本特集介绍了与核酸医药品和寡核苷酸合成相关的事业和研究中有用的信息。关于磷灰石法和分离纯化等各工序进行了简单易懂的解说，请一定要看。
另外，关东化学开发了封盖剂等核酸合成所需的各种试剂，并将其产品化。其他还有广泛用途的脱水溶剂、各种色谱柱、应用程序，请一并观看。

1.关于核酸

什么是核酸

核酸是脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）的总称，是由碱、5碳糖、磷酸构成的核苷酸链状连接构成的有机化合物。这些，DNA存储遗传信息，RNA合成与那个信息对应的蛋白质等，在生物制作细胞上担负着很大的作用。

近年来，对核酸的关注越来越高。其理由之一是，在医药领域作为核酸的创药模态的实用可能性。

核酸医药品

核酸医药品是指由天然型核苷酸或化学修饰型核苷酸构成，通过化学合成制造的医药品。这些通常是连接了十几个到几十个碱基的比较短的核苷酸的聚合物（寡核苷酸），不翻译成蛋白质直接作用于生物体。这一点与在生物体内表达蛋白质的基因医药品不同。

核酸医药品的特长和课题

主要核酸医药品的种类

核酸医药品有很多种类，各自的结构和目标不同。

这些核酸医药品，日本6种商品也被承认（2023年8月时刻）。在日本，到2023年8月为止被认可的核酸医药品可以从这里确认。
出处：摘自国立医药品食品卫生研究所基因医药部主页的一部分

核酸合成

核酸是有机化合物，可以人工合成。其中寡核苷酸的合成有液相法和固相法。
液相法，因为规模上升容易，有大量合成可能的特征。另一方面，一般来说，合成方法的确立和从反应溶剂中分离目标的寡核苷酸是很难的，需要溶解载体等的合成技术和技术，学院和化学制造厂进行着独自技术的开发。
固相法由于确立了合成方法和在固相载体上进行反应，可以简便地进行清洗，所以可以比较容易地进行合成。但是，由于在反应和清洗时使用过量的试剂，因此合成成本高和环境负荷大成为课题。该固相法主要采用磷酰胺法。

2.磷灰石法

磷酰胺法是20世纪80年代由Caruthers博士等人开发的，现在作为最主流的寡核苷酸合成法使用。玻璃珠、树脂珠等固相载体表面的氨基通过接头连接核苷。通过重复上述①～④步骤，合成目标链长的寡核苷酸。
这种合成法工序数多，最终的收率有降低的倾向。为了更有效地合成寡核苷酸，每个步骤的收率必须接近100%。另外，由于溶剂中含有的水分会降低收率，所以使用脱水溶剂可以抑制其影响。

2-1. 脱保护（脱三乙酰化）

为了选择性地在固相上担载核苷的3’位，5’位的羟基被DMTr基保护。进行偶联时，5’位为反应点，因此使用去块剂进行DMTr的脱保护。此时，通过使用不耐脱布剂的酸和缩短与酸的接触时间，抑制脱嘌呤（嘌呤碱因酸而脱离）的可能性变高。
对于长链的寡核苷酸的反应，比三氯乙酸反应比较温和的二氯乙酸更适合，为了缩短接触时间，反应所需时间短的三氯乙酸更适合。

2-2. 联轴器

在脱保护中成为5’-羟基的多核苷酸上结合磷酰胺单体。此时，偶联使用活化剂试剂。活化剂试剂使用没有吸湿性的5-乙基硫代-1H-四唑和5-苄硫基-1H-四唑等。
另外，因为是不喜欢水的反应，所以作为溶剂使用低水分的乙腈，或者过量使用磷酰胺单体和活化剂试剂，可以提高偶联效率。

2-3. 封盖

偶联时缩合反应没有进展的5’-羟基的寡核苷酸，作为未反应物残留，在下次以后的循环中有时会成为难以分离的杂质。这个未反应物能的比例一般每1周期2%左右，不过，通过反复进行未反应物的比例变得更大，与收率降低相连。
为了抑制收率降低，在偶联后使用乙酸酐和N-甲基咪唑的反应物进行封端，必须使未反应物乙酰化并失活。

2-4. 稳定化（氧化/硫化）

偶联反应形成的亚磷酸酯键缺乏稳定性，有时会被酸水解，因此进行稳定化。在稳定化的时候，采用了使用氧化剂将亚磷酸酯键转换为磷酸酯键的方法。但是，磷酸酯键被体内含有的酶--核酸酶分解，因此也有使之硫化转换为硫代磷酸酯键的方法。
硫化反应是DDTT处理几分钟左右的简便作业，广为人知，硫化时的反应体系中含有水分子时，可以看到水分子生成PS→PO脱硫体。因此，硫化反应必须在压盖前进行⁽¹⁾。

重复到此为止的循环直到达到目的链长，达到目的链长后进行2-5的后处理工序。

参考文献
(1)PHARM TECH JAPAN Vol.38 No.12 (2022)

2-5. 后处理工序

由于在上述合成循环中合成的寡核苷酸负载在固相上，因此需要使用氨水和二乙胺等碱试剂进行切割。此时，同时也进行5’-保护基DMTr、核碱基（腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶）的保护基、磷酸部的氰基乙基的脱保护。

3.寡核苷酸的纯化和分析

一般情况下，寡核苷酸在固相载体上反复进行伸长反应后，从载体上切出，经过柱色谱纯化、超滤浓缩、冻干各过程得到所需核酸。
最后，通过液相色谱进行质量确认。

核酸 合并

精炼

浓缩 脱盐

冻结 干燥

分析

纯化、分析

精制·分析，一般使用离子对反相色谱，阴离子交换色谱进行。对于长链的核酸，使用聚丙烯酰胺凝胶的电泳也被活用。
另外，寡核苷酸合成在各工序中会产生很多杂质。这些物质从制造工序衍生杂质和目标物质衍生杂质到低分子～高分子化合物各种各样优化纯化和分析中所述修改相应参数的值。

《来自制造工序的杂质》

·磷酰胺单体
·来自保护基杂质等等

・磷酸基、糖部、核碱基相关杂质
·相对于目标产物（N量体）N-1缺损体、N+1加成体
PS→PO脱硫体等等

 

 

 

 

 

由于它们的结构和物理化学性质都与目标产物相似，因此很难进行纯化和分析。

经销商品

本公司经营可以用于精制、分析的以下产品。

反相柱L-column3

核酸医药品的代表性杂质有核苷酸缺失体及脱硫体（PS→PO）。特别是硫代磷酸化（PS）寡核苷酸，由于磷原子是不对称的中心，所以峰形状变宽，杂质的分离变得非常困难。
此次，化学物质评价研究机构（CERI）开发了独自的分析方法。

离子对反相色谱法

因为核酸具有磷酸基（阴离子性），所以很难保持在反相系的填充剂中，所以添加了阳离子性的离子对试剂和酸。本公司备有离子对反相色谱中使用的离子对试剂和LC溶剂。

2mol/L TEAA溶液，pH7.0

三乙胺醋酸盐（TEAA）在离子对试剂中也被特别广泛使用。本公司也经营调制品，所以可以省去调制的麻烦。

条目	标准值
性状	适合试验
pH（25℃）	6.9-7.1
吸光度（260nm）	0.002以下

阴离子交换色谱法

通过利用了寡核苷酸的负电荷的静电相互作用，可以在不使用有机溶剂的水系移动相中分离。本公司备有阴离子交换色谱用试剂和Agilent公司产品的阴离子交换柱等各种产品。

电泳

丙烯酰胺的单体虽然有神经毒性，但因为是微粉，所以称量时会在气氛中飞舞，有吸入暴露和设备污染的危险性。本公司准备了调制好的30（w/v）%丙烯酰胺/双溶液。

浓缩、脱盐

进行分取精制后的馏分的浓缩。用阴离子交换色谱进行分取精制时，由于其分馏含有大量的盐（氯化钠、高氯酸钠等），因此通过超滤等脱盐柱，除去盐等低分子杂质。

全球生活科学日本公司产品

全球生命科学技术日本公司，作为核酸关联产品处理着离子交换膜产品，超滤产品。为了能选定合适的MWCO（分子量），最小1K～100K对应着广泛的商品阵容。

4.相关产品视频

溶剂供应系统是从本公司的脱水溶剂SUS容器可以简单、安全地处理的脱水溶剂供应系统。
在保持气密性的状态下，可以简单地取出有机溶剂，取出后可以用惰性气体吹扫操作面板配管部分残留的溶剂。因为使用了止回阀，所以安全性也提高了。

通过以下视频，可以看到产品的特点和使用方法。

5.咨询、报价委托