Leuk研究。作者手稿；PMC 2009年11月1日提供。
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白消安耐药人粒细胞白血病基因表达的改变
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贝尼尼奥·巴尔德斯
1德克萨斯大学安德森癌症中心干细胞移植和细胞治疗系，德克萨斯州休斯顿霍尔科姆大道1515号，邮编77030
大卫·默里
2加利福尼亚州埃德蒙顿大学大道11560号跨癌研究所T6G 1Z2
拉莎·拉姆达斯
三德克萨斯大学安德森癌症中心研究信息系统和技术服务，德克萨斯州休斯顿霍尔科姆大道1515号，邮编77030
马科斯·德利马
1德克萨斯大学安德森癌症中心干细胞移植和细胞治疗系，1515 Holcombe Blvd，Houston，TX 77030
罗伊琼斯
1德克萨斯大学安德森癌症中心干细胞移植和细胞治疗系，德克萨斯州休斯顿霍尔科姆大道1515号，邮编77030
史蒂文·科恩布劳
1德克萨斯大学安德森癌症中心干细胞移植和细胞治疗系，德克萨斯州休斯顿霍尔科姆大道1515号，邮编77030
丹尼尔·贝当古
1德克萨斯大学安德森癌症中心干细胞移植和细胞治疗系，德克萨斯州休斯顿霍尔科姆大道1515号，邮编77030
杨丽
1德克萨斯大学安德森癌症中心干细胞移植和细胞治疗系，德克萨斯州休斯顿霍尔科姆大道1515号，邮编77030
理查德·尚普林
1德克萨斯大学安德森癌症中心干细胞移植和细胞治疗系，德克萨斯州休斯顿霍尔科姆大道1515号，邮编77030
博杰·S·安德森
1德克萨斯大学安德森癌症中心干细胞移植和细胞治疗系，德克萨斯州休斯顿霍尔科姆大道1515号，邮编77030
1德克萨斯大学安德森癌症中心干细胞移植和细胞治疗系，德克萨斯州休斯顿霍尔科姆大道1515号，邮编77030
2克罗斯癌症研究所，加利福尼亚州埃德蒙顿大学大道11560号，邮编：T6G 1Z2
三德克萨斯大学安德森癌症中心研究信息系统和技术服务，德克萨斯州休斯顿霍尔科姆大道1515号，邮编77030
*德克萨斯州休斯顿霍尔科姆大道1515号0423室UT MD安德森癌症中心干细胞移植与细胞治疗部通讯作者，邮编77030，电话：（713）794-5743，传真：（712）794-4902，电子邮件：gro.nosrednadm@nossrednab 摘要
Busulfan（Bu）耐药性是慢性或急性粒细胞白血病（CML或AML）患者造血干细胞移植（HSCT）的主要障碍。我们使用基因表达分析来确定导致Bu抗性的细胞因子。建立了两株耐药白血病细胞系，并对其差异表达基因进行了鉴定和分析。CML B5/Bu2506细胞对Bu的抗性是其亲本B5细胞的4.5倍。反洗钱KBM3/Bu2506这些细胞比KBM3亲本细胞的抗Bu能力高4.0倍。这两个耐药亚系通过改变CHK2和CDC2蛋白的调节来逃避Bu介导的G2受体和凋亡，这些蛋白是组成性上调的抗凋亡基因(BCL-X公司L（左）,BCL2级,BCL2L10型,BAG3型和IAP2/BIRC3)和下调的促凋亡基因(自行车,BNIP3号机组、和长期BR). Bu诱导的细胞凋亡部分由半胱氨酸蛋白酶的激活介导；抑制剂Z-VAD-FMK的使用完全消除了PARP1的分裂，并将凋亡减少了约50%。此外，这些细胞中的Bu抗性可能部分归因于HSP90蛋白的上调和STAT3的激活。格尔德霉素对HSP90的抑制作用减弱磷酸化STAT3并生成B5/Bu2506和KBM3/Bu2506对Bu更敏感。对分类为临床耐药或对高剂量基于Bu的化疗敏感的患者的细胞进行分析表明，基因表达的改变类似于体外模型细胞系，证实了该模型与Bu耐药性的潜在临床相关性。
关键词：白消安、髓系白血病、耐药性、凋亡、HSP90
引言
近几年来，以高剂量白消安（1,4-丁二醇二甲基磺酸盐）为基础的造血干细胞移植（HSCT）调理疗法越来越受到重视，主要用于髓系恶性肿瘤的治疗。一种肠外制剂进一步激发了人们对以白消安（Bu）为基础的移植前治疗的兴趣，该制剂避免了口服Bu不可预测的吸收和可变的生物利用度，而口服Bu与严重且往往致命的静脉闭塞性疾病的高发病率有关[1–4]. 用氟达拉滨替代环磷酰胺并联合Bu进一步改善了临床安全性，而抗白血病活性没有明显损失[5,6]. 尽管如此，复发性白血病仍然是患者生存的障碍。复发性白血病通常归因于布鲁氏菌耐药性，尽管宿主和白血病细胞衍生因素都可能导致治疗失败。基于药代动力学的个体化治疗剂量指导已被用于优化全身Bu暴露，以提高治疗安全性并降低复发白血病的风险。我们假设，由于遗传决定的白血病细胞耐药性，一些患者可能会复发。如果能够识别和验证适当的Bu耐药性细胞生物标记物，它们可能会被用于识别白血病对高剂量Bu不敏感的患者。更好地了解细胞对Bu耐药性的分子机制，也应该有助于制定策略来规避这种耐药性，或者，可能患有Bu耐药性白血病的患者可以接受不同的治疗。
细胞对各种DNA-烷基化剂的耐药性可能是多因素的，一些耐药机制，如凋亡改变，可能是常见的。然而，其他机制可能是诱导剂特有的。例如，上调MGMT公司基因赋予对1,3-双（2-氯乙基）亚硝基脲的抗性[7]和过度表达ALDH1型基因导致细胞对氮杂磷的耐药性[8,9]. 在HSCT中越来越多地使用基于烷基化剂的调节疗法，并且这种化疗的临床耐药性问题一直存在，因此有必要建立具有临床相关耐药性程度的人类细胞系模型，以促进机理研究。
以Bu为原型烷基化剂，我们建立了细胞系模型，以确定信号转导途径和可能与耐药表型相关的基因表达改变。我们发现，双亲药敏细胞的Bu暴露导致G2受体和广泛凋亡；相反，耐药细胞显示Bu诱导的G2-受体和凋亡水平显著降低。此外，耐药细胞的特征是CDC2、抗凋亡蛋白、HSP90和活化STAT3的显著结构性过表达。通过测定急性髓细胞白血病（AML）患者细胞样本中相应的基因表达水平来评估这些结果的潜在临床相关性，这些患者临床上被认为对高剂量丁类药物治疗无效或敏感。此通信报告了此的详细信息在体外Bu-resistance模型，强调可能具有临床相关性的发现。
材料和方法
细胞和药物
所用细胞系为KBM7/B5（“B5”），是KBM7慢性髓细胞白血病（CML）细胞系的克隆亚系[10,11]和KBM3，一种AML细胞系[12]. 建立了如下所述的耐药细胞系。从新泽西州爱迪生市PDL BioPharma获得6 mg/ml Bu（Busulfex™）在33.3%二甲基乙酰胺和66.7%聚乙二醇400溶剂中的储备溶液。将凝胶霉素（GA；Invivogen，San Diego，CA）溶解在二甲基亚砜（DMSO）中。在每个实验中，将细胞暴露于不同浓度的Bu或GA，使溶剂量相等。同时，作为阴性对照，细胞暴露于对应于最高Bu或GA浓度的溶剂量。
Bu耐药细胞系的建立
将细胞生长到对数期，用含有0.1%葡萄糖的PBS洗涤，并重悬于无血清Iscove改良Dulbecco培养基（IMDM；Sigma，St.Louis，MO）中。5×10培养基6将细胞暴露1 h，逐渐将Bu浓度从25µg/ml增加到250µg/ml。每次暴露后，在含有0.1%葡萄糖+1%胎牛血清（FBS）的冷冻PBS中清洗，然后将细胞重新悬浮在含有20%FBS（完整IMDM）的IMDM中，并在37°C的5%CO增湿环境中培养2在空气中放置2-3周，或直到恢复正常的倍增时间和>98%的存活率。每种药物浓度下的暴露重复3次。在最终药物浓度为250µg/ml时，将细胞暴露六次。细胞系称为B5/Bu2506和KBM3/Bu2506.
细胞毒性测试
电池（1×106/ml）暴露于37°C下不同浓度的Bu中1 h，并如上所述进行清洗。然后将细胞重新悬浮在2×10的完整IMDM中5/ml和等量（20000/孔）置于96个平板中，如上所述在37°C下培养4天，并通过MTT分析进行分析[13]. 图形分析，包括IC计算50使用Prism 4（GraphPad软件，加利福尼亚州圣地亚哥）完成。
荧光激活细胞分选仪（FACS）分析
将细胞暴露于37°C下的Bu中1 h，清洗并重新悬浮在完整的IMDM中，如上所述。在药物或溶剂暴露和48小时恢复后，将细胞离心，再悬浮在70%乙醇中，并在−20°C下固定过夜。将固定细胞在3000×g室温下制成丸，用PBS洗涤，并用0.25 ml 500 U/ml RNAse A在37°C含有1.12%柠檬酸钠的PBS中处理30 min。添加0.25 ml碘化丙锭（PI，50µg/ml）后，在进行FACS分析之前，将细胞置于弱光下至少1 h。使用BD FACSCalibur和CellQuest™软件（Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ）分析至少10000个细胞的细胞DNA含量。使用ModFit LT（Verity Software House，Topsham，ME）分析直方图。
FACS还用于检测细胞凋亡（5×105/ml）暴露于不同浓度的TNF-相关凋亡诱导配体（TRAIL；BIOMOL国际，普利茅斯会议，PA）。用Annexin V-FLUOS染色试剂盒（印第安纳波利斯罗氏诊断公司）测定凋亡细胞中磷脂酰丝氨酸的外化。通过排除膜联蛋白V染色细胞中的PI，同时评估膜完整性。
微阵列分析
使用TRIzol™试剂提取RNA（Invitrogen，Carlsbad，CA），用DNAse I处理，并使用RNeasy试剂盒（Qiagen，Valencia，CA）纯化RNA。在1%琼脂糖甲醛凝胶上测定其纯度，然后进行溴化乙锭染色。TrueLabeling-AMP™线性RNA扩增试剂盒（SuperArray Bioscience，Frederick，MD）用于合成生物素化反义RNA作为杂交探针。使用ArrayGrade™cRNA清理试剂盒（SuperArray）纯化RNA探针，并用分光光度法测定浓度。
寡核苷酸GEArray®膜（SuperArray）经过预杂交，与RNA探针杂交，并按照制造商的说明开发用于化学发光检测。使用密度计扫描X射线胶片上的信号，并使用ImageQuant软件（均来自新泽西州皮斯卡塔韦的GE Healthcare Bio-Sciences）和SuperArray分析套件进行分析。
实时PCR
使用高容量cDNA档案试剂盒（Applied Biosystems，Foster City，CA）合成cDNA。使用Taqman探针或SYBR Green-based分析法和7500 Real time PCR System（Applied Biosystems）进行实时PCR扩增。通过比较C进行基因表达的量化T型方法（即荧光增加为对数的阈值周期数）；这个ABL1公司该基因被用作内源性控制。根据微阵列分析结果，选择实时PCR分析的基因。
Western Blot分析
对数生长期细胞（1×106细胞/ml）模拟暴露或脉冲暴露于37°C的Bu 1小时。然后用含有0.1%葡萄糖+1%FBS的PBS洗涤细胞，并如上所述在37°C的完全IMDM中恢复48小时。然后离心，再悬浮在PBS中，用Laemmli缓冲液溶解并煮沸5分钟。使用抗β-肌动蛋白抗体进行免疫斑点分析，对Laemml缓冲液中的蛋白质量进行归一化。对β-肌动蛋白信号进行密度分析，并适当调整蛋白质浓度。布拉德福德方法[14]还用于测定某些细胞提取物的蛋白质浓度。
通过在聚丙烯酰胺SDS凝胶上分离蛋白质提取物并在Hybond ECL膜（GE Healthcare）上印迹进行蛋白质印迹分析。使用ECL+Western印迹检测系统（GE Healthcare）和SuperSignal West Pico/Dura底物（Pierce，Rockford，IL）通过化学发光进行免疫印迹分析。所有抗体及其来源和其他相关信息均列于.
表1
| 抗原 | 来源/类别# | 克隆类型* | 稀释** |
|---|
|
|---|
| BCL-XL型 | 圣克鲁斯生物技术公司/8392 | 单克隆抗体 | 500 |
| 投标 | 细胞信号学/2002 | 个人通讯簿 | 1000 |
| BNIP3号机组 | Abcam/Ab10433 | 单克隆抗体 | 1000 |
| 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 | 细胞信号/9662 | 个人通讯簿 | 1500 |
| 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8 | 细胞信号/9746 | 单克隆抗体 | 1500 |
| CDC2（CDC2） | 细胞信号/9112 | 个人通讯簿 | 1500 |
| 热休克蛋白90 | 阿克索拉/ALX-804-078 | 单克隆抗体 | 1500 |
| 第14页ARF | 圣克鲁斯生物技术公司/8613 | pAb（山羊） | 500 |
| 第21页 | Upstate Biotech公司/05-345 | 单克隆抗体 | 1000 |
| 第53页 | 圣克鲁斯生物技术公司/1315 | 个人通讯簿 | 1000 |
| 第1部分 | 圣克鲁斯生物技术公司/8007 | 单克隆抗体 | 1000 |
| P-CDC2（Thr14） | 细胞信号传导/2543 | 个人通讯簿 | 1500 |
| P-CDC2（Tyr15） | 细胞信号/9111 | 个人通讯簿 | 1500 |
| P-CHK2（Thr68） | 细胞信号传导/2661 | 个人通讯簿 | 1500 |
| P-STAT3（Tyr705） | 细胞信号/9131 | 个人通讯簿 | 1000 |
| 英国皇家空军1号 | 圣克鲁斯生物技术公司/133 | 个人通讯簿 | 500 |
| STAT3（状态3） | 细胞信号/9132 | 个人通讯簿 | 1000 |
| β-肌动蛋白 | 西格玛/A5316 | 单克隆抗体 | 10000 |
| γ-H2AX | Upstate Biotech公司/05-636 | 单克隆抗体 | 1000 |
半胱天冬酶的抑制
用DMSO或40µM Z-VAD-FMK（Axxora，LLC，San Diego，CA）预处理细胞1 h，然后在37°C下脉冲暴露于Bu 1 h，并如上所述进行清洗。让细胞在37°C下在含有DMSO或40µM Z-VAD-FMK的完整IMDM中恢复48 h，并通过Western blot和PI染色进行分析，然后进行FACS分析。
抑制HSP90
用DMSO或2µM GA在37°C、5%CO条件下处理细胞16小时2用PBS/0.1%葡萄糖洗涤细胞，再悬浮在无血清IMDM（1×10）中6细胞/ml），在37°C下脉冲暴露于Bu 1小时，并如上所述进行清洗。在完全IMDM中恢复48小时后，用上述FACS、MTT分析和Western blot分析细胞。
患者细胞样本
从MD Anderson癌症中心的AML细胞样本核心库中获取静脉注射含溴预移植治疗的AML患者外周血或骨髓中的单核细胞样本。样本被指定为来自“临床敏感”或“临床耐药”患者；HSCT后完全缓解（CR）的患者或在CR中接受HSCT的患者，在HSCT后至少在CR中生存一年，或者在CR中存活，或者后来死于与白血病进展无关的原因的患者被视为临床敏感患者。AML活动期患者如果接受移植，但未达到CR，或虽达到CR但在最初100天内复发，则被视为具有临床耐药性。所有分析的移植前细胞样本中至少含有95%的白血病细胞。CD34+细胞（正常对照）取自一名健康志愿者，该志愿者在外周血分离CD34+淋巴细胞前接受了4天的非格司汀治疗。在“Isolex”机器（加利福尼亚州奥本Miltenyi Biotec）中使用CD34+选择柱对该细胞产物进行富集。如上所述，使用TRIzol™从这些细胞样品中分离总RNA。
结果
Bu耐药细胞系的建立及表型鉴定
第一个亲本菌株是KBM7/B5（“B5”），是KBM7的克隆亚系[10]. 通过间歇试验建立了一个抗Bu亚系体外如上所述，B5细胞暴露于逐渐增加的药物浓度。使用MTT分析，Bu耐药和敏感亚系具有IC50值分别为180µg/ml和40µg/ml Bu，B5/Bu250的抗性指数约为4.56单元格(). 克隆形成试验也得到了类似的结果（数据未显示）。B5/Bu250的这种表型抗性6细胞已经被保存了四个多月体外在没有药物暴露的情况下通过（数据未显示），表明基因型稳定性。B5/Bu250的电阻6细胞对Bu的生长速度没有改变；B5和B5/Bu250的倍增时间约为22小时6细胞表明B5/Bu250缺乏生长优势6细胞在没有药物的情况下。
丁砜（Bu）敏感和耐药细胞系的特性（A，B）用指示浓度的Bu在37°C下对细胞进行脉冲处理1 h，清洗，并以20000个细胞/孔的速度电镀。4天后，用MTT法分析细胞增殖情况。这些数据代表了溶剂单独对照的平均5个重复。P值通过配对t检验获得。（C） 细胞周期分析是通过在37°C下用溶剂或180µg/ml Bu脉冲细胞1小时来完成的。然后清洗细胞并使其恢复2天。细胞用碘化丙啶染色，通过流式细胞术进行分类，并使用ModFit LT™程序进行分析。（D） 使用两个亲本细胞系B5和KBM3及其各自的抗Bu亚系，在不同浓度的Bu下对面板C进行相同的程序。细胞周期分析用于比较Bu敏感和耐药细胞的G2/G1比率。（E） 将细胞脉冲暴露于不同浓度的Bu或单独溶剂中1 h，使其恢复2天，并通过Western blot免疫染色分析细胞周期相关蛋白的表达（上图）。使用密度计扫描胶片，并计算每个治疗的P-CDC2（Tyr15）/CDC2比率。使用获得的比率，然后针对每个细胞系（下面板）相对于仅溶剂对照（即0µg/ml Bu）测定P-CDC2（Tyr15）的水平。从三个独立的Western blot分析中获得平均值和标准偏差。
使用类似的间歇性暴露逐渐增加Bu浓度的方案，从人类AML细胞系KBM3建立了一个Bu耐药细胞系[12].比较KBM3和KBM3/Bu250的存活率6Bu暴露后的细胞。抗Bu子线有一个IC50260µg/ml，并且亲代细胞表现出IC5065µg/ml()，表明与B5模型类似的阻力指数约为4.0().
众所周知，白消安能使细胞停滞在细胞周期的G2期[15,16]. 确定Bu如何影响B5和B5/Bu250的细胞周期6细胞、PI染色和FACS分析。将细胞暴露于180µg/ml Bu中1 h，并在完全IMDM中恢复48 h。观察到在G2中滞留的细胞比例存在显著差异，如%G2-期/%G1-期（G2/G1）比率所示；B5细胞的G2/G1比率为5.3，而B5/Bu2506细胞的G2/G1比率为0.7(). 在KBM3模型中也获得了类似的结果(). 此外，约35%的暴露于Bu的B5细胞发生了凋亡，表现出亚G1 DNA含量的细胞比例表明了这一点。暴露后24小时未观察到细胞凋亡（数据未显示）；因此，所有后续分析均在Bu暴露48小时后进行。相比之下，B5/Bu2506暴露于相同药物浓度48小时后，培养物显示出较少的亚G1 DNA含量/细胞凋亡(). 注意，在MTT试验中，这种药物暴露会导致80%以上的亲本B5细胞和大约50%的B5/Bu250细胞丧失生存能力6单元格(). 有趣的是，与Bu暴露的B5/Bu250中没有半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶和PARP1裂解相反6细胞（见下文），这些细胞中仍有残留的亚G1信号().
在等细胞毒性药物浓度和治疗后48小时，B5和B5/Bu2506细胞的G2/G1比率与对照组相比略有不同(). 在40µg/ml Bu下，B5细胞的G2/G1比率为1.1，而B5/Bu2506当Bu浓度为180µg/ml时，细胞的G2/G1比率为0.7。在KBM3细胞模型中也得到了类似的结果；G2/G1比值为1.9（KBM3）和1.6（KBM3/Bu2506)分别暴露于65µg/ml和260µg/ml Bu后48小时(). 在180µg/ml Bu和暴露后48小时的相同药物浓度下，B5和B5/Bu2506细胞的G2/G1比值分别为5.3和0.7。KBM3和KBM3/Bu250在250µg/ml Bu下的类似暴露6细胞的G2/G1比率分别为4.0和1.6(). 两种抗Bu细胞系相对于其敏感亲代细胞的G2/G1比率较低，这可能暗示了B5/Bu250中逃避G2受体和凋亡的共同机制6和KBM3/Bu2506细胞。
为了进一步了解人类髓系白血病细胞中Bu介导的G2受体的机制，我们检测了各种细胞周期相关蛋白的表达。CDC2，G2/M期的关键蛋白[17]在两种Bu耐药细胞系中均呈结构性上调(，上部面板）。因为Thr14和Tyr15处CDC2的磷酸化是G2受体的标志[18]，我们测定了Bu对每个细胞系中P-CDC2水平的影响（相对于溶剂单独对照）。总的来说，耐药细胞中P-CDC2的水平较高，但与Bu耐药细胞相比，Bu暴露导致Bu敏感B5和KBM3细胞中Thr14和Tyr15处CDC2的磷酸化发生更剧烈的变化。将B5细胞暴露于40µg/ml Bu，这与其IC相对应50值，导致P-CDC2（Tyr15）相对于单独溶剂对照增加约4倍；在暴露于65µg/ml Bu的KBM3中观察到P-CDC2（Tyr15）的类似增加(，下部面板）。两个Bu抗性细胞系暴露于Bu没有导致P-CDC2（Tyr15）或P-CDC2（Thr14）水平的显著变化。为了确定可能有助于抑制CDC2激酶磷酸化的上游因子，我们检测了Thr68处磷酸化CHK2的水平，已知Thr68可使作用于P-CDC2的CDC25磷酸酶失活[19]. 与B5/Bu250相比，B5和KBM3细胞暴露于Bu后在更大程度上增加了P-CHK2（Thr68）的相对水平6和KBM3/Bu2506(，上部面板）。我们的数据表明，敏感细胞暴露于Bu导致P-CHK2/CDC25/P-CDC2通路激活，导致G2细胞周期阻滞。在Bu耐药细胞中，同样的通路被激活的程度较低，除了CDC2的上调外，这可能解释了它们逃避G2受体的能力。
药物暴露的B5/Bu250缺乏胱天蛋白酶激活6细胞
如所示，Bu对亲代B5细胞的细胞毒活性在很大程度上是由于凋亡途径的激活，如G1以下DNA含量的细胞数量所示。相反，抗性B5/Bu2506在相同的药物暴露水平下，细胞有效地回避了这种反应。细胞凋亡与DNA损伤触发的蛋白水解酶的激活密切相关[20,21]. 因此，我们寻求证实和进一步深入了解减轻的细胞凋亡在B5/Bu250的Bu抗性表型中的作用6通过检测两种关键凋亡蛋白caspases3和caspases8的切割/激活来检测细胞。中的数据表明经Bu（40和180µg/ml，1 h）处理的B5细胞中caspase 3和8的广泛剂量依赖性激活，如暴露后48 h的裂解产物所示。相反，在B5/Bu250中很少或没有caspase裂解6暴露于相同Bu浓度下的细胞。在暴露于Bu的KBM3细胞中观察到caspase 3和8的类似激活，但在KBM3/Bu250中这种作用同样不明显6单元格（数据未显示）。这种半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的激活与暴露于Bu的亲代细胞中PARP1蛋白的显著裂解有关()和碱性彗星实验测量的DNA碎片（数据未显示）。组蛋白2AX（H2AX，). B5/Bu250的暴露6相同药物浓度的细胞导致PARP1裂解显著减少，H2AX磷酸化程度最低().
半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶参与白消安介导的细胞凋亡（A和B）通过Western blot分析之前用白消安（Bu）脉冲处理过的细胞中的总细胞提取物（有或无Z-VAD-FMK暴露）。（C） 用40µM Z-VAD-FMK预处理B5细胞1h，脉冲暴露于180µg/ml白藜芦丹或其溶剂1h，在40µM Z-VAD-VMK存在或不存在的情况下恢复48h，并通过碘化丙啶染色和流式细胞术进行分析。使用ModFit LT™软件测定细胞周期不同阶段的细胞比例（包括凋亡细胞）。（D） 将细胞暴露于不同浓度的TRAIL中18 h，用流式细胞术检测Annexin V阳性细胞。该图表示三个独立实验的平均值，并使用非配对t检验计算P值。
因此，暴露于Bu会触发Bu敏感细胞中caspase 3和8的激活、PARP1裂解、DNA链断裂和H2AX磷酸化。然而，也许最有趣的发现是，暴露于IC后，Bu耐药细胞中实际上没有凋亡激活50药物浓度（180或260µg/ml Bu）。这一发现表明，在耐药细胞中观察到的Bu诱导的细胞毒性是由凋亡以外的机制介导的。
据报道，Bu选择性地诱导WI38成纤维细胞衰老而非凋亡[22]. 我们试图确定暴露于Bu的抗Bu细胞是否会加速衰老。然而，对衰老相关p14ARF的表达和β-半乳糖苷酶染色的分析表明，未经处理和经处理（180µg/ml Bu）的Bu耐药细胞之间没有任何差异。
抑制剂Z-VAD-FMK对胱天蛋白酶激活的抑制作用
使用抑制剂Z-VAD-FMK证实了半胱天冬酶在两种细胞系模型中Bu介导的凋亡中的作用。在用40µM Z-VAD-FMK预处理1 h的细胞中，显示出caspase介导的PARP1裂解受到显著抑制，随后暴露于Bu 1 h，并且在含有40µM Z-VAD-VMK的完整IMDM中48 h恢复。FACS分析显示，在Z-VAD-FMK暴露的B5细胞中，Bu诱导的凋亡减少了约50%(). 细胞凋亡的部分抑制()尽管PARP1分裂几乎完全消失()提示胱天蛋白酶非依赖性途径有助于细胞死亡。
B5/Bu250缺乏Bu介导的半胱天冬酶激活6细胞提示可能对TRAIL或Apo2L产生交叉耐药性。事实上，B5和B5/Bu250的治疗6含有0.05µg/ml TRAIL的细胞18小时后，Annexin V阳性细胞分别为87%和14%。TRAIL浓度增加10倍不会引起B5/Bu250的显著凋亡6单元格(). KBM3模型也获得了类似的结果（数据未显示）。虽然TRAIL信号通路最初可能与Bu介导的凋亡不同，但结果表明caspase的激活不足可能是一个共同特征，因此可以解释B5/Bu250的耐药性6和KBM3/Bu2506TRAIL或Bu存在时细胞凋亡。
基因表达谱分析
为了进一步了解Bu抗性的机制，我们鉴定了B5与B5/Bu250中差异表达的基因6单元格，以及KBM3与KBM3/Bu2506使用SuperArray的凋亡特异性基因表达谱系统，在无药物暴露的情况下使细胞处于稳定状态。实时PCR和Western blot分析用于确认微阵列结果。显示了与Bu敏感细胞相比，Bu耐药细胞中凋亡相关基因表达的主要差异。在mRNA水平上，促凋亡基因的差异最大自行车,TNFSF7公司,BNIP3号机组,长期BR,投标、和BAK1系列在Buresistant B5/Bu250中均下调6细胞。自行车,BNIP3号机组和长期BR也被下调，而TNFSF7公司,投标和BAK1系列KBM3/Bu250未发生变化或略有上调6细胞。在两个Bu耐药株系中上调的抗凋亡基因包括IAP2/BIRC3,BAG3型,BCL2L10型,BCL-X公司L（左）、和BCL2级().
表2
实时RT-PCR检测与Bu敏感亲本系相关的Bu耐药细胞中差异表达的凋亡基因。
暴露和不暴露Bu的促凋亡和抗凋亡蛋白水平
在mRNA水平上确定了关键凋亡调节基因组成型表达的主要差异后，我们试图确定相应的蛋白质水平以及它们如何受到Bu暴露的影响。我们使用接近IC的浓度分析模拟或暴露于Bu的细胞50数值：B5为40µg/ml，B5/Bu250为180µg/ml6KBM3为65μg/ml，KBM3/Bu250为260μg/ml6.显示促凋亡蛋白BNIP3和BID的结构性下调和抗凋亡蛋白BCL-X的上调L（左）在抗Bu的B5/Bu250中6细胞。BNIP3和BCL-X的蛋白质水平L（左）而非BID，在KBM3/Bu250中显示类似的模式6细胞。这种模式与观察到的mRNA水平相似().
凋亡相关蛋白的表达水平在提取总蛋白和蛋白质印迹分析之前，将细胞脉冲暴露于指示浓度的白消安（Bu）1小时，并允许其恢复48小时。
如所示，BNIP3蛋白在两个亲本细胞系中都有强烈的组成性表达，但在Bu暴露后没有诱导，并且在抗性细胞中基本上不存在。BCL-X公司L（左）该蛋白表现出相反的模式，在抗性细胞中强烈表达，而在Bu暴露后未被诱导，并且在亲本细胞系中基本上不存在。另一种促凋亡蛋白BID的表达不是由Bu诱导的，但与B5/Bu250相比，在B5中的表达更高6细胞。令人惊讶的是，BID在mRNA和蛋白质水平上均上调(和)单位：KBM3/Bu2506细胞和这一发现的表型含义尚不清楚。CDK抑制剂p21/WAF1/Cip1/CDKN1A在B5/Bu250中上调6细胞和暴露于Bu进一步诱导其表达。正如B5/Bu250中p53的低表达所表明的那样，p21的诱导是p53依赖性的6Bu存在时的细胞和p53诱导缺失(). B5/Bu250中p21表达的诱导性6细胞可能是高浓度Bu抑制细胞生长的原因()与B5亲代细胞系相比，与较少的凋亡相关(和). 在KBM3细胞系模型中p21的表达表明了不同的机制。而在KBM3/Bu250中，p21和p53蛋白均显著上调6这两种蛋白的表达不受Bu暴露的诱导。
HSP90在Bu耐药细胞中的过度表达与Bu耐药
对这些细胞系中生存相关蛋白表达的进一步分析表明，B5/Bu250中HSP90蛋白的结构性上调6和KBM3/Bu2506单元格()相对于亲本细胞系。实时RT-PCR对HSP90 mRNA的分析表明，Bu敏感细胞和Bu耐药细胞之间没有任何显著差异，这表明HSP90的表达受到转录后控制。在任何细胞系中，暴露于Bu均不能诱导HSP90（数据未显示）。为了确定这种组成性上调是否有助于Bu耐药性，细胞在37°C下预先暴露于2µM GA（HSP90抑制剂）16小时[23]. 在我们的实验条件下，分析RAF-1蛋白水平以确定GA是否干扰HSP90的功能。RAF-1是HSP90的客户蛋白，HSP90的抑制会导致RAF-1的错误折叠和降解[24].显示B5/Bu250的暴露6细胞对GA的反应导致RAF-1消失，表明HSP90活性受到有效抑制。暴露于GA前，B5/Bu250的Bu敏感性部分恢复6()和KBM3/Bu2506（数据未显示）PARP1裂解（cPARP1). 细胞周期分析显示GA暴露的B5/Bu250的G2期阻滞明显6和KBM3/Bu2506暴露于250和300µg/ml Bu后的细胞(). GA预暴露使G2/G1比率增加14倍，亚G1细胞比例增加3倍(). 这些结果强烈表明，细胞HSP90活性的破坏部分恢复了耐药细胞对Bu的敏感性。在150µg/ml Bu存在下，GA暴露的Bu抗性细胞的存活率降低了2倍，这进一步支持了这一解释(). 总的来说，这些发现表明B5/Bu250中的Bu抗性6和KBM3/Bu2506细胞的部分原因可能是HSP90的结构性过度表达。
HSP90和STAT3有助于B5/Bu250的抵抗6和KBM3/Bu2506白藜芦丹细胞（Bu）（A） Western blot分析显示与亲代细胞系相比，Bu耐药细胞中HSP90的结构性过表达。（B） 将细胞暴露于二甲基亚砜或2µM格尔德霉素（GA）过夜以抑制HSP90活性，并使用部分细胞通过Western blot分析测定RAF1蛋白水平。在（B）提取总蛋白和进行裂解PARP1（cPARP1）的Western blot分析、（C）细胞周期分析和（D）增殖分析之前，将预处理细胞的剩余部分脉冲暴露于指示浓度的Bu中1 h，并使其恢复2天。结果显示，存活率（D）是三个独立实验的平均值，P值是使用非配对t检验确定的。（E） 抗Bu药物B5/Bu250中STAT3蛋白的组成性上调表达6和KBM3/Bu2506与亲代细胞系相关的细胞。隔夜暴露于2µM GA可抑制Bu耐药细胞中Tyr-705处STAT3（P-STAT3）的磷酸化。
为了确定HSP90介导的Bu耐药和髓系白血病细胞存活的可能机制，我们比较了Bu敏感和耐药细胞中STAT3的表达水平。最近的一份报告将HSP90和STAT3与骨髓瘤细胞的耐药性和存活率联系起来[25].在B5/Bu250中均显示STAT3蛋白的结构性表达显著上调6和KBM3/Bu2506细胞与其亲代细胞进行比较。然后，我们检测了暴露于GA的Bu耐药细胞中STAT3蛋白的激活。表明GA对HSP90活性的抑制与磷酸化STAT3水平的降低有关，而总STAT3的水平在这些条件下受到的影响最小。减弱的STAT3和HSP90活性可能有助于观察到的B5/Bu250对Bu敏感性的恢复6和KBM3/Bu2506细胞。
临床材料中的基因表达研究
为了确定这些结果的可能临床相关性，我们使用实时PCR来确定BNIP3号机组,自行车,BCL-X公司L（左）,第21页/CDKNIA,热休克蛋白90和STAT3（状态3）临床敏感（n=6）和耐药（n=5）患者衍生细胞样本（参见材料和方法用于对获得这些样本的患者进行分类）。比较它们的中位相对值显示促凋亡的下调BNIP3号机组和自行车在耐药细胞样品中和抗凋亡的上调BCL-X公司L（左）和第21页/CDKN1A()，发现与使用细胞线模型获得的结果一致().热休克蛋白90和STAT3（状态3），在抗Bu B5/Bu250中上调6和KBM3/Bu2506单元格()，可能在难治性患者白血病细胞中的表达水平略高于敏感患者样本。
使用临床敏感或耐药AML患者样本进行基因表达分析使用从患者细胞样本中提取的总RNA制备cDNA，并通过实时RT-PCR分析特定基因的表达。条形图显示每组患者样本的中值（A）。中位数和平均值汇总在面板B中。
讨论
临床“耐药”是HSCT后髓系白血病长期控制的主要障碍。大部分移植后获得CR的高危AML和CML患者最终复发，这表明白血病细胞的次理想/不完全根除有助于白血病复发。已经证明，较高强度的移植前预处理程序可以提高无病生存率[26]. 布氏菌治疗是应用最广泛的条件疗法之一，布氏菌耐药性是HSCT中的一个问题。作为一种双功能烷基化剂，已知Bu会引起DNA链内和链间交联[27,28]. 其细胞毒性作用的分子机制，以及更重要的是，肿瘤细胞对该药物产生耐药性的潜在机制尚不清楚。我们假设，更好地了解由基因决定的细胞对烷基化剂的耐药机制将提高我们控制恶性肿瘤/白血病的能力。虽然我们认识到对DNA-烷基化试剂的耐药性可能是多因素的，并且对各种细胞毒性试剂的交叉耐药性是可能的，但了解与赋予表型耐药性有关的细胞机制很重要。也许可以操纵这些机制来提高治疗反应。或者，可以使用相关的替代耐药标记来跟踪耐药细胞群体随时间的发展，也可以为携带耐药基因标记的患者提供替代治疗方式。
为了剖析导致细胞对Bu耐药的遗传机制，我们通过间歇性暴露于递增药物浓度的髓系白血病细胞系B5和KBM3建立了细胞系模型[10,12]). 这种方法已被广泛用于诱导细胞对DNA-烷基化剂（包括美芬）的耐药性[29,30]，环磷酰胺[31]，和2-氯乙基-N个-亚硝基菌[32]. 这一过程产生了与母系相比具有临床相关程度的Bu耐药性的细胞系(). 根据我们的结果和之前公布的其他DNA-烷基化剂的研究结果[9,33]，似乎细胞对Bu的抗性是多因素的。在本报告中，我们重点研究了细胞凋亡的改变以及STAT3和HSP90表达的上调作为导致Bu耐药性出现的因素的作用。
我们的数据表明，Bu导致这些髓系白血病细胞的G2细胞周期阻滞和凋亡()，与以前的报告一致[16,34]. 然而，与双亲相比，这两种Bu耐药细胞系的G2阻滞和凋亡反应的幅度都大大降低。因此，当细胞暴露于180–260µg/ml Bu时，与抗Bu亚系相比，在亲代细胞中观察到G2/G1比率的显著增加(). 我们推断，抗Bu细胞逃避Bu介导的G2受体和细胞死亡的能力可能是由于CDC2的上调表达、Thr14和Tyr15处磷酸化的消除和/或参与介导凋亡的基因的差异表达。与模拟处理的对照相比，敏感细胞暴露于Bu导致P-CHK2（Thr68）和P-CDC2（Tyr15）更显著地增加。这两种蛋白质对控制细胞周期的G2期至关重要。Thr68处的磷酸化激活CHK2激酶活性，抑制CDC25磷酸酶活性，导致较高水平的非活性P-CDC2（Tyr15），最终导致G2-受体。相反，耐药细胞暴露于Bu后，这两种蛋白质的磷酸化变化较小(). 这些结果表明，CDC2的低表达和磷酸化增加与Buinduced G2细胞周期阻滞相关，随后可能发生凋亡，而CDC2的高表达和低磷酸化可能使Bu耐药细胞退出G2受体进入有丝分裂，从而逃避细胞凋亡。事实上，这种表型很可能是由观察到的促凋亡基因的结构性下调介导的，包括BNIP3号机组,自行车,长期BR和TNFSF7公司以及抗凋亡基因的上调，包括BCL2级,BCL-X公司L（左）（或BCL2L1型),BAG3型,BCL2L10型和IAP2/比尔3在抗Bu细胞中(和).
Bu介导的导致B5和KBM3细胞凋亡的信号转导事件包括半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3和8的激活，最终导致PARP1断裂和DNA断裂。这种活化在抗性B5/Bu250中不太明显6和KBM3/Bu2506单元格()证实了这些细胞获得了逃避凋亡的能力。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK不能完全阻止B5和KBM3细胞的凋亡()提示Bu通过这些细胞中的其他机制诱导凋亡。事实上，Z-VAD-FMK并未完全抑制H2AX的磷酸化（数据未显示），这表明存在DNA缺口或裂解，可能是由半胱氨酸蛋白酶激活以外的机制介导的。
解释Bu抗性细胞如何逃避Bu介导的毒性的一种可能机制是通过上调应激反应基因。细胞耐受应激条件的能力有助于细胞耐药性[35,36]. 其中一个这样的应激因子是HSP90蛋白，它催化一些促生存蛋白的正确折叠，并且在Bu耐药细胞中显著上调(). 此外，GA对HSP90活性的抑制使B5/Bu2506和KBM3/Bu2506G2/G1比率增加、亚G1期细胞增加、PARP1分裂增加和存活率降低，表明细胞对Bu更敏感(). HSP90客户蛋白包括AKT、RAF1、BCR-ABL、RIP、JAK和细胞周期蛋白依赖性激酶，所有这些都参与细胞生存和凋亡[37,38]. 我们已经确定STAT3信号通路可能是HSP90依赖性通路()这有助于Bu耐药性和髓系白血病细胞存活。这些结果表明磷酸化STAT3的Janus激酶（JAKs）依赖于HSP90活性，这一观察结果与之前关于JAK和HSP90相互作用的报道一致[39]. 其他可能对Bu抗性的发展具有重要意义的特异性HSP90客户端蛋白仍有待鉴定。
这里一个有趣的观察是细胞周期素依赖性激酶抑制剂1A的上调表达(第21页/CDKN1A)B5/Bu250中编码p21或CIP1蛋白的基因6和KBM3/Bu2506单元格(). B5/Bu250中p53表达水平较低6细胞与B5细胞比较()表明第21页/CDKN1A该基因在该细胞系中是p53诱导依赖性的，尽管在KBM3细胞系中明显出现了不同的情况，其中p21和p53在Bu耐药细胞中均呈结构性上调。P21蛋白是细胞周期阻滞对DNA损伤反应的重要效应物[40,41]. 此外，p21的抗凋亡活性归因于其与细胞质中的凋亡信号调节激酶1（ASK-1）结合，从而下调应激诱导的MAPK级联，并介导细胞对基因毒性药物诱导的凋亡的抵抗[42,43]. 在其他耐药白血病和乳腺癌细胞系中也观察到p21上调[44,45]，但这种作用的确切机制尚不清楚。
总之，我们建立了具有临床相关性（即“低度”）和稳定的多因素Bu耐药性的人类髓系白血病细胞系模型。我们已经确定了与凋亡途径改变有关的Bu耐药性的可能遗传生物标记物的表达水平。此外，实验模型和临床衍生样本之间基因表达改变的相似性令人感兴趣，并支持我们的模型的临床相关性，该模型将用于研究Bu耐药性的分子机制。虽然本研究中的少量患者样本证明有必要对更多患者群体的细胞进行前瞻性研究，但我们的结果表明，基因表达谱可能与HSCT治疗计划的一部分相关，最终导致AML患者个体化移植前调节计划。例如，上调热休克蛋白90和STAT3（状态3）临床耐药AML中的基因，类似于其在B5/Bu250中的高表达水平6和KBM3/Bu2506细胞，表明GA或其小分子类似物和STAT3激活抑制剂可以与Bu结合，以在清髓治疗中获得协同细胞毒性。同样，使用反义寡核苷酸、BH3肽和小分子量化学品结合双功能烷基化剂（如Bu）来操纵凋亡信号机制，可能会为高危白血病患者提供更有效的治疗方式。如果在高危AML患者的细胞中建立了Bu耐药基因标记，则可以根据假定的侧支敏感性模式指定替代治疗策略。
致谢
本研究得到了NIH资助P01 CA055164和CCSG核心CA16672以及Stephen L.和Lavinia Boyd白血病研究基金的支持。
脚注
出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们提供这份手稿的早期版本。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。
贡献.B.瓦尔迪兹对概念和设计做出了贡献，并起草了手稿。D.Murray帮助进行了实验设计、数据解释和撰写手稿。L.Ramdas进行了初步的基因筛查和结果分析。M.de Lima、R.Jones和R.Champlin在解释和分析结果以及选择患者样本方面提供了专业知识。S.Kornblau提供了患者细胞样本。D.Betancourt和Y.Li提供了技术支持。通讯作者B.Andersson负责研究方法、资金、数据分析和文章的最终版本。
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