2.1. 基因表达和蛋白质生产

Prp2来自嗜热梭菌（ctPrp2）由NCBI鉴定爆破搜索工具（GenBank EGS18341.1）和编码由270–921残基组成的蛋白质截短版本的基因通过PCR从总DNA制备物中扩增。根据制造商的协议，将PCR产物克隆到IBA Stargate pASG-IBA-25载体中。GST融合重组蛋白在大肠杆菌16°C下的Rosetta 2（DE3）电池。在50分钟内，使用流化器（微流体）破坏细胞 米M（M）HEPES–NaOH pH值7.5500 米M（M）氯化钠，5%(v（v）/v（v）)甘油，10 米M（M）乙二胺四乙酸二乙酯，1 米M（M）DTT和裂解液通过离心30澄清 30分钟 000克。蛋白质在20°C的谷胱甘肽-琼脂糖柱（GE Healthcare）上纯化，50 米M（M）HEPES–NaOH pH值7.5500 米M（M）氯化钠，5%(v（v）/v（v）)甘油，10 米M（M）乙二胺四乙酸二乙酯，1 米M（M）数字电视。清洗步骤，结合缓冲液补充2 M（M）加入氯化锂以消除束缚核酸，然后用30洗脱结合融合蛋白 米M（M）还原型谷胱甘肽和用PreScission蛋白酶裂解GST标签。使用Superdex 200凝胶过滤柱实现进一步纯化，随后使用谷胱甘肽Sepharose柱去除残留的GST。检查污染物核酸类通过测量蛋白质溶液在260和280的吸光度进行 纳米。蛋白质浓缩到15 毫克 毫升⁻¹使用Amicon超离心浓缩机（默克） 米M（M）HEPES–NaOH pH 7.5，200 米M（M）氯化钠，2 米M（M）氯化镁₂, 1 米M（M）DTT公司。包含残基286–921的缩短结构用于结晶晶型3（CF3），但所有纯化步骤均如上所述进行。

2.2. 结晶

使用Prp2进行结晶试验，浓度为2 毫克 毫升⁻¹(27.4 µM（M）)并与10倍摩尔过量的ADP或AMPPCP（274 µM（M）). 晶体生长于293年 K，使用由1组成的液滴进行坐滴蒸汽扩散 µl蛋白质和1 µl储液罐溶液。100年获得了无核苷酸晶体（无NT-free） 米M（M）Tris–HCl pH值7.5200 米M（M）锂₂SO公司₄，15%(w个/v（v）)聚乙二醇8000；100中的晶型1（CF1） 米M（M）HEPES–MOPS–NaOH pH 7.5，60 米M（M）氯化镁₂/氯化钙₂, 20%(w个/v（v）)乙二醇，10%(w个/v（v）)聚乙二醇8000；100中的CF2 米M（M）Tris–HCl pH 7.5200 米M（M）氯化钠，15%(w个/v（v）)PEG 8000和CF3/100 米M（M）HEPES–NaOH pH 7250 米M（M）氯化钠，25%(w个/v（v）)聚乙二醇6000。晶体在2-5之后获得 d。

2.3. 数据收集和处理

将晶体转移到含有5%的母液中(v（v）/v（v）)甘油和10%(v（v）/v（v）)PEG 400用于CF1和CF3，以及10%(v（v）/v（v）)甘油和20%(v（v）/v（v）)在液氮中闪蒸冷却之前，PEG 400用于无NTF和CF2。在德国柏林阿德勒肖夫（Mueller）BESSY II电子储存环的柏林亥姆霍兹-中央实验室（HZB）操作的BL14.1上收集了无NT-free和CF2的振荡图像等。, 2012)，CF1和CF3数据集是在欧洲同步辐射设施（ESRF）运行的ID23-2上收集的。使用处理数据XDS公司包装使用最小值我/σ(我)1.7和最小CC_1/2最高分辨率外壳的切割标准为60%（Kabsch，2010).

2.4. 结构解决方案，精细化和分析

结晶学相位问题由解决分子替换，这是首次对CF2进行的相位器（麦考伊等。, 2007)使用链条一个scPrp43（PDB条目2盎司; 沃尔伯特等。, 2010)作为搜索模型。使用CF2结构作为搜索模型求解无NT-free、CF1和CF3结构分子替换。手动建模是用库特使用两种不同的电子密度图（2毫发_o个−DF公司_c（c），毫发_o个−DF公司_c（c）)和模拟退火复合OMIT图（Emsley等。, 2010). 使用进行了优化菲尼克斯包括TLS、重量优化和散装固体优化（Adams等。, 2010). 使用中的验证工具评估最终模型的质量菲尼克斯和摩尔概率（陈）等。, 2010). 结构叠加采用LSQMAN公司（Kleywegt，1996年). 这些数字是用PyMOL公司（第1.8节；薛定谔）。对于完整的数据收集和细化统计，见表1.

2.5. 等温滴定法热量测定法（国际贸易委员会）

在MicroCal VP-ITC（Malvern）上，使用10 µM（M）ADP/AMPPCP浓度为100 µM（M）在注射器中。反应缓冲液由20个 米M（M）HEPES–NaOH pH 7.5，200 米M（M）氯化钠、5%甘油、2 米M（M）氯化镁₂.每个测量值由初始6组成 µl注射和19次注射，体积为14 以1的速度注入µl 微升 秒⁻¹。在20°C下监测结合，每次注射之间的间隔设置为250 s.数据集成使用硝基的，使用SEDPHAT公司、和GUSSI公司用于数据的最终表示（霍特曼等。, 2007; 凯勒等。, 2012; Brautigam，2015年).

3.1. Prp2的结构

由于我们一直试图使剪接体DEAH-box ATP酶Prp2结晶酿酒酵母或智人失败，子囊菌Prp2的同源序列C.嗜热菌（ctPrp2）被鉴定和克隆，因为来自这种嗜热真核生物的蛋白质可能有更高的结晶倾向（Amlacher等。, 2011). 与DEAH-box解旋酶Prp43密切相关的研究进展C.嗜热菌已经证明来自该生物体的蛋白质适合用于剪接体解旋酶的结构研究（Tauchert等。，2016年, 2017). ctPrp2与酵母Prp2（scPrp2）和人Prp2的氨基酸序列同源性分别为44.1%和49.2%。然而，全长ctPrp2在大肠杆菌; 因此，克隆、表达、纯化和结晶了包含残基270–921的N末端截短型ctPrp2。值得注意的是，已知缺失的269个N末端残基对酵母中的Prp2功能不是必需的（Edwards-Gilbert等。, 2004). 获得了四种不同的ctPrp2晶体结构：一种无核苷酸状态和三种不同的ADP结合状态晶体形式（表1). 无核苷酸结构是在非水解ATP类似物AMPPCP存在下进行结晶试验的结果，此处称为无NT-free，而核苷酸结合结构表示为晶体形式1–3（CF1–CF3）。

全长Prp2由六个域组成，其中五个域存在于ctPrp2结构中（图1一)因为用于结晶的截短蛋白质中没有269个残基N末端结构域。解旋酶核心包括两个类RecA结构域（称为RecA1和RecA2；图1一). RecA1在残基320和327之间含有保守的Walker基序A（P-环）。RecA2包含一个显著的反平行β-伸出RecA2域的发夹。翼螺旋结构域（WH）和螺旋束结构域（HB）位于RecA2的C端；两者都与Prp43和Ski2-like DNA解旋酶Hel308（Büttner）中的相应结构域同源等。, 2007; 理查兹等。, 2008). 螺旋束结构域以前被表示为棘轮结构域，并根据其先前提出的在dsDNA或dsRNA解旋中充当棘轮的功能命名（Walbott等。, 2010; 他等。, 2010); 然而，正如其他RHA和DEAH-box蛋白（Prabu等。, 2015; 陶赫特等。, 2017). C端域包括一个五股β-显示寡核苷酸结合折叠的桶（OB-fold；Murzin，1993). 这五个结构域是所有剪接体DEAH-box解旋酶共有的。

图1 Prp2的总体结构C.嗜热菌ctPrp2的模型被描绘成一幅卡通。截短的N末端延伸（270–296）的其余氨基酸显示为黑色，RecA1结构域（297–475）显示为橙色，RecA2结构域（476–652）显示为蓝色，翼螺旋结构域（WH；653–720）显示为灰色，螺旋束结构域（HB；721–852）显示在小麦中，寡核苷酸结合褶皱（OB；853–920）是绿色的。

与DEAH-box解旋酶Prp43的已知结构相比，Prp2的折叠非常相似，但N端延伸除外（图2). 在scPrp43中，N末端延伸围绕RecA1结构域，N末端残基与C末端结构域（Walbott等。, 2010; 他等。, 2010). 相反，在Prp2中，RecA1结构域的26个残基N末端形成一个长的α-从球形蛋白质分子中伸出的螺旋。该螺旋的前三圈与Prp43中相应的螺旋重叠良好。然而，在Prp43中，该螺旋在13个残基后终止，因为在位置81处有一个螺旋断裂脯氨酸。

图2 ctPrp2和scPrp43的结构比较（PDB条目3千x2; 他等。, 2010). (一)此处描述为带状模型的ctPrp2（蓝色）和scPrp43（黄色）的叠加显示出高度的结构相似性，导致r.m.s.d.为1.3 用于573公共C的α原子。(b条)最显著的差异是在蛋白质的N末端。ctPrp2和scPrp43的N末端以卡通形式显示，而scPrp42的蛋白核心以表面形式显示（灰色）。ctPrp2的N末端延伸（蓝色）从蛋白核心突出，而scPrp43的N末端（红色）包裹在RecA1结构域和部分C末端结构域。

3.2. C-末端结构域的结构灵活性

此处所示的四个Prp2晶体结构的叠加揭示了它们构象之间的明显差异，导致计算主干C之间的总根-平方偏差（r.m.s.d.s）^α0.81至1.70范围内的原子（残基286–920） Ω（基于六个叠加的平均r.m.s.d.为1.37 Å). 这明显大于分别计算的RecA2结构域（残基471-595和611-652）的骨架r.m.s.d.s，解旋酶核心包括RecA-like结构域（286-595和511-652残基）和C末端结构域（WH、HB和OB；残基653-920），范围为0.50-0.86 ？（平均值0.65 ？），从0.66到1.24 ？（平均0.97 Å）和0.44至1.03 ？（平均0.86 分别为？）。因此，保持四个比较的Prp2结构的RecA2结构域重叠，观察到的C末端结构域（CTD；WH、HB和OB）相对于解旋酶核心位置的差异变得更加明显（图3一).

图3 C终端实体的灵活性。(一)所有ctPrp2结构的叠加通过RecA2域突出了C端域相对于RecA2域的灵活性。当解旋酶核心重叠良好时，C末端结构域显示出不同的位置。(b条)尽管观察到了灵活性，但在这四种结构中可以发现C末端结构域和解旋酶核心之间的十种常见的结构域间相互作用。参与这些保守相互作用的残基显示为球体并相应标记。ctPrp2显示为带状模型，域的颜色如图1所示.

观察到的C末端结构域（CTD）相对于解旋酶核心的运动导致不同数量的结构域间相互作用（补充表S1）。有趣的是，这些相互作用中有十种涉及来自翼螺旋结构域的残基（补充表S1，图3b条)，在四个分析的Prp2结构中保持不变，与CTD的运动无关。参与这些保守相互作用的残基是Arg657、Pro653和Glu654，它们从RecA2结构域与Asn596和Thr652形成氢键；Pro719、Gly716、Glu654和Asp679，与来自RecA1域的Arg380、Arg401、Arg 423和Tyr461形成极性接触；Arg423和Lys435分别与位于RecA2域中的Asp682和Asp679形成盐桥。翼螺旋（WH）结构域和解旋酶核心之间的相互作用网络将CTD锚定在RecA1结构域的相邻表面。因此，RecA1域相对于RecA2域的任何移动都会触发CTD位置的变化，从而与RecA1领域形成一个单独的实体。令人惊讶的是，四个Prp2结构的比较表明，观察到的CTD位置变化与ADP的存在或不存在无关（图3一).

3.3. 变量β-发夹构造

基于RecA2结构域的四个比较Prp2结构的叠加揭示了C末端结构域的结构灵活性及其与RecA1结构域的耦合运动。仔细观察四个重叠的RecA2域（图4一)显示了构造上的重大差异β-发夹（残留596–610），导致计算的r.m.s.d.s显著增加，范围从0.71到2.15 ？（平均1.61 与不含该柔性碎片的RecA2域之间计算的r.m.s.d.s相比（0.50-0.86 奥，平均值0.65 Å）。观察到的构象灵活性β-发夹导致该结构元件与主要是翼螺旋结构域和OB折叠结构域之间形成的畴间相互作用的数量存在显著差异（补充表S1）。这个β-无NT-free和CF2的发夹具有相似的构象，并伸出分子支架（图4一). 这两个技巧β-发夹在电子密度图中没有解析，可能是无序的。相比之下β-CF1和CF3的发夹完全被分解，表现出明显不同的构象和域间接触的数量（补充表S1）。在深埋地层中观察到最大数量的相互作用β-CF3的发夹，其主要与C末端结构域相互作用。

图4 不同的比较β-发夹状构象。(一)所有ctPrp2结构叠加通过他们的RecA2域。不同的β-发夹用图3中的颜色表示为卡通模型(一)，而蛋白质的其余部分显示为表面（仅限无核苷酸结构）。为了清楚起见，省略了OB-fold域。叠加显示β-ctPrp2的发夹可以采用不同的构象。(b条)不同功能状态下ctPrp43结构的叠加通过他们的RecA2域（PDB条目5d0单位，5升，5升j和5升; 陶赫特等。，2016年, 2017). 结构如下所示(一)使用不同的颜色。

对四个Prp2结构的结构叠加进行的彻底分析表明β-发夹和C末端结构域相对于解旋酶核心的位置（图4一). 带有β-从蛋白质支架（无NT-free和CF2）伸出的发夹显示CTD更接近解旋酶核心的表面。相反，具有埋入式的结构β-发夹（CF3）显示了CTD相对于RecA域的最远位置。

在以下结构中可以观察到类似的相关性C.嗜热菌Prp43。这些结构表现出与各自功能状态相关的C末端结构域的显著构象变化（Tauchert等。，2016年, 2017). 研究表明，在ADP结合状态下，C末端结构域最靠近解旋酶核心，在RNA/ADP-BeF中距离稍远_三-束缚态和在ADP-BeF中相距最远_三-绑定状态。尽管β-与Prp2的结构相比，这些结构中的发夹减少，C末端结构域的构象差异更加明显，值得注意的是β-发夹存在于ADP结合状态，而β-发夹出现在ADP-BeF中_三-束缚态（图4b条).

3.4. 替代ADP构象

两个RecA-like结构域形成了一个裂缝，包含结合的ADP核苷酸。在报道的与ADP络合的ctPrp2晶体结构中，核苷二磷酸被Gly323、Gly325、Lys326、Thr327和Thr328结合。一个镁²⁺离子由四个水分子协调β-磷酸氧原子和Thr327侧链的羟基。

尽管存在这种相似性，但CF1/CF3和CF2之间腺苷的构象及其结合方式存在显著差异（图5c（c）). 在CF1和CF3中，腺嘌呤夹在Arg362和Phe558之间，N6原子与Ser358形成氢键。核糖的3′-OH基团与Arg628发生极性相互作用。结合腺苷的这种构象反对的CF1/CF3中的构象与Prp43–ADP晶体结构（Tauchert等。，2016年; 沃尔伯特等。, 2010; 他等。, 2010).

图5 不同结合ADP分子的比较。ADP分子以球棒模型表示，镁离子和水分子以球体表示。ctPrp2被描述为一个卡通表示，突出显示的残留物为球杆模型。(一)描述了毫发o个−DF公司c（c）镁离子的电子密度OMIT图，CF3（灰色）四配位水的等高线为3σ此OMIT图代表了所有ADP结合结构。CF2（橙色）和CF3 ADP分子在相同轮廓水平上的OMIT图显示在(b条)和(c（c）)分别是。(d日)在叠加CF2和CF3的RecA1结构域时，磷酸部分几乎完全相同，但腺苷以先前未描述的构象存在，导致CF2中不同的腺苷相互作用。(e（电子）)不同ADP分子的叠加通过核糖表明腺嘌呤存在于同步器（CF2）和反对的（CF3）构象，沿C4′-C5′键和C5′-O5′键的扭转分别改变167和62°。(（f）)根据中描述的ADP构象(d日)和(e（电子）)，附近图案VI中的一个环采用了不同的构象。RecA2结构域的叠加显示，与CF1和CF3相比，在无NTF和CF2结构中，该环的构象发生翻转，其ADP结合模式与其他DE相似x个D/H盒螺旋体。

在CF2中，观察到一种新的腺苷构象，这在所有已知的DE中是独一无二的x个D/H盒解旋酶结构。当二磷酸部分的构象和结合方式保持不变时，碱被翻转成同步器构象并指向RecA2域（图5d日). 在这个新构象（CF2）中，腺嘌呤部分与Asp582形成两个极性相互作用。Arg362的侧链重新定位，现在占据CF1/CF3中腺嘌呤的位置，与核糖的3′-OH基团形成氢键。基于核糖部分的两个ADP分子（CF1和CF2）的叠加清楚地描述了构象的实际差异（图5e（电子）). 尽管糖皱褶保持不变（C2′-内幕构象），CF2构象中C4′-C5′和C5′-O5′键的扭转角相对于CF1/CF3构象中的扭转角分别改变了167和62°。在报道的Prp2晶体结构（CF2）中观察到ADP的构象异质性与CF1/CF3）揭示了解旋酶核心的内在灵活性，这与大的结构重排或晶体堆积无关（CF3和CF2是同构的）。

此外，ADP的新结合模式伴随着保守序列基序VI的C末端环构象的变化（图5d日). RecA2域的叠加显示，CF1和CF3中的这些环路采用几乎相同的构象，指向ADP，而CF2中的环路翻转到距离ADP更远的位置。环的这种交替构象使腺嘌呤能够重新定位，如CF2中所示，否则Arg628与CF1和CF3中的核糖相互作用，将阻碍ADP的新构象（图5c（c）). 有趣的是，与CF2和CF1/CF3 Prp2–ADP结构相比，该环在无核苷酸Prp2结构中占据中间位置。

3.5. 无核苷酸Prp2

无核苷酸的Prp2含有一个硫酸盐离子，它占据了β-ADP复合物结构中的磷酸盐（图6). 硫酸盐离子的O原子与β-ADP结合结构的磷酸盐，即具有Gly323、Gly325、Lys326和Thr327。无核苷酸Prp2的整体结构与CF2的结构更为相似：C末端结构域位于解旋酶核心附近，部分无序β-发夹从蛋白核中伸出（图3一). 与CF1和CF3相比，图案VI环从ADP装订袋中轻微翻转（图5d日).

图6 无核苷酸Prp2结构与结合硫酸盐分子。无NT-free和CF1结构的RecA1结构域的叠加表明，存在于无核苷酸结构活性部位的硫酸盐与β-结合ADP的磷酸盐。

无核苷酸结构是Prp2与非水解ATP类似物AMPPCP结晶试验的结果。为了解释AMPPCP结合不足的原因，使用等温滴定法对AMPPCP和ADP进行了结合研究热量测定法（ITC）。该实验在滴定AMPPCP时使用的缓冲条件下没有产生明显的热信号。虽然缺少热信号也可能是由于焓在结合后脱质子的情况下进行补偿，该结果强烈表明Prp2不结合AMPPCP（补充图S1一). 这一发现与无核苷酸结构中不存在AMPPCP一致。CF1–CF3中ADP的末端O原子与Gly323形成氢键，这种相互作用不能与AMPPCP的亚甲基桥发生，这可能解释了这种ATP类似物缺乏结合。绑定研究通过还对ADP进行了ITC作为对照，并测定了解离常数(K（K）_d日)第179页 n个M（M）获得（补充图S1b条).