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图1

图1。先证者细胞的FA-特征细胞表型。。来源：与RAD51显性负突变相关的新型范科尼贫血亚型。

(一)添加150和300后染色体断裂的细胞（受刺激的初级淋巴细胞）数量 nM MMC，来自先证者（VU697）和他的健康妹妹（VU730）；P（P）值=0.0001(χ2-测试）。(b条)健康个体（LN9SV）、FANCA缺陷个体（GM6914）和先证者（VU697F_SV40）SV40转化成纤维细胞中自发和MMC诱导的染色体断裂；P（P）值=0.005(χ2-测试）。(c（c）)健康个体（LN9SV）和先证者未经或经50或100治疗的SV40转化成纤维细胞的细胞周期分布 72毫米MMC 小时(d日–（f）)先证者淋巴母细胞经DNA损伤剂治疗后的生长抑制分析。评估淋巴细胞系对MMC、喜树碱和PARP抑制剂KU58948的敏感性。VU697L为先证者淋巴母细胞系，HSC93为野生型对照，VU867L为FANCM缺陷型，VU423L为BRCA2缺陷型，而VU1354L为SLX4缺陷型。误差条表示重复三次实验的标准偏差。

Najim Ameziane等人，Nat Commun。2015;6点8829分。

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2
图2

图2。先证者及其家人的遗传分析。。来源：与RAD51显性负突变相关的新型范科尼贫血亚型。

(一)基因组分析示意图概述。进行了两种类型的分析。（一） 隐性遗传模式（预期为FA，箭头1）和（II）显性遗传模式；从头开始突变（箭头2）。NS-I-SS：非同义、独立、剪接位点变异。(b条)受影响部分的全基因组序列（WGS）数据RAD51系列外显子10在综合基因组查看器（IGV）中显示先证者的杂合变异体（以绿色表示的变异），而在所有其他家族成员中观察到纯合野生型序列（左图）。相同区域和个体的桑格测序结果显示在右侧面板中（用箭头指示的变体）。(c（c）)先证者淋巴母细胞（VU697L；左）和成纤维细胞（VU 697F_SV40；右）互补DNA的Sanger序列数据显示相同的变体（用箭头表示）。(d日)野生型（HSC93）和先证者（VU697L）淋巴母细胞系和野生型（EVA_SV40，FEN_SV40）及先证者永生化成纤维细胞系的全细胞提取物的Western blot分析。用微管蛋白作为负荷控制测定RAD51水平。

Najim Ameziane等人，Nat Commun。2015;6:8829.

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三。
图3

图3。RAD51突变体的功能评估。。来源：与RAD51显性负突变相关的新型范科尼贫血亚型。

(一)诱导细胞模型分析。染色体断裂。与诱导野生型RAD51等位基因（LN9SV+WT）的细胞相比，诱导突变型RAD51等位基因（LN9SV+MUT）表达的细胞在用MMC处理后观察到染色体断裂的细胞数量增加；P（P）值=0.001(χ2-测试）。NT，“无治疗”；MMC，治疗48 小时，50 纳米MMC。(b条)CellTiter-Blue测试。与表达野生型等位基因的细胞（LN9SV+WT）或用空载体转导的野生型细胞（LN9SV+TET）相比，用MMC处理后，表达突变等位基因（LN9 SV+MUT）的细胞的生存能力受到了影响。显示了三个实验的平均值。(c（c）)生长抑制试验（细胞计数）。与表达野生型RAD51等位基因的野生型细胞相比，表达突变RAD51等位基因的野型细胞对MMC敏感。误差条表示重复三次实验的标准偏差。(d日)与中的测试相同c（c）但含有喜树碱（CPT）。两个生长抑制实验均一式三份。(e（电子）)在MMC治疗前后，多西环素诱导突变体（3-6道）和野生型RAD51（7-10道）的表达。通道1和通道2含有来自未转化LN9SV野生型细胞的提取物。以微管蛋白作为对照测定RAD51的水平。(（f）)回复性克隆的分析。桑格序列数据显示突变株丢失RAD51系列相邻基因单核苷酸多态性的等位基因和LOHCASC5公司和DNAJC17公司（左侧面板）。这个DCHS2号机组第4号染色体上的变异保留在两个回复性克隆中（右侧面板）。

Najim Ameziane等人，Nat Commun。2015;6:8829.

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图4

图4。RAD51的生化研究…摘自：与RAD51显性负突变相关的新型范科尼贫血亚型。

(一，左面板）RAD51净化。野生型RAD51和RAD51A293T型纯化后1 μg蛋白质通过含SDS的聚丙烯酰胺凝胶电泳；M、 分子量标记。(一，右侧面板）D-loop分析。测试了D环形成的效率，报告了接头分子形成和DNA链交换活性；箭头1表示游离寡核苷酸，箭头2表示寡核苷酸与同源超螺旋质粒之间的交换产物。(b条)ATP酶测定。野生型和RAD51的ATP酶活性A293T型在没有或存在单链DNA的情况下，使用薄层色谱法进行测量。ATP水解量绘制为时间的函数。误差条表示三个实验的标准误差。(c（c）)EMSA dsDNA。荧光标记双链DNA分子（66 bp）与指示浓度的野生型RAD51或RAD51孵育293吨在存在ATP和Ca的情况下2+并通过天然琼脂糖凝胶电泳。(d日)定量DNA结合百分比作为蛋白质浓度的函数。误差条表示五到七个实验的标准误差。(e（电子）)EMSA ssDNA。荧光标记的单链DNA分子（66 nt）与指示浓度的野生型RAD51或RAD51孵育A293T型在存在ATP和Ca的情况下2+并通过天然聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。(（f）)扫描力显微镜（SFM）。野生型人类RAD51在双链DNA上形成的丝状结构的SFM图像 mM KCl（i）和突变RAD51A293T型（ii）。在30℃条件下双链DNA上形成核蛋白丝的例子 mM KCl通过野生型（iii）和突变型（iv）RAD51。所有图像均为1.5×1.5 μm和高度用0–3范围内的颜色表示 nm，红色到黄色，如比例尺所示。(克)EMSA。在含有指定浓度的野生型和突变体RAD51的反应混合物中，通过EMSA评估双链DNA结合。(小时)EMSA检测到的作为RAD51功能的未结合DNA和蛋白质-DNA复合物百分比的量化A293T型蛋白质浓度。

Najim Ameziane等人，Nat Commun。2015;6:8829.

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5
图5

图5。RAD51与人类疾病的关系。。来源：与RAD51显性负突变相关的新型范科尼贫血亚型。

(一)人类、小鼠和酵母RAD51蛋白的ClustalW比对证明了突变aa的保守性（箭头）。此外，还显示了对DNA结合重要的L1和L2，以及与核苷酸结合有关的Walker A和Walker B区域；突变就在L2环的旁边。(b条)晶体结构沃氏甲烷球菌RADA（MvRadA，古RAD51同源物）已与ATP模拟AMPPNP（PDB 2F1H）和ADP（PDB 3FYH）复合求解，为功能相关的RAD51形式提供了最大的结构洞察力。AMPPNP-一种非水解ATP类似物结合的RAD51二聚体以表面表示形式显示，每个RAD51单体的颜色不同。这表明先证者突变周围的基序（品红色）位于二聚体界面（顶部）。MvRadA中与Ala293等价的残基是甘氨酸（红色），尽管周围的基序高度保守（插入序列比对）。MvRadA核苷酸结合状态的特写视图（右）显示，当与AMPPNP结合时，高亲和力ssDNA-结合状态-包含先证者突变的基序形成一个小的α-螺旋。这个螺旋与结合的核苷酸和Walker A盒（绿色）相互作用。该区域还邻近与ssDNA结合的L2环（L2环末端的球体显示晶体中的无序区域）。相反，当与ADP-低ssDNA-结合状态结合时，先证者的突变基序已从核苷酸和Walker a框转移，并从α-螺旋转变为部分无序环，与AMPPNP状态相比，L2环中出现额外的无序。突变在蛋白质中的位置支持突变影响RAD51蛋白质动力学的观点。(c（c）)动画显示RAD51变化对临床表型的不同影响。显性阴性突变可导致FA样疾病，RAD51的单倍体不足（即低水平）可导致神经系统疾病，而肿瘤中异常的RAD51表达水平与治疗反应有关。

Najim Ameziane等人，Nat Commun。2015;6:8829.

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