，然后用过氧化物酶结合的二级抗体孵育，并用ECL试剂SuperSignal®West Pico化学发光底物和West Dura延长持续时间底物检测（Pierce，Rockford，IL，USA）。用于免疫印迹分析的细胞裂解物在裂解缓冲液中制备（50 mM Tris，pH 7.4；150 mM NaCl；2 mM EGTA；2 mM-EDTA；25 mM NaF；25 mM-β-甘油磷酸；0.1 mM NaV；蛋白酶抑制剂，罗氏诊断，德国曼海姆），包括磷酸酶抑制剂鸡尾酒（罗氏），如图6B和100µg总蛋白，每个样品通过SDS–PAGE溶解。用抗肌动蛋白、微管蛋白或TBP的抗体或Ponceau染色的抗体对过滤器进行重制，以控制负载差异。或者，非特定频带的信号用于验证相等负载。

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cdk抑制对细胞周期蛋白A1和突变型p53调节HR的影响。(A类)DMSO（−）或80μM olomoucine（+）处理的KMV（HR/3′）细胞中DSB诱导的HR。对照组−p53/−cyclin A1/−olomoucine的重组频率设置为100%（绝对平均值：1.1×10−3). 列，平均值(n个= 12–18); 钢筋，SEM(B类)p53pSer315和p53的免疫印迹分析。(C类)细胞周期分析。列，平均值(n个= 2); 巴，标准偏差。

对于免疫沉淀，KMV（HR/3′）细胞在电穿孔后24 h用指示质粒在50 mM HEPES（pH 7.8）、200 mM NaCl、0.1%Triton X-100、20%甘油和蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche）中溶解。用于拓扑I-Wtp53复合物的分离体内按照Zink中的描述进行交联等。(26). 离心提取物用蛋白A-sepharose（PAS）预分离1 h，用抗po I或抗GAPDH抗体和PAS孵育4 h，然后按照Restle中的方法进行进一步处理等。(12)。

使用ChemImager 5500和软件（美国加利福尼亚州圣莱昂纳多Alpha Imunotech公司）对带强度进行密度定量。用相应的负荷控制获得的值校正感兴趣蛋白质的值。

HR分析、药物治疗和击倒

用染色体外质粒底物测定HR频率，107用40μg质粒DNA（10μg HR-EGFP/3′EGFP、10μg pCMV-I-SceI、10μg pBS、10μgp53表达质粒或空载体对照）电穿孔KMV细胞。染色体HR测量，4×106KMV（HR/3′）或3×106用30μg质粒DNA（10μg pBS、10μg p53表达质粒、细胞周期蛋白A1或细胞周期蛋白A2表达质粒或空载体对照）电穿孔WTK1（HR/3′）细胞，无论是否加入10μg pCMV-I-SceI。在电穿孔48–72小时后，在FACS®（Becton Dickinson）中进行流式细胞术分析，以确定非荧光细胞群中绿色荧光细胞的比例，如前所述(21). 每个测量值都由相同的共电穿孔并行进行，包括WtEGFP公司控制质粒而不是pBS填充质粒。分别测定这些对照组中EGFP阳性细胞的比例，并用于归一化每个单一重组频率。该计算程序还修正了与生长和死亡调节效应相关的可能速率偏差。对于药物治疗，分离KMV（HR/3′）培养物，从电穿孔后4 h开始用激酶抑制剂或溶剂处理，直到进行测量（72 h）。咖啡因（Sigma，Deisenhofen，Germany）在H中溶解2O，最终浓度为400μM时，在DMSO中加入CGK（Sigma），并在2μM时使用；将olomoucine（Calbiochem）溶解在DMSO中并以80μM的浓度添加。在topo I、p53、WRN、cdk2和E2F1敲除实验中，向共电穿孔混合物中添加20µg pSUPER-TopoI、pSUPER-p53、pSUPER-WRN、pKD-cdk2-v5、pKD-E2F-1-v1或空载体（转染效率：40–80%）。通过使用t吨-测试。

结果

p53磷酸化位点突变后同源DSB修复调控的变化

重组修复代表了p53的一种公认的直接DNA修复功能(15,2)并且在K562衍生的KMV细胞克隆中使用了基于EGFP的检测，该克隆缺乏内源性p53(19,21). 在本试验中，突变的HREGFP公司位于同一染色单体或姐妹染色单体上的序列恢复功能EGFP公司可通过流式细胞术定量绿色荧光细胞来监测的基因(图1A） ●●●●。DNA交换过程由DSB形成触发体内当表达稀有巨核酶I-SceI并在修复基质内的识别序列中引入单个DSB时。

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N端和C端磷酸化位点突变的p53蛋白表达后的HR分析。(A类)HR分析底物HR-EGFP/3示意图′EGFP，可通过I-SceI介导的卵裂后FACS量化同源DSB修复(21). (B类)公里/小时′)用pCMV-I-SceI和pKEX（对照）或pKEX衍生物对细胞进行电穿孔，以表达大鼠的Wt和突变型（174Y，15A，4/6A，390A，310/313A）p53，并培养72h。重组频率被确定为绿色荧光细胞相对于总细胞数的分数，并在每种情况下归一化为单个转染效率。列，平均值(n个= 6); 钢筋，SEM(C类)从转染的KMV（HR/3）制备总细胞匀浆′)免疫印迹法分析细胞及p53、p21和RAD51的含量。

为了研究p53磷酸化在HR调节中的作用，我们选择表达一系列大鼠p53磷酸化变异体，在之前的比较研究中已证明其保留转录活性(7). 因此，我们共转染了KMV（HR/3′）细胞，携带稳定整合的HR底物HR-EGFP/3′EGFP(图1A） ，具有I-SceI（pCMV-I-SceI）和Wtp53、致癌p53（174Y）或磷酸化突变体p53（15A）、p53（4/6A）、p53（390）或p53（310/313A）的表达质粒，或空载体。与p53阴性对照组相比，Wtp53将心率降低至47%(P（P）= 0.034) (图1B） ●●●●。我们发现突变体p53（390A）也有类似的HR抑制作用(P（P）=0.012）和p53（310/313A）(P（P）= 0.005). p53（174Y），在转录和HR调节中没有任何功能(21)，显示功能丧失。与p53阴性对照组相比，p53（15A）或p53（4/6A）表达轻微但无统计学意义后，HR频率发生变化(P（P）=0.307和P（P）分别为0.193）。当我们分析p53的表达时，我们注意到与Wtp53相比，p53（15A）和p53（4/6A）的表达水平更低(图1C） ●●●●。然而，关于受p53转录反式激活或抑制的基因产物，我们观察到在Wtp53存在的情况下，p21增加，p53（15A）、p53（4/6A）、p53（390）和p53（310/313A）也增加，RAD51没有减少。

ATM/ATR激酶抑制后，p53对同源DSB修复的抑制消失

通过ATM和ATR使p53在丝氨酸15处磷酸化，被认为启动了DNA损伤诱导的p53翻译后修饰事件的级联反应(三,4). 为了进一步阐明丝氨酸15磷酸化在DSB修复调控中的潜在作用，我们用pCMV-I-SceI共转染KMV（HR/3′）细胞，构建人Wtp53和磷酸化突变型p53（15A）的可比表达载体(21) (图2C） ●●●●。Wtp53导致36–51%(P（P）=0.017–0.046）染色体HR降低(图2A和B）。p53（15A）表达细胞表现出中间表型，重组频率降低10–31%(P（P）= 0.047–0.517). 相比之下，HR调节缺陷的四聚体突变体p53（1-333）导致了25%的无统计学意义的降低(P（P）= 0.126). 为了研究ATM和/或ATR的可能参与，我们接下来用ATM和ATR抑制剂咖啡因处理细胞(27). Western blot分析证实咖啡因治疗后丝氨酸15处p53磷酸化降低(图2C） ●●●●。咖啡因治疗完全消除了Wtp53对HR的抑制以及p53（15A）和p53（1-333）的残余影响(图2A） ●●●●。

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ATM/ATR介导的磷酸化的影响。(A类)在KMV（HR/3′）细胞中检测染色体底物的同源DSB修复，如图1使用以下与人类雌激素受体激素结合域融合的人类p53表达质粒：pSVp53her（Wt）、pSVp53（15A）her、pSVp53（1-333）her或pBS（对照），不含或含有400μM咖啡因(A类)或2μM CGK(B类). 无p53的细胞中的重组频率设置为100%[（A）和（B）中的绝对平均值：1.0×10−3]. 列，平均值(n个= 3–9); 钢筋，SEM(C类)咖啡因和CGK处理后，p53her和p53（15A）her的表达相等，丝氨酸15处p53hers的磷酸化降低。

排除细胞周期对图2A、 我们通过流式细胞术分析了G1期、S期和G2期的细胞分布。在HR测量条件下（用400μM咖啡因处理72小时，在滴定分析后有目的地选择以排除细胞毒性作用），所有细胞类型，无论是否有p53表达，以及是否有抑制剂处理，都显示出可比的细胞周期特征(补充图1A). 此外，碘化丙啶染色后通过G1亚基DNA含量确定的凋亡细胞比例在本实验和下述实验中没有显著差异(补充图1B和数据未显示）。这与K562细胞在p53表达后诱导凋亡的缺陷相一致(28). 由于RAD51被证明是p53依赖性HR抑制的直接靶点(15,2)我们希望比较Wtp53和RAD51失活的影响。为此，我们表达了SMRAD51，这是一种酵母-小鼠嵌合体，具有显性负效应，但不会改变哺乳动物细胞中的细胞活力(24). 我们发现在KMV（HR/3′）细胞中DSB诱导的HR被抑制至63%(P（P）=0.001），即与Wtp53相似。这与p53通过抑制RAD51依赖的HR通路（如基因转换）发挥抗重组作用相一致(21,29)。

此外，当我们测试更有效和选择性更强的ATM/ATR抑制剂CGK时(30)也导致丝氨酸15处p53的磷酸化降低(图2C） ，我们再次观察到Wtp53对HR的抑制作用消失，p53（15A）无进一步变化(图2B） ●●●●。总之，我们的发现表明，通过ATM和ATR磷酸化的丝氨酸15是充分有效调节DSB诱导的HR所必需的。它们还表明，需要细胞ATM和/或ATR激酶活性来揭示p53阳性和阴性细胞之间HR频率的差异。

p53刺激I-SceI依赖性HR需要cdk磷酸化位点丝氨酸315

鉴于大鼠p53 C末端磷酸化氨基酸的突变不会改变DSB修复调节(图1B） ，我们证实了对人类p53的这些观察结果。因此，我们在人类Wtp53和癌相关突变型p53（273H）、p53（315A）、p32（392A）和p53（392D）表达后，对染色体整合底物进行HR测量。p53（315A）和p53（392A）对各自丝氨酸的磷酸化具有抵抗力，而p53（39 2D）模拟丝氨酸392的磷酸化。与Wtp53相似，p53（315A）、p53（392A）和p53（39 2D）下调同源DSB修复(P（P）≤ 0.001) (图3A） ●●●●。相比之下，p53（273H）表现出残余的染色体下调活性，但无统计学意义(P（P）= 0.096). 在Wtp53、p53（315A）、p53(图3B） ●●●●。因此，丝氨酸315和392的磷酸化在p53介导的DSB诱导的HR抑制中没有显著作用。

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C末端p53磷酸化位点突变的HR调节。(A类)使用人p53表达质粒pCMV-p53（273H）、pCMV-Wtp53、pCMV-p53（315A）、pCMV-p53（392A）、pCMV-p53（392D）或空载体（对照）修复染色体同源DSB。不含p53的细胞中的重组频率设置为100%（绝对平均值：2.0×10−3). 列，平均值(n个= 6–12); 钢筋，SEM(B类)p53、RAD51和p21的Western blot分析。

因为氨基酸315位于p53的拓扑异构酶I结合位点(31)，我们接下来试图确定丝氨酸315在I-SceI依赖性HR刺激中的参与，该刺激被证明是由Wtp53和topo I介导的(19). 使用KMV（HR/3′）细胞结合人类Wtp53、p53（315A）或热点突变株p53（273H）和p53（248W）的表达监测HR，同时不使用I-SceI进行底物切割。因此，我们的平均重组频率比I-SceI诱导的HR低两个数量级（见图例图4A和B）。通过Wtp53，I-SceI-independent HR增加了～2倍(P（P）=0.023），p53（273H）(P（P）=0.113）和p53（248W）(P（P）=0.001），但不通过p53（315A）(图4A） ●●●●。为了确定HR增强是否依赖于拓扑I，我们通过转染pSUPER-TopoI来抑制内源性拓扑I表达(19) (图5D） ●●●●。在这些敲除分析中，Wtp53、p53（273H）和p53（248W）的HR刺激被取消，Wtp53HR刺激达到统计学意义(P（P）=0.030）和p53（248W）(P（P）≤ 0.001). 为了排除topo I代表HR的基本成分的可能性，我们对靶向底物裂解同时表达I-SceI进行了相同的HR测量。在这些条件下，无论p53状态如何，topo I敲除对HR活动均无影响(图4B） ●●●●。FACS分析G1、S或G2 DNA含量的细胞或凋亡细胞的比例，未能检测到Wtp53、p53（273H）或p53（248W）表达的样本与不表达的样本之间的显著差异，这表明HR刺激是由经典的抑癌活性间接引起的(补充图1B). 这些结果表明，Wtp53和致癌突变体p53均能刺激I-SceI诱导的HR、topo-I介导的重组，并揭示丝氨酸315对刺激作用至关重要。

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p53介导topo I被击倒后的HR调节(A类)和(B类)KMV（HR/3′）细胞转染pCMV-Wtp53、pCMV-p53（315A）、pCMV-p53（273H）、pCMCV-p32（248W）或空载体（对照）和pSUPER（−）或pSUPER-TopoI（+）进行拓扑异构酶特异性RNA干扰，并进行HR测量。对于（B）中I-SceI介导的底物裂解，pCMV-I-Sce1包含在转染混合物中。p53阴性细胞与pSUPER的重组频率设置为100%（绝对平均值：2.7×10−5无I-SceI和2.0×10−3与I-SceI）。列，分别为12至41（A）和六（B）次测量的平均值；钢筋，SEM。

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细胞周期蛋白A1和A2对不同p53和topo I状态细胞中同源DSB修复的影响。(A类)在与pCMV-I-SceI共转染的KMV（HR/3′）细胞和pCMV-Wtp53、pCMV-p53（315A）、pCMV-p53（273H）、pCMCV-p53或空载体（对照）以及pcDNA3-细胞周期蛋白A1（A1）、pCM V-cyclin A2（A2）或空载体中检测DSB-诱导的HR。列，平均值(n个=12-27）；钢筋，SEM(B类)与pSUPER共转染的DSB诱导过度表达细胞周期蛋白A1的细胞HR(−)或pSUPER-TopoI（+）。列，平均值(n个= 12–18); 钢筋，SEM(C类)与pSUPER（−）或pSUPER-TopoI（+）共转染后，DSB在过度表达细胞周期蛋白A2的细胞中诱导HR。列，平均值(n个=6）；将对照组的重组频率设置为100%（（A）−p53/−cyclins的绝对平均值：2.1×10−3; in（B）−p53/+细胞周期蛋白A1/−pSUPER-TopoI:2.2×10−3; in（C）−p53/+细胞周期蛋白A2/−pSUPER-TopoI:2.8×10−3). (D类)与p53表达相比，pSUPER-TopoI介导的topo I蛋白下调。(E类)细胞周期蛋白A1和细胞周期蛋白A2的蛋白质印迹。

癌基因p53突变体刺激细胞周期蛋白A1诱导的拓扑异构酶I依赖的同源DSB修复

细胞周期蛋白A1是一种替代物，与cdk2相关的A型细胞周期蛋白，与DSB修复有关，其启动子代表p53的转录激活靶点(23). 为了检测细胞周期蛋白A1在p53调节同源性DSB修复中的潜在作用，我们在KMV（HR/3′）细胞中同时表达了细胞周期蛋白B1、p53蛋白和I-SceI。同时，我们检测了细胞周期蛋白A2的影响。我们发现p53（273H）细胞中cyclin A1表达后，同源DSB修复增强69-83%(P（P）≤0.004），p53（248W）为65–148%(P（P）≤0.006），而p53阴性对照组的频率仅高7–18%(P（P）> 0.05) (图5A、，​A、 6A级6A和​和7A）。7A） ●●●●。在表达突变型p53（175H）的细胞中，我们测量到高78%的HR频率(P（P）= 0.013). 细胞周期蛋白A2表达后，p53（273H）的相对增加率为47-83%(P（P）=0.009–0.025），p53为42–60%（248W）(P（P）=0.003–0.014），对照组为35–49%(P（P）≥ 0.019). 正如预期的那样，在Wtp53和p53（315A）的细胞中，DSB诱导的HR被强烈抑制，即平均为对照水平的20%(图3A） 细胞周期蛋白A1的增量为35–41%和17–33%，细胞周期蛋白A2的增量为13–48%和46–47%(P（P）>0.05），分别(图5A、，​A、 6A级6A和​和7A）。7A） ●●●●。流式细胞术分析显示，与对照组相比，表达细胞周期蛋白A1或细胞周期蛋白A2的细胞显示出相似的细胞周期分布(补充图1C). 此外，我们测量了Wtp53、p53（315A）和p53（273H）与对照组（±cyclin A1）在胰蛋白酶抑制剂zVAD-fmk（50µM）存在下的重组。重组结果与最初的结果没有差异，因此，反对细胞凋亡参与HR调节（数据未显示）。

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cdk2敲除后细胞周期蛋白A1和突变型p53对HR的调节。(A类)DSB诱导KMV（HR/3′）细胞HR，与空载体或pKD-cdk2-v5（pKD-cd k2）共转染，用于cdk2-特异性RNA干扰。对照组−p53/−cyclin A1/−pKD-cdk2的重组频率设置为100%（绝对平均值：1.2×10−3). 列，平均值(n个= 6); 钢筋，SEM(B类)cdk2的Western blot分析。

我们注意到外源性p53（273H）在不同程度上发挥了残余的HR抑制活性(图5A、，​A、 第6页6A和​和7A）7A）(21,32). 因此，我们希望比较稳定表达内源性突变p53和不表达p53的细胞衍生物中细胞周期蛋白A1介导的HR刺激。因此，我们分析了携带p53（237I）的人类B淋巴细胞样细胞系WTK1（HR/3′）的HR活性(21)和染色体整合HR底物。HR分析在细胞周期蛋白A1过度表达和不过度表达的情况下进行，同时通过pSUPER-p53敲除或不敲除内源性p53(补充图2B). 该方法显示出统计显著性（25%，P（P）=0.001）仅在细胞周期蛋白A1过度表达后，HR频率才从突变型p53缺陷细胞（+pSUPER-p53）上升到成熟细胞（+p SUPER）(补充图2A). 未观察到细胞周期变化(补充图2C)。

接下来，我们重新应用pSUPER-TopoI来分析topo I在细胞周期蛋白A1和细胞周期蛋白A2依赖性刺激同源DSB修复中的作用。有趣的是，在KMV（HR/3′）细胞中topo I敲除后，除了表达细胞周期蛋白A1的细胞与致癌的p53突变体结合外，我们没有发现HR频率有显著差异(图5B和C）。因此，p53（273H）的HR降低了28%(P（P）=0.004），p53（248W）增加43%(P（P）= 0.001). 我们验证了拓扑异构酶的下调，如图5D表示有和无细胞周期蛋白A1表达的培养物。在相同的样本中，与TBP对照组相比，p53水平没有遵循拓扑I表达模式。总之，细胞周期蛋白A1和细胞周期蛋白A2均过度表达(图5E） 导致DSB诱导的HR增强，尤其是在表达p53热点突变的细胞中。与p53阴性对照组相比，突变型p53介导的HR刺激在细胞周期蛋白A1而非细胞周期蛋白A2的细胞中更为显著。这表明细胞周期蛋白A1和突变p53特异性成分。最重要的是，仅在细胞周期蛋白A1和突变型p53的细胞中，通过topo I敲除，HR增强被消除。

突变p53介导的刺激同源DSB修复需要cdk2

接下来，我们使用两种独立的方法分析cdk2在细胞周期蛋白A1和突变型p53表达后调节HR的作用。首先，我们在转染I-SceI、cyclin A1和p53表达质粒后，将cdk抑制剂olomoucine纳入KMV（HR/3′）培养物中。奥洛莫辛治疗可消除突变型p53表达细胞中细胞周期蛋白A1的重组刺激作用(图6A；P（P） ≤0.016). 出乎意料的是，在p53阴性对照中，细胞周期蛋白A1对HR的增强在药物治疗后更为明显。在没有cyclin A1表达的情况下，模拟和奥洛穆辛处理的样品之间没有观察到显著差异(图6A） ●●●●。免疫印迹法证实了cdk抑制剂的有效性，因为在对p53（248W）样本进行奥洛莫辛治疗后，丝氨酸315上磷酸化的p53特异性信号降低到37-51%，尽管p53的总水平保持不变(图6B） ●●●●。Wtp53中丝氨酸315的磷酸化受到的影响较小（64-100%残留水平），此外还伴随着总p53水平的降低。流式细胞术分析未显示p53阳性细胞的细胞周期分布的主要变化(图6C） ●●●●。然而，对于表达cyclin A1的p53阴性细胞，我们注意到在奥洛莫辛治疗后，S期细胞的百分比从20%上升到38%，这与之前在乳腺癌细胞中的观察结果一致(33). 考虑到细胞在S期HR中高度活跃(34)细胞周期调节作用可能是我们在治疗的、表达细胞周期蛋白A1的p53阴性细胞中观察到的意外HR增加的基础。

在第二个实验装置中，我们检测了cdk2敲除后DSB诱导的心率。如中所示图7A、 cdk2的下调(图7B） 在使用细胞周期蛋白A1和p53（273H）或p53（248W）的检测中，HR频率显著降低至不使用细胞周期素A1的水平(P（P）= 0.000,P（P）分别=0.014）。尽管p53阴性对照组的相应平均值也表明HR降低，但未达到统计显著性(P（P）= 0.066). cdk2击倒后细胞周期曲线没有显示出重大差异(补充图1D). 我们进一步测试了E2F1可能参与细胞周期蛋白A1和突变体p53依赖的HR刺激，因为转录因子E2F1对p53的核滞留需要在丝氨酸315处磷酸化p53(35)由于细胞周期蛋白A1与E2F1结合(36). 此外，我们检查了沃纳综合征蛋白（WRN）的影响，该蛋白被描述为结合p53和p53(37)和拓扑I(38,39). 最近，宋等。(40)据报道，突变型p53（248W）和p53（273H）在人源化第53页敲除小鼠模型，通过失活DSB的ATM信号导致遗传不稳定。因此，我们还检查了与ATM的链接。然而，与olomoucine治疗或cdk2敲除后观察到的情况不同，E2F1、WRN或ATM的下调或咖啡因治疗均未逆转细胞周期蛋白A1和突变型p53介导的重组增强（数据未显示）。总之，通过药物抑制或RNA干扰使cdk2失活可抑制突变型p53的HR刺激效应，这表明细胞周期蛋白A1-cdk2的磷酸化是这一过程中的关键步骤。

细胞周期蛋白A1刺激拓扑异构酶I与p53的关联

鉴于细胞周期蛋白A1介导的同源DSB修复的刺激依赖于拓扑异构酶I和突变型p53，我们研究了含有致癌突变型p5和拓扑异构酶I的蛋白复合物的形成是否参与了细胞周期蛋白A1-介导的重组刺激。为此，我们使用Scl70抗血清进行了共免疫沉淀分析，该抗血清先前已被确定用于topo I复合物的特异性沉淀(41). 从转染细胞的提取物中回收Topo I结合蛋白，并进行DSB修复测量，如图6p53（248W）与topo I结合，特别是在过度表达cyclin A1的细胞中(图8). 在这些条件下，除非染色质复合物交联，否则我们无法在拓扑I沉淀物中检测到Wtp53信号体内(图8)，表明与topo I的弱或短暂相互作用。用olomoucine对这些细胞进行额外治疗，可减少Wtp53，尤其是p53（248W）与topoⅠ的关联，支持细胞周期蛋白A1/cdk介导的磷酸化在致癌p53与topoⅡ的稳定关联中发挥重要作用的假设。

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细胞周期蛋白A1增强topo I和p53的协同免疫沉淀。用pCMV-I-SceI加空表达载体（对照）、pCMV-p53（248W）或pCMV-Wtp53加空载体或pcDNA3-环素A1电穿孔KMV（HR/3′）细胞，并用DMSO（−）或80μM olomoucine处理，完全如图624小时后，在不含p53（248W）]或染色质复合物（Wtp53）交联的情况下制备全细胞提取物体内和topo I用Scl-70血清免疫沉淀，然后用western blotting检测p53或topo I。作为非特异性topo I相互作用的阴性对照，提取物用抗GAPDH抗体（IgG）免疫沉淀。空载体对照排除了来自分子量类似于p53的重链的western blot中的非特异性信号。

讨论

p53在一些残基上被磷酸化，以应对基因毒性应激，特别是DSB等损伤(15,2). 由于p53在DSB修复途径中的良好调节功能，我们和其他人先前提出损伤诱导的磷酸化可能调节修复相关的p53活性。在这项研究中，我们系统地检验了这个假设，证明了p53在不同位置的磷酸化调节p53不同的DNA修复相关功能。

丝氨酸15部分参与DSB修复的功能性证据

ATM对丝氨酸15处p53的磷酸化反应代表了DSB诱导的p53初始修饰(4). 在染色质免疫沉淀实验中，发现ATM和p53在修复前定位于DSB(42). 此外，我们和其他人先前证明，p53pSer15代表复制阻断后与MRE11复合物、RAD51和RAD54共定位的p53亚群(11–13). 然而，到目前为止，只有间接证据表明翻译后修饰的p53亚群具有HR相关功能。在这项工作中，我们证明了p53的丝氨酸15对于完全有效抑制同源DSB修复是必要的。另一方面，对于C末端磷酸化位点突变体，HR下调的变化无法检测到。我们注意到，磷酸化抗性突变体p53（15A）显示出残余的HR再表达活性，而化学抑制ATM和ATR完全消除了p53依赖的HR下调。这可以解释为额外的N末端位点的参与，如丝氨酸20和37，在ATM/ATR激活后直接或间接被修饰(三,4). 然而，我们不能排除ATM和/或ATR是p53介导的HR抑制所必需的，与p53磷酸化无关。

在DSB修复测试的条件下，当通过p21和RAD51表达监测时，我们观察到转录转录激活或p53（15A）的抑制没有改变。此外，我们基本上排除了丝氨酸15磷酸化对HR的影响是由细胞周期控制或凋亡诱导中的主要p53活性引起的。我们的观察加强了早期关于p53直接参与RAD51依赖性基因转化的结论(15,2). 与异源双链DNA重组中间产物和RAD51的物理相互作用不涉及p53的N末端(15). RPA结合与RAD51结合一样，是p53抑制HR所必需的，它被定位在aa 48–54附近，因此更可能受到N末端磷酸化的调节(43). 重要的是，共定位和免疫沉淀实验表明，BLM促进了p53与传感器蛋白53BP1和H2AX之间的物理相互作用，从而导致p53在RAD51病灶中的有效定位和p53pSer15的净增加(11,44). 因此，通过ATM、ATR和下游激酶磷酸化N-末端p53氨基酸可以稳定与重组因子的一次或多次接触，从而实现p53的HR抑制功能。

重组中p53和细胞周期蛋白A1之间的联系

与我们之前的观察结果一致(18,19)我们在这里表明，Wtp53在没有靶向底物裂解的情况下以拓扑I依赖的方式激活HR。我们现在发现热点突变型p53（273H）和p53（248W）也是如此。丝氨酸315被证明是拓扑异构酶I依赖性HR刺激所必需的，而对于抑制DSB诱导的HR则是不必要的。

细胞周期蛋白A-cdk2先前被证明磷酸化人类p53的丝氨酸315(45,46). 有趣的是，我们发现，当细胞周期蛋白A1过度表达时（与p53阴性对照组相比，高达20倍），即使是DSB诱导的HR也会受到突变p53的刺激，这取决于拓扑I。在相同条件下，Wtp53可抑制同源DSB修复。与细胞周期蛋白A1相比，细胞周期蛋白A2的过度表达伴随着同源DSB修复中主要与p53和拓扑学I无关的增加。HR的普遍增加与一份报告一致，该报告描述了DSB诱导的高效ATM/ATR信号传递到Chk1需要cdk激酶活性(47). 由于RAD51激活需要Chk1，这意味着cdk可以促进HR(48)。

根据我们的数据并考虑到cyclin A1是Wtp53的靶基因产物(23)，我们想提出以下假设(图9)：WTp53可能通过细胞周期蛋白A1和拓扑异构酶I在正常增殖细胞中支持罕见的HR过程，特别是在S期，此时活性DNA合成与复制分叉停滞和重组旁路事件相关。然而，在存在严重损伤（如DSBs）的情况下，ATM信号可能主要促进Wtp53的HR抑制功能，即克服HR刺激。癌基因突变型p53失去了HR抑制，但保留了HR刺激功能，导致重组净增加。

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提出了肿瘤突变型p53导致基因组不稳定的细胞周期蛋白A1诱导机制模型。

动态p53-topo I相互作用是细胞周期蛋白A1诱导重组的机制基础

已知Topo I在aa 302和321之间结合p53(31)即在含有丝氨酸315的区域中，丝氨酸311被磷酸化以响应细胞周期蛋白A1的表达。免疫沉淀实验表明，细胞周期蛋白A1的过度表达促进了topo I和p53之间的物理相互作用（248W）。对于Wtp53，我们注意到相对较弱或短暂的topo-I结合，这与Gobert的观察结果一致等。(31). 细胞周期蛋白A1增强的p53–topo I相互作用在cdks的药理学抑制后减少，尤其是对p53（248W）。因此，我们认为细胞周期蛋白A1/cdk2介导的p53磷酸化能够与topo I形成稳定的复合物，从而导致p53突变细胞的超重组(图9)。

Topo I被认为是一种DNA代谢酶，一种被其他蛋白质定位于DNA损伤的酶，是DNA修复酶招募所必需的。另一方面，拓扑I因其刻痕-闭合活动而具有潜在危险(49). Topo I通过链配对和/或DNA连接解析后的链断裂促进基因重组的启动(50–52). p53，尤其是致癌突变型p53，以前被证明可以刺激topo I松弛活性(54,31)以及topo I双裂解复合物的形成，导致寡核苷酸切除与重组间隙填充耦合(55). 由此，可以想象，在cdk介导的p53磷酸化后，topo I和突变p53之间形成稳定的复合物足以通过补充基因组DNA断裂和topo I的酶激活来不适当地刺激重组酶活性。

p53突变体的功能获得与基因组失稳

众所周知，与癌症相关的p53突变体，包括p53（273H）和p53（248W），不仅失去了抑癌功能，还获得了额外的致癌活性(56). 在这项研究中，我们利用来自p53阴性或突变p53细胞的细胞系统来排除对内源性Wtp53的显性负面影响。p53对基因组不稳定性的增益效应，尤其表现为异常倍性、突变增加和基因扩增率(56–58). 我们和其他人提出topo I介导突变型p53的功能丧失(18,31,41,54). 据我们所知，这是第一份证明细胞周期蛋白A1在表达突变型p53的细胞中刺激DSB触发的HR，但在缺乏p53的电池中没有，这表明细胞获得了功能。这种效应是由cdk2依赖性磷酸化和topo I介导的。细胞周期蛋白A1的过度表达揭示了突变型p53的获得功能，即使是直接比较有突变型p5与无突变型p3细胞的HR频率。这在内源性突变p53被击倒后很明显(补充图2)。

在几种癌症类型中检测到topo I活性增加，并发现与黑色素瘤中p53功能异常相关(49). 由于突变型p53在转录上有缺陷，需要注意的是p53并不是唯一的调节因子细胞周期蛋白A1表达式。相反，当TP53型，替代转录因子，如癌蛋白c-myb、Six1和PML-RARα，可以诱导细胞周期蛋白A1的表达(59–61). 事实上，在包括男性生殖细胞肿瘤在内的几种癌症中检测到细胞周期蛋白A1水平升高(62)，乳腺癌(61)急性髓细胞白血病(63)，而在大多数体细胞中通常受到抑制(图9). 骨髓中靶向细胞周期蛋白A1的转基因小鼠模型提供了细胞周期蛋白B1在急性髓系白血病发病中重要作用的证据(64). 最有趣的是，关于突变型p53和细胞周期蛋白A1对重组的协同效应，Tokumaru及其同事(65)发现两者之间存在负相关细胞周期蛋白A1高甲基化，在头颈部癌症中具有强大的cyclin A1蛋白表达和p53突变。从我们的结果来看，突变型p53被预测会促进细胞周期蛋白A1过度表达肿瘤的基因组不稳定性。

总之，我们已经证明，不同氨基酸处的p53磷酸化对直接DNA修复相关活动有不同的调节作用。我们提供了功能数据，揭示了ATM/ATR靶丝氨酸15在完全使p53下调HR和cdk2依赖性磷酸化激活HR中的作用，在基因组不稳定发生之前在肿瘤发生的早期被激活(66,67). 因此，p53Ser15可能至少部分通过修复调节功能对抗癌屏障做出贡献，事实上，最近体内数据表明丝氨酸15是p53介导的肿瘤抑制所必需的(68). 另一方面，我们提供的证据表明，致癌p53突变蛋白失去了重组修复的激活和抑制之间的平衡，在诸如cyclin A1过度表达的条件下，可能导致突变DNA重排增加，例如基因扩增或杂合性丢失。我们的数据为长期存在的问题提供了新的答案，即基因组不稳定中致癌p53突变体获得功能的机制。

补充数据

补充数据可从NAR Online获取。

【补充资料】

致谢

我们感谢Bernard S.Lopez（法国Fontenay aux Roses）为pCMV-p53（392D）和pCMV-p53（392A）提供质粒SMRAD51嵌合表达质粒和Klaus Römer（德国洪堡/萨尔）。我们感谢Nuray Akyüz和Christine Janz在HR测量方面的初步帮助，并感谢Gisa S.Boehden克隆了pSV53（15A）。这项工作得到了Deutsche Forschungsgemeinschaft（Wi 1376/3-2，Wi 3099/7-1）的支持；巴登-符腾堡（10-1907-Wi-2）Landesstiftung Baden-Württemberg；Mildred Scheel Stiftung für Krebsforschung博士（107744）。本文的开放获取出版费用由德国乌尔姆大学提供。

利益冲突声明。未声明。

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文章来自核酸研究由以下人员提供牛津大学出版社