2.1. 蛋白质结晶

pLAST-MAM酶原通过重组表达获得尼旋毛虫High Five昆虫细胞，按Becker-Pauly所述进行纯化等。（2009年)随后在Vivaspin装置中使用具有10 kDa截止值（Vivaproducts）。我们在IBMB/IRB联合自动晶体成像平台上使用坐滴蒸汽扩散法筛选结晶条件(https://www.ibmb.csic.es/en/facilities/automated-crystallographic-platform网站). 使用帝肯Freedom EVO机器人制备储层溶液，并将其分配到96×2孔MRC板中（Innovadyne Technologies）。菲尼克斯/RE机器人（Art-Robbins）管理由100个 nl分别为蛋白质和储液。结晶板随后在4或20°C的温度下在Bruker恒温结晶农场中培养。尽可能在24孔Cryschem结晶皿（Hampton Research）中对成功的初始条件进行精炼并放大至微升范围。～7时蛋白质的最佳晶体 毫克 毫升⁻¹50分之一 米M（M）HEPES pH 7.0在20°C下使用0.1 M（M）bicine pH 9.0，10%聚乙二醇（PEG）40 000，2%二恶烷作为储层溶液。晶体是薄而易碎的矩形板，使用低温（分子尺寸）收集，快速通过由储液罐溶液加20%组成的低温缓冲液(v（v）/v（v）)甘油和在液氮中快速玻璃化，用于运输和数据收集。

2.2. 衍射数据采集和处理

2010年4月18日，在法国格勒诺布尔ESRF同步加速器的束线ID29上，使用ADSC Quantum 315r探测器收集了X射线衍射数据。衍射数据使用XDS公司（卡布施，2010年)和XSCALE公司、和使用转换为MTZ格式XDSCONV公司用于凤凰（利布施内尔等。, 2019)和中央处理器4（优胜者等。, 2011)套房。使用进行分析phenix.x分类在内部凤凰显示出缺乏翻译非晶体对称性（NCS）且无显著差异孪生根据L（左）-测试。晶体中含有两个单体非对称单元和表1提供了有关数据收集和处理的基本统计数据。

表1 结晶数据 缩写：AU，晶体不对称单元；老挝政府，甘油；聚乙二醇，二甘醇；PGE，三甘醇；RSRZ，真实空间R（右）-价值Z轴-得分。括号中的值表示最外层的分辨率外壳。 光束线 ID29、ESRF “空间”组 C类2 每个AU的原生质体 2 一，b条，c（c）(Å) 115.83, 47.57, 236.40 α，β，γ(°) 90、102.91、90 波长（Ω） 0.97244 测量次数 316453 独特反射次数 49732 分辨率范围（Ω） 76.8–2.40 (2.54–2.40) 完整性（%） 99.6 (98.6) R（右）合并† 0.151 (1.431) R（右）测量† 0.164 (1.564) 科科斯群岛1/2† 0.995 (0.594) 平均强度‡ 9.8 (1.9) 威尔逊B类系数（Ω2) 53.7 平均多重性 6.4 (6.1) 用于细化的分辨率范围（Ω） 46.7–2.40 使用的反射（总数/测试集） 48988 (741) 晶体学的R（右）/R（右）自由的† 0.253/0.289 AU的内容    非H蛋白原子 4801  离子配体 2锌2+，1毫克2+  水域 229  非离子配体 1个PGE、1个PEG、2个GOL 目标值的R.m.s.d  键长（Å） 0.014  角度（°） 1.26 平均值B类系数（Ω2) 77.6 蛋白质接触和几何分析§  Ramachandran偏好/离群值/所有分析 550 [91%]/10/603  键长/键角/手性/平面度异常值 0/1/0/0  侧链异常值 29 [5.8%]  所有原子碰撞 43  冲撞得分 4.5  RSRZ异常值§ 131 [21.6%] F类o个–F类c（c）相关性 0.89 (0.88) PDB代码 8a28号 †定义见Einspahr&Weiss（2012）). 平均强度为〈我/σ(我)〉合并后的独特反射XSCALE公司（卡布施，2010年). §根据wwPDB验证服务(https://wwpdb-validation.wwpdb.org/valid服务).

2.3. 结构解决和细化

pLAST-MAM的结构由分子置换使用相位器晶体学软件（McCoy等。, 2007)以及CD和MAM结构域的同源模型字母折叠（跳线等。, 2021). 经过多次试验，我们只能通过单独搜索域来获得正确的解，即两个用于CD，但只有一个用于MAM域。CD的角度对应于欧拉角α= 54.2,β= 54.0,γ=116.3和的单元分数转换值x个= 0.106,年 = 0.002,z=0.210，对于一个原聚体和α= 261.5,β= 125.5,γ = 297.0,x个 = 0.419,年= 0.884,z=0.303，对于第二原聚体。MAM部分的相应值为α= 64.8,β = 106.0,γ= 172.9,x个= 0.285,年= 0.751,z = 0.991. 这些解决方案具有最终的转换功能Z轴-得分为17.1分，之后全球对数增长精细化第782页。

将适当旋转和平移的分子进行菲尼克斯汽车协议（Terwilliger等。, 2008)在凤凰生成了一个大大改进的傅里叶图，用于手动建模库特（卡萨纳尔等。, 2020). 后者与晶体学交替出现精细化使用菲尼克斯定义协议（van Zundert等。, 2021)和巴斯特（智能等。, 2012)这两者都包括平移/解放/螺旋运动和NCS约束，直到模型完成。后者包含原聚体的残基Glu22–Cys403一个和原聚体的Glu22–Gly246B类，每个都有一个催化锌离子加上一个暂定的镁离子、一个二甘醇分子、一个三甘醇分子，两个甘油分子和229个溶剂分子。原聚体LNK和MAM的占有率一个精炼至87%。表1提供关于最终优化模型的基本统计信息，该模型通过wwPDB验证服务进行了验证(https://validate-rcsb-1.wwpdb.org/valid服务). 坐标可以从蛋白质数据库中检索(https://www.wwpdb.org/)作为条目8a28号.

2.4. 其他

使用SSM公司（Krissinel&Henrick，2004）)在库特。数字是使用UCSF奇美拉（戈达德等。, 2018). 蛋白质界面和分子间相互作用使用PDBePISA公司(https://www.ebi.ac.uk/pdbe/pisa; Krissinel&Henrick，2007年)并通过目视检查进行验证。为此，复合物的相互作用表面被视为任一分子的埋表面积总和的一半。

3.1. 总体晶体排列

为了防止自溶，pLAST-MAM在昆虫细胞中重组表达为一个点突变，在该点突变中，用于催化的普通碱/酸性谷氨酸（Arolas等。, 2018; E类¹⁴⁰; 根据UniProt B4F320，残留物以单字母代码形式给出，并在上标中编号；其他蛋白质在下标中编号）被丙氨酸取代，以产生催化受损的变体。这种策略在过去经常被用来防止MP酶原结晶时的自溶（见Arolas中的表1等。, 2018). 具有两个原异构体的pLAST-MAM晶体(一个和B类)在晶体学上非对称单元2010年获得（表1)但该结构是最近才使用由字母折叠（跳线等。, 2021)的分子替换。在对整个分子和独立结构域进行广泛计算后，两个CD（N⁴⁹–C²⁴⁴)可以放心地放置、重建和改进，以及相应的PP（定义为E²²–K（K）⁴⁸). 相反，LNK（F²⁴⁵–D²⁵⁷)和MAM（F²⁵⁸–C⁴⁰³)部分是柔性的，只有原聚体的部分一个可以放置在结构中。此外，晶体学精细化发现由于这种灵活性，最终的傅里叶图在MAM域的几个地方是不连续的（图1一). 事实上，虽然CD显示了平均热位移参数(B类系数），共60和73 Ų原生质体一个和B类分别为原聚体的LNK和MAM段一个平均分B类系数116 Ų入住后精细化至87%。

图1 水晶特征。(一)pLAST-MAM原聚体的实验结构一个单位：Cα表示与最终结果（2）重叠毫发光突发事件−DF公司计算)-在0.5等高线处绘制傅里叶图σ高于阈值。CD为黄色，锌离子为洋红色球体，LNK为紫色，MAM域为橙色。(b条)水晶包装俯视x个双目立体中的晶体轴。原生质体的CD一个（橙色Cα跟踪）和B类（绿色Cα轨迹），以及它们的对称配对（紫色Cα迹线），位于平行于xy公司晶体的平面。这两个CD是一个相对上下的构象，因此它们各自的C末端要么指向下（原聚体一个，橙色箭头）或向上（原型B类，绿色箭头）。原单体的MAM结构域一个其对称配对占据CD部分之间的空间（黄色背景）。(c（c）)与相同(b条)但向下看水晶年轴，即垂直旋转90°后。请注意，每个LNK以扩展构象与对称MAM域相互作用，以在CD平面之间的黄色背景部分中构建晶体。在对称MAM域之间观察到进一步的接触。(d日)立体视图向下年轴，如中所示(c（c）)显示了晶体中出现的四个CD部分（1-4）。在截面2和3之间的空间中未发现原子，因为LNK和MAM域B类原生质体（绿色C中的CDαtrace）在最终模型中是无序的。(e（电子）)与相同(d日)叠加原聚体后一个和B类使用各自的CD。原聚体的LNK和MAM结构域B类它的对称配对（紫色）将建立在第2节和第3节之间形成晶体所需的晶体接触。因此，这些部分必须存在于晶体中，但却是无序的。(（f）)用预测的pLAST-MAM的MAM域的立体叠加字母折叠并根据实验衍射数据（紫色的LNK，橙色的MAM结构域）和人甲哌林的实验MAM结构域进行细化β（chartreuse；PDB条目4千兆瓦; 阿洛拉斯等。, 2012).

对晶体包装的检查表明，两张CD形成紧密的层，平行于xy公司晶体平面及其各自晶体对称性配对（图1中的1和2b条和1c（c）). 它们呈相对上下的构象，因此C末端突出在CD层的上方或下方。如果是一个原异构体、LNK和MAM投射到CD段之间的空间，并分别从下面的CD层与对称的MAM和LNK部分进行相互作用，这是形成晶体所必需的（图1b条和1c（c）). 相反，CD段之间的空间B类-原聚体CD点（图1中的第2和第3部分d日)不包含任何原子，因此由于缺少LNK和MAM，缺少晶体接触。然而，当叠加全长原聚体时一个关于原聚体B类通过各自的CD，LNK和MAM部分在两个CD层之间的空间中采用了与一个原生质体（图1中的第2和第3部分e（电子）). 因此，LNK和MAMB类晶体中还必须存在原聚体，以建立构建晶体所必需的分子间接触。总的来说，我们的结论是，虽然LNK–MAM两个部分都非常灵活，并且采用了几个稍微不同的取向，从而能够组装晶体，即原聚体的取向一个有点僵硬，所以它们在最终的傅里叶映射中有大致的定义。相比之下，原聚体的B类非常灵活，密度太低，无法自信地放置它们。

因此，鉴于MAM结构域的定义不明确，我们将在下文集中讨论酶原（此处称为pLAST）的PP和CD部分以及原聚体的成熟CD（LAST）一个以及其他具有结构特征的虾青素酶原的潜伏期机制。可以说，pLAST-MAM的MAM结构域的预测结构与人类虾青素家族成员meprin的结构非常相似β除了一些环路（图1（f）). 有关这些领域的架构和特性的讨论，请参阅Cismasiu等。(2004)，阿里塞斯库等。(2006, 2007)，阿罗拉斯等。(2012)、Yelland&Djordjevic（2016年)和Eckhard等。(2021).

3.2. 酶原的结构

当以议员的标准取向（戈米斯·吕斯、波特略）来看时，pLAST部分细分为三个部分等。, 2012)：N端PP（E²²–K（K）⁴⁸)，CD（N）的上N端子域（NTS）⁴⁹–G¹⁴⁶)和CD（F）的下C端子域（CTS）¹⁴⁷–C²⁴⁴)（图2一). PP从右向左沿pLAST的前表面运行，具有螺旋结构α1位于裂缝的涂底漆侧（基底和活性位点子网站术语基于Schechter&Berger，1967）; 波特略省戈米斯·吕斯等。, 2012). 它采用从L之间的缝隙突出的宽环结构²⁹和D³⁸（图3一)由两个链内氢键（H³¹北-北³⁷O和F³⁵O–I型³⁹N） ●●●●。干预性残基包含在虾青素（F-E/Q-G-D-I；Gomis-Rüth，Trillo-Muyo）中发现的“PP基序”中等。, 2012)，F³⁵-E-G-D-I公司³⁹最后（贝克·保利等。, 2009). 对于我来说³⁹–G⁴¹，该多肽在V向下旋转90°之前，沿着裂口的非质膜侧采用延伸构象⁴²–Y⁴⁵然后向左为Y⁴⁵–D⁴⁷之后，含有初级激活裂解位点（K⁴⁸–否⁴⁹)进入CD，CD对K采用螺旋构象⁴⁸–H⁵⁴(α2; 图2一和3一).

图2 pLAST的结构特征。(一)PP（蓝色丝带）和CD（橙色/红色丝带）的带状图鲎属对眼立体图中的虾青素酶原。常规二级结构元素（螺旋α1–α8英寸蓝色/砖色和β-股β1–β7（橙色），以及N末端和C末端。活化解理位点K48–否49由绿色箭头精确定位，催化锌被描绘成紫色球体。与锌结合有关的残留物及其侧链显示为棍子并标记（D38蓝色；H（H）139，H143和H149红色；Y（Y）198绿色），以及蛋氨酸（M196绿色），一般的碱性/酸性谷氨酸（E140)突变为丙氨酸（红色）和两个二硫键（黄色；1，C90–C244; 2、C112–C131). (b条)酶原的结构显示CD和PP的静电表面为淡蓝色条带，沿与底物相反的方向穿过深且延伸的活性位点裂缝。“天冬氨酸开关”残基D的侧链38显示并标记。(c（c）)的特写视图(一)描述了催化锌离子扭曲的八面体配位球。Nɛ2H原子139和H149以及Oδ1和Oδ2D的原子38与金属躺在一个平面上。H143N个ɛ2更遥远的是，Y198O（运行）η原子占据顶端位置。Met-turn，包括M196，被描绘成一条青色丝带并贴上标签。

图3 主动侧裂细节和pLAST的激活机制。(一)图2的特写视图(一)立体描绘参与PP-CD相互作用的残基与绿色（PP；蓝色标签）或紫色（CD；红色标签）中的C原子粘附。残留物标签如图2所示(c（c）)为了清楚起见，没有包括在内。(b条)C的立体声叠加αpLAST实验结构的痕迹（CD部分为棕色，PP部分为半透明海蓝宝石）和字母折叠LAST（在鲑鱼中）的同源模型，以说明所提出的激活机制。在分段G中发现微小差异199–D206（1） 和E150–E179（2） 由于闭合运动使裂缝稍微变窄。“激活段”（3；P180–否187)和成熟CD（4；N49–左56). 绿色箭头指明了成熟后的拟议运动。

与其他阿斯塔辛一样，195-残留CD分为大小大致相同的NTS和CTS（图2一). NTS具有丰富的规则二级结构，由五股拱绞结构组成β-薄板(β1–β5） ，除最下面的外，其股线平行于活性位点裂缝(β4） ，它是反平行的，框架的上边缘的裂缝。板材的凹面容纳三个螺旋(α3–α5） 其中有一个“支撑螺旋线”(α4） 和“活性位点螺旋”(α5） 通常具有阿斯塔辛和美辛辛的特征（博德等。1993年; 斯特克等。, 1993; Stöcker&Bode，1995年; Gomis-Rüth，2009年; 戈米斯·吕斯（Gomis-Rüth）、特里罗·穆约（Trillo-Muyo）等。, 2012; Cerdá-Costa&Gomis-Rüth，2014年; 阿洛拉斯等。, 2018). 活性位点螺旋包含保守锌结合基序（H¹³⁹-E类-X（X）-X（X）-H（H）-X（X）-X（X）-G公司-X（X）-X（X）-H（H）¹⁴⁹在pLAST中）发现于虾青素和其他甲锌素中，其特征是三种金属结合组氨酸和一般的碱性/酸性谷氨酸，此处被丙氨酸取代（见上文和图2c（c）). 基序的甘氨酸（G¹⁴⁶)多肽在进入CTS时经历了一个急剧的向下转向，与NTS相比，CTS更不规则。它包含两个短螺旋(α6和α7） 和短发β-色带β6β除了“C端螺旋线”之外，还有7个(α8） 这也是metzincins的特点。值得注意的是metzincins的另一个保守结构元素，即“Met-turn”，它是一个紧1,4圈（S¹⁹⁴–左¹⁹⁷)包含严格保守的M¹⁹⁶（图2c（c）). 它的侧链为金属结合位点提供了一个疏水性枕，这对美辛的稳定性和功能至关重要（塔兰特、加西亚-卡斯特拉诺斯等。, 2010). 蛋氨酸下游，Y¹⁹⁸通过距离稍远的O提供CD的第四个锌配体^η原子。在其他虾青素中，这种残基在“酪氨酸开关”及其O后与底物结合时摆动^η原子参与稳定反应中间体催化期间（Stöcker&Yialouros，2013). 最后，一个二硫键将NTS的背面与C末端螺旋连接起来αCTS（C）的8个⁹⁰–C²⁴⁴)和第二个单链股β4，回路连接β5和α5（升β5α5） （C）¹¹²–C¹³¹)（图2一).

3.3. 潜伏期机制

pLAST中的延迟是通过阻止PP对基板的访问来实现的，PP以与基板相反的方向穿过CD部分的活性位点缝隙（图2一, 2b条和3一). 这是一种防止过早自溶性卵裂的策略顺式（Khan和James，1998年; 阿洛拉斯等。, 2018). 此外，多肽链没有采用需要裂解底物的延伸构象（廷达尔等。, 2005)但更确切地说，上述环形结构从裂缝中凸出（图2b条). 这可以防止可剪断键延伸到裂缝子网站S上₁和（图3一)这是另一种防止不希望的卵裂的机制（Arolas等。, 2018). PP-CD相互作用覆盖的表面跨度1207 Ų，在蛋白质-蛋白质复合物的报告范围内（～380–3390 Ų; 陈等。, 2013)，在界面形成时具有溶剂化自由能增益(Δ^我G公司)第页，共−16.9页 千卡 摩尔⁻¹（Krissinel&Henrick，2007）)，表明存在较强的交互作用。参与结构元件包括整个PP和N段⁴⁹–V型⁵²，D¹¹⁰–V型¹¹⁶，Y¹²⁹–H¹⁴³，周¹⁴⁸–否¹⁵²，S¹⁷⁰–百万¹⁷⁸，Y¹⁹⁸–T型²⁰⁸和P²²³–K（K）²²⁶在CD的任何一个部分的17对残基之间建立了20个静电相互作用和疏水接触（表2).

pLAST（K）的一级活化位点⁴⁸–否⁴⁹)插入短螺旋α2和埋藏在酶原中，从而以与原天冬氨酸（格瓦拉等。, 2010). 此外，K⁴⁸N个^ζ与Y产生强烈的互动¹⁷³O（2.7） 隔开）和N¹⁷⁶O（3.1） 光盘上的（）和E³⁶O（运行）^ɛ2(2.7 聚丙烯基序的？），这同样阻碍了激活。后一种相互作用使人联想到基质金属肽酶（MMP）酶原（P-R-C-G）中的PP基序中精氨酸和天冬氨酸之间的双盐桥-X（X）-P-D；van Wart和Birkedal-Hansen，1990年; 斯普林曼等。, 1990; 塔兰特，马拉罗等。, 2010; 阿洛拉斯等。, 2018). 此外，活化顺硅键N原子与D结合⁴⁷O（运行）^δ2(2.8 在PP中，激活位点在酶原中受到额外保护。所有这些发现都支持pLAST的成熟，pLAST需要激活位点两侧片段的部分展开和/或初步裂解，如小龙虾虾青素（Yiallouros等。, 2002; 格瓦拉等。, 2010).

延迟最相关的元素是D³⁸，通过其O以双齿方式结合催化锌^δ1(2.2 ？）和O^δ2(2.4 原子（图2c（c）)，从而取代了成熟MP中催化所需的催化溶剂（Arolas等。, 2018). 这种天冬氨酸嵌入PP基序中，与H一起形成一个扭曲的八面体金属配位球¹³⁹N个^ɛ2(2.1 ？）和H¹⁴⁹N个^ɛ2(2.1 与阳离子和H在平面上¹⁴³N个^ɛ2(2.1 ？）和Y¹⁹⁸O（运行）^η(3.3 在顶端位置。因此，D³⁸作为一个“天冬氨酸开关”，用于之前描述的小龙虾虾青素（格瓦拉等。, 2010)和人类meprinβ（阿洛拉斯等。, 2012)在虾青素（见下文）和脆弱素-3（古拉斯等。, 2011)和细菌MMP karilysin（Cerdá-Costa等。, 2011)在其他metzincin（Arolas等。, 2018).

3.4. 提议的激活机制

小龙虾中的原型虾青素与马蹄蟹一样是节肢动物，代表了进化上最接近LAST的同源物，具有已知的成熟结构（Bode等。, 1992). 的确，157摄氏度^α这些蛋白质的原子与1.3的核心根平方偏差（r.m.s.d.）重叠 λ（38%序列一致性）。此外，通过以下方法获得了LAST的预测同源性模型字母折叠（跳线等。, 2021)，显示了成熟虾青素相关片段的大多数共同特征。它的平均预测局部距离差测试（pLDDT）值>97，这表明它具有较高的可靠性（Tunyasuvunakool等。, 2021). 因此，该模型在下文中被视为成熟的工作模型鲎属虾青素。

pLAST结构和LAST模型的叠加（图3b条)显示CD部分大部分重合。特别是，NTS匹配最佳，r.m.s.d.为0.93 段L的所有746个原子的原子为⁵⁷–H¹⁴⁹如其他MP酶原（Arolas等。，2018年). 在CTS中，观察到E段的一致性良好¹⁸⁸–G¹⁹⁹，其中包括Met-turn和从G延伸的整个C端子²⁰⁷至C²⁴⁴.回路G¹⁹⁹–D²⁰⁶，它构成了裂缝的下边缘，略微偏离，最大位移为～2 激活时，启动侧的缝隙闭合。在裂缝未涂底漆一侧的底部，E¹⁵⁰–E¹⁷⁹还将进行最大～3的闭合运动 通过围绕W旋转约10°来促进¹⁹⁸然而，P段的偏差最大¹⁸⁰–否¹⁸⁷，它符合一个灵活的“激活域”，并将被显著重新排列（图3b条)如其他虾青素（格瓦拉等。, 2010)以及其他不相关的类胰蛋白酶丝氨酸内肽酶（Huber&Bode，1978). 这种重排将由N的位移引起⁴⁹–左⁵⁶在K成熟时分裂⁴⁸–否⁴⁹会围绕C向外旋转^α-L的C债券⁵⁶通过这种方式，前面的七个残基将被充分重新定位，最多可达～11 并穿透成熟酶部分，因此前三个残基（N⁴⁹-A类⁵⁰-我⁵¹)如meprin所报道的那样，溶剂完全无法进入β（见第3.5节). 接下来，N⁴⁹在第三个锌结合组氨酸（E¹⁵⁰; 博德等。, 1993; 戈米斯·吕斯，2003)，它又被R的内部盐桥固定住²³⁷和R¹⁵³在酶原中。这种相互作用可以直接通过N⁴⁹N个^δ2原子，如在甲氧麻黄酮中观察到的β（阿洛拉斯等。, 2012). 通过α-氨基（N⁴⁹N） 由溶剂分子介导，如小龙虾虾青素（Bode等。, 1992)也是可以想象的。此外，N⁴⁹O（运行）^δ1原子也可能结合R²³⁷侧链。总的来说，这种深埋成熟N末端的情况与在其他虾青素中发现的情况非常相似，其中成熟机制已在结构上得到验证（见第3.5节). 这反过来又为LAST同源模型的可靠性提供了信心。

3.5. 与其他虾青素潜伏期机制的比较

迄今为止，小龙虾原天门冬氨酸（PDB条目）的晶体结构3lq0个; 格瓦拉等。, 2010)，人原-蛋氨酸β（PDB条目4千兆瓦; 阿洛拉斯等。, 2012)以及来自两种密切相关的细菌的原甲氧基蛋白酶，深部Myroides defundi（PDB条目5兆瓦; 徐等。, 2017)和Myroides公司sp.CSLB8（PDB条目5千兆瓦; 徐等。, 2017)，以及它们各自的成熟形式虾青素（PDB条目第一次; 博德等。, 1992; 戈米斯·吕斯等。, 1993)，梅普林β（PDB条目4千兆; 阿洛拉斯等。, 2012)和来自Myroides公司sp.CSLB8（PDB条目5兹克; 跑等。, 2020). 这两种蛋白质来自Myroides公司99.6%相同，所以只有来自Myroides公司sp.CSLB8将在这里进行讨论。在所有这些结构中，只有前分子β跨越CD下游的其他域，即MAM域和TRAF域（Arolas等。, 2012). 图4提供了叠加在成熟形式上的三种酶原的图片，以及pLAST结构和LAST模型的图片(一)–4个(d日).

图4 用报道的酶原结构和保守的PP基序激活虾青素。(一)–(d日)C的双目立体图中的叠加α潜在和成熟形式的标准定向痕迹(一)鲎属虾青素（潜伏，PDB进入8a28号; 成熟，字母折叠型号）(b条)小龙虾虾青素[潜伏，PDB进入3lq0个（格瓦拉等。, 2010); 成熟，PDB入口第一次（博德等。, 1992; 戈米斯·吕斯等。, 1993)], (c（c）)人甲氧麻黄酮β[潜在的PDB条目4千兆瓦（阿洛拉斯等。, 2012); 成熟，PDB入口4千兆（阿洛拉斯等。, 2012)]以及(d日)Myroides公司sp.CSLBB溶血素[潜伏，PDB进入5千兆瓦（徐）等。, 2017); 成熟，PDB入口5兹克（跑步等。, 2020)]. 成熟形式为橙色，酶原为青色（PP）和黄色（CD）。催化锌离子被描绘成紫色球体。美普林的PPβN端延伸，穿过邻近TRAF域的前表面（未显示；Arolas等。, 2012). 成熟卵裂过程中最相关的重排片段，即“激活片段”和成熟N末端片段，分别由每个结构中的绿星和红星确定。(e（电子）)包含虾青素PP基序（F-E-G-D-I）的片段在pLAST（青色中的C原子）、小龙虾原天门冬氨酸（棕褐色中的C元素）和人类原蛋氨酸中的重叠β（李子中的C原子）。溶血素缺乏这个基序。

在所有情况下，成熟的N-末端都埋藏在催化部分内，并通过N-末端天冬酰胺（LAST和meprin）直接与虾青素家族特异性谷氨酸结合β)或甘氨酸（myroilysin）或由溶剂分子介导，因为N末端片段短一个残基（astacin）。新的N末端在酶原中的位置和成熟部分在虾青素中的位置非常接近（～2 Å; 图4b条)，离梅普林很近β(∼6 Å; 图4c（c）)，最后距离更远（～11 Å; 图4一)最远的是myroilsin（～17 Å; 图4d日).

对四个酶原-成熟酶对的详细分析表明，在所有情况下，PP的规则二级结构都很差，并且采用了一种主要延伸的构象，该构象沿着与底物相反的方向穿过活性位点裂缝。在原甲素中，它在N端被额外拉长，并沿着NTS的前表面进一步延伸（图4d日)，而在原-蛋氨酸中β（图4c（c）)它沿着CD右侧的相邻TRAF结构域以延伸构象运行（未显示）。在所有情况下，构成活性部位裂口底部非质膜侧的CTS区域构成激活片段，在成熟分裂和新N末端重新定位时进行重排。在虾青素中，只有这个激活片段（I₁₃₀–E₁₃₉，根据PDB条目进行成熟酶编号第一次; 全基因编号增加49；参见UniProt P07584）重组，而分子的其余部分在酶原（格瓦拉等。, 2010; 图4b条). 接下来，LAST最有可能经历两个片段的轻微重排（G¹⁹⁹–D²⁰⁶和E¹⁵⁰–E¹⁷⁹)除了激活段的主要运动（P¹⁸⁰–否¹⁸⁷; 见第3.4节和图4一). 梅普林β反过来，重新定位其大部分CTS（Q₁₆₄–Y₂₁₁和L₁₉₉–D₂₃₃根据UniProt Q16820；段D₁₉₄–左₁₉₉在酶原结构中被扰乱），在一个协调的铰链运动中，完全闭合其底部的裂缝以响应成熟（图4c（c）). 最后，在粘液溶素中观察到最大偏差，它重新排列了除Met-turn和C末端螺旋外的整个CTS（图4d日). 受影响的部分为Q₁₅₅–A₂₀₁和Y₂₁₀–否₂₂₅（根据PDB条目进行溶血素编号5千兆瓦; 另请参见UniProt A0A0P0DZ84）。大襟翼（N₁₆₀–S₁₉₃)它包含两个螺旋，折叠在活性位点裂缝的顶部，并将PP捕获在酶原中。成熟后，此皮瓣向右旋转，最大移位约17 ？（在P处测量₁₇₆)从而解放了通往裂缝的通道（图4d日).

酶原中阻断锌离子的残基也存在差异。三种后生动物蛋白质在PP基序中含有天冬氨酸，该基序在结构上是保守的（图4e（电子）)，充当天冬氨酸开关。相比之下，细菌酶缺乏PP基序，而是具有半胱氨酸，半胱氨酸根据“半胱氨酸开关”机制阻断锌（Ran等。, 2020; 徐等。, 2017). 此外，半胱氨酸侧翼的多肽链是典型的延伸构象，不采用PP基序的环。总的来说，这与MMPs相反，在MMPs中，典型脊椎动物的直系亲属根据半胱氨酸转换机制调节潜伏期（Springman等。, 1990; van Wart和Birkedal-Hansen，1990年; 罗森布拉姆等。, 2007; 塔兰特，马拉罗等。, 2010; 阿洛拉斯等。, 2018)，而来自牙周病病原体的细菌同源karilysin连翘单孢菌而是根据天冬氨酸开关进行操作。与虾青素一样，基质金属蛋白酶仅在动物外分散存在，并且有人提出，karilysin是通过宿主和定殖细菌之间的密切相互作用促进水平基因转移而从哺乳动物宿主中共生的外来物种（Cerdá-Costa等。, 2011). 考虑到以下情况，可以想象虾青素中的粘液溶素也有类似的来源Myroides公司据报道，几种体液中存在spp.，可引发感染，导致人类软组织感染（马拉基等。, 2012)糖尿病患者（Endicott-Yazdani等。, 2015). 因此，与基质金属蛋白酶一样，原生动物和细菌异种动物的潜伏期机制在虾青素中也会有所不同。