The impact of molecular variants, crystallization conditions and the space group on ligand–protein complexes: a case study on bacterial phosphotriesterase

Dym, O.; Aggarwal, N.; Ashani, Y.; Leader, H.; Albeck, S.; Unger, T.; Hamer-Rogotner, S.; Silman, I.; Tawfik, D.S.; Sussman, J.L.

doi:10.1107/S2059798323007672

研究论文

结构
生物学

国际标准编号：2059-7983

第79卷| 第11部分| 2023年11月| 第992-1009页

https://doi.org/10.107/S2059798323007672

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分子变体、结晶条件和空间组配体-蛋白质复合物的研究&以细菌磷酸三酯酶为例

^一以色列雷霍沃特魏茨曼科学研究所生命科学系核心设施，^b条以色列Rehovot Weizmann科学研究所生物分子科学系，^c（c）以色列Rehovot Weizmann科学研究所脑科学系^d日以色列雷霍沃特魏茨曼科学研究所化学和结构生物学系
^*通信电子邮件：orly.dym@weizmann.ac.il，joel.sussman@weizmann.ac.il

J.Newman编辑，澳大利亚新南威尔士州悉尼(收到日期：2023年7月18日； 2023年9月3日接受；在线2023年10月20日)

以细菌磷酸三酯酶为实验范式，研究了多种因素的影响，如分子结构、蛋白质表达和纯化过程中使用的配体、结晶条件和空间组，配体与靶酶分子复合物的可视化。在这种情况下，所使用的配体是有机磷，是神经毒剂和杀虫剂的片段，酶在这些片段上起生物捕集剂的作用。分析了通过定向进化获得的各种磷酸三酯酶结构的12个晶体结构，分辨率高达1.38 Å. 研究了与有机磷配体络合的载脂蛋白形式和完整形式。利用从三种不同结晶条件下获得的晶体，在四个空间群中结晶，有和没有N末端标记，来研究这些因素对可视化酶的有机磷络合物的影响。研究表明，用于蛋白质表达的标记可以停留在活性位点并阻碍配体结合。此外空间组其中蛋白质结晶会显著影响结合配体的可视化。还观察到结晶沉淀剂可以与配体结合竞争，甚至排除配体结合，从而导致假阳性或导致对候选先导药物的错误识别。其中一个共结晶条件使我们能够定义空间，以容纳有机磷酸盐底物的几种产品在脱附后附着在P原子上的取代基离开组。磷酸三酯酶与有机磷产品配合物的晶体结构显示，P-O键的两个部分带电的O原子与暴露的O原子之间的短相互作用距离相似β-锌²⁺离子和埋藏物α-锌²⁺离子。这表明锌²⁺离子在稳定底物水解的过渡态中起作用。总的来说，这项研究为研究配体-蛋白质复合物的晶体结构所涉及的挑战和考虑提供了有价值的见解，强调了仔细的实验设计和严格的数据分析在确保生成的磷酸三酯酶-有机磷结构的准确性和可靠性方面的重要性。

关键词：结晶条件;锌离子;磷酸三酯酶类;有机磷酸盐;空间组;生物探测仪;表达系统.

PDB参考：A53_1，8p7f;A53_2，第7小时8点;A53_3，8p7i;A53_4，8p7k;A53_5，8米7米;C23_1，8p7n;C23_2，8p7q;C23_3，8p7r;C23_4，8p7s;C23_5，8p7吨;C23M_1，8p7u;C23M_2，8p7v

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1.简介

基于结构的药物设计是药物发现中的一个强大工具，允许研究人员预测潜在药物将如何与其靶蛋白相互作用。X射线晶体学广泛用于获取有关先导化合物与目标蛋白复合物的详细结构信息，但也有一定的局限性，可能影响所确定结构的准确性和可靠性。约175年的75% 使用蛋白质数据库（PDB；Berman）中的X射线晶体学测定了000个大分子结构等。, 2000 ; 白肋烟等。, 2022 ; 苏斯曼等。, 1998 )含有近5000种独特配体中的至少一种。由于纯化或结晶过程（Dym等。，2016年 ; 纽曼，2004 )而其他人则被故意添加到样本中以研究蛋白质功能或在基于结构的药物设计的背景下。

所使用的实验信息是蛋白质和配体的电子密度。我们能够正确解释电子密度，从而确定蛋白质和配体原子位置的程度，决定了结构的准确性和可靠性。尽管有严格的验证工具可用于评估蛋白质-配体结构的准确性，但在PDB中沉积的一些结构中，会遇到对配体电子密度的过度热情解释。这可能导致配体的位置不支持电子密度。另一个可能出现的问题是配体的身份分配不正确（Dauter等。, 2014 ; 魏钦伯格等。, 2015 ). 当电子密度图不够清晰，无法进行明确解释时，就会发生这种情况。最后，在某些情况下，可能无法完全计算电子密度，从而再次导致不确定或错误的分配。因此，尽管蛋白质-配体复合物的晶体研究为药物发现提供了一个有价值的实验工具，但它们需要仔细解释和验证实验数据。在这里，我们讨论了在研究有机磷酸-磷酸三酯酶复合物时遇到的一些困难，以及如何克服这些困难。

这项研究是基于我们对开发新疗法治疗杀虫剂和神经毒剂引起的有机磷（OP）中毒的长期兴趣。磷酸三酯酶（PTE）能够水解此类OP化合物。因此，它具有许多细菌来源的特征，包括验证对微生物截留性能(Bd公司; 从前缩小假单胞菌),黄杆菌属spp.和放射根杆菌（比格利等。, 2013 ; 切尼等。, 2013 ; 戈德史密斯等。，2016年 ; 哈珀等。, 1988 ; 霍恩等。2002年 ; Masson&Rochu，2009年 ). 本研究的重点是Bd公司_PTE（Holm&Sander，1997年 )，一种二聚金属水解酶，具有(β/α)₈带两个Zn的TIM基带褶皱²⁺嵌入活性部位的离子（图1). 二氧化碳与Lys169侧链反应生成氨基甲酸酯功能群在活性位点内，作为桥接配体α-锌²⁺和β-锌²⁺离子，这两种离子都需要催化活性（本宁等。, 1995 ). 被埋葬的α-锌²⁺离子通过与His55、His57和Asp301的直接相互作用与蛋白质连接β-锌²⁺离子与His201和His230相互作用（图1b条).

图1
典型PTE结构视图（PDB条目1小时; 本宁等。, 2001

). (一)(β/α)₈TIM桶形折叠如卡通所示，螺旋为红色，薄片为黄色，线圈为绿色α-锌²⁺（埋地）和β-锌²⁺（暴露的）离子呈洋红色球体，单个桥接水呈青色球体。与两个锌结合的六个残基²⁺离子显示为棒状表示，C原子为黄色，N原子为蓝色，O原子为红色。N和C末端残基分别标记为N和C。(b条)apo PTE结构的活性位点的特写视图。被埋葬的α-锌²⁺离子直接与His55、His57和Asp301结合，而β-锌²⁺离子与His201和His230绑定。氨基甲酸酯功能群结合Lys169与两种锌相互作用²⁺离子。着色如中所示(一).

人们对利用能够水解OP的酶降解和处置基于OP的神经毒剂和杀虫剂产生了浓厚兴趣（Singh，2009 ). 为此目的开发高效酶变体的最初努力是将人类对氧磷酶1（hPON1）作为多轮定向进化的起点，结合计算设计和定点突变（Aharoni等。, 2005 ; 古普塔等。, 2011 ; 沃雷克等。, 2014 ).

然而，最近，细菌磷酸三酯酶（PTEs）已被证明具有更大的潜力，并在过去二十年中被广泛使用，以产生对广泛感兴趣的OP具有高催化效率的变体（Bigley等。, 2015 ; 切尼等。, 2013; 戈德史密斯等。，2016年, 2017 ; 格里姆斯利等。, 2005 ; 威尔·杰克逊等。, 2009 ; 麦克劳林等。, 2005 ; 济等。, 2012 ; 杨等。, 2003 , 2014 ). 因此，已经产生了可作为预防和治疗V型和G型神经毒剂中毒的有效解毒剂的变体（Cherny等。, 2013; 德斯波托维奇等。, 2019 ; 戈德史密斯等。，2016年, 2017). 最近，从一种海洋细菌中分离出的PTE允许在农药类似物上生长，作为唯一的磷源，这表明海洋细菌可能用于修复各种含OP污染物（Despotović等。, 2022 ).

自从进化出的PTE支架被证明是高效的生物探测仪以来在体外和体内重要的是要弄清其活性位点的结构特征。迄今为止，载脂蛋白PTE和OP–PTE复合物的75种晶体结构如表1所示，为绘制其活动站点提供了宝贵的信息。我们认为确定先进PTE变体的晶体结构很重要，如果可能的话，还应确定其与OP复合体的晶体结构，以便更好地理解导致其功效增强的结构特征。本研究主要针对三种PTE变体，即A53、C23和C23M（图2b条)，分别对应于G5-A53、G5-C23和G5-B60，如前所述（Cherny等。, 2013). 与野生型PTE相比，这些变体在降解和解毒OP方面表现出更高的效率。研究了以下特征。

表1
PTE的晶体结构

没有。	PDB代码	活性部位配体	分辨率（Ω）	参考
Apo公司
1	4az色	锌²⁺	1.55	坎贝尔等。(2016)
2	4个百分点	锌²⁺	1.54	坎贝尔等。(2016)
三	4兹斯特	有限公司²⁺	2.01	比格利等。(2015)
4	4zsu型	有限公司²⁺	2.01	比格利等。(2015)
5	300万	有限公司²⁺	1.95	济等。(2012)
6	3ura（乌拉）	有限公司²⁺	1.88	济等。(2012)
7	第二组第三组	锌²⁺	1.04	J.Kim、U.A.Ramagopal、P.Tsai、F.M.Raushel和S.C.Almo（未出版作品）
8	1个pta	无金属离子	2.1	本宁等。(1994)
9	1页6b	锌²⁺	1.9	希尔等。(2003 )
10	4加仑	锌²⁺	1.85	德力等。(2012)
11	6制动马力	锌²⁺	1.4	C.M.Miton、E.C.Campbell、C.J.Jackson和N.Tokuriki（未出版作品）
12	3a4j公司	有限公司²⁺	1.25	富·杰克逊等。(2009)
13	3a3倍	有限公司²⁺	1.7	富·杰克逊等。(2009)
14	6千兆字节	锌²⁺	1.9	赫尔松斯基等。(2018 )
15	6千兆字节	锌²⁺	1.63	科尔松斯基等。(2018)
16	3周	有限公司²⁺和铁²⁺	1.63	科尔松斯基等。(2018)
17	5周7小时	锌²⁺	2.75	坎贝尔等。(2018 )
18	5vej公司	有限公司²⁺	1.3	塞勒克等。（2017年 )
活性部位含有二甲氨基甲酸酯/乙二醇/甘油
1	4倍d3	锌²⁺和二甲氨基甲酸酯	1.57	坎贝尔等。(2016)
2	4倍d4	锌²⁺和二甲氨基甲酸酯	1.9	坎贝尔等。(2016)
三	4xd5型	锌²⁺和碳酸二甲酯	1.85	坎贝尔等。(2016)
4	4×d6	锌²⁺和二甲氨基甲酸酯	1.75	坎贝尔等。(2016)
5	4页	锌²⁺和二甲氨基甲酸酯	1.66	坎贝尔等。(2016)
6	4袋	锌²⁺和二甲氨基甲酸酯	1.6	坎贝尔等。(2016)
7	4路	锌²⁺和二甲氨基甲酸酯	1.84	坎贝尔等。(2016)
8	4磅当量	锌²⁺和二甲氨基甲酸酯	1.51	坎贝尔等。（2016年)
9	4磅/平方英尺	锌²⁺和二甲氨基甲酸酯	1.9	坎贝尔等。(2016)
10	4个百分点	锌²⁺和二甲氨基甲酸酯	1.63	坎贝尔等。(2016)
11	3电流2	有限公司²⁺和咪唑	2	济等。(2012)
12	3立方厘米2	有限公司²⁺和二甲氨基甲酸酯	1.95	基姆等。(2008)
13	2夸尔	锌²⁺和甘油	1.8	J.Kim、F.M.Raushel和S.C.Almo（未出版作品）
14	2o4米	锌²⁺和二甲氨基甲酸酯	1.64	J.Kim、U.A.Ramagopal、P.Tsai、F.M.Raushel和S.C.Almo（未出版作品）
15	第2季度	锌²⁺和二甲氨基甲酸酯	1.95	基姆等。(2008)
16	4加仑1	锌²⁺和二甲氨基甲酸酯	1.5	德力等。(2012)
17	1吉克	镉²⁺和乙二醇	1.3	本宁等。(2001)
18	1小时	锌²⁺和乙二醇	1.3	本宁等。(2001)
19	第2天第2天	有限公司²⁺和乙二醇	1.75	杰克逊等。(2005)
20	1i0b公司	锰²⁺和乙二醇	1.3	本宁等。(2001)
21	5周	锌²⁺和二甲氨基甲酸酯	1.46	C.M.Miton、E.C.Campbell、C.J.Jackson和N.Tokuriki（未发表的作品）
22	5周j0	锌²⁺和二甲氨基甲酸酯	1.65	C.M.Miton、E.C.Campbell、C.J.Jackson和N.Tokuriki（未出版作品）
23	5向导	锌²⁺和二甲氨基甲酸酯	1.96	C.M.Miton、E.C.Campbell、C.J.Jackson和N.Tokuriki（未出版作品）
24	5周	锌²⁺和二甲氨基甲酸酯	1.75	C.M.Miton、E.C.Campbell、C.J.Jackson和N.Tokuriki（未出版作品）
25	5个工作包	锌²⁺和二甲氨基甲酸酯	1.50	C.M.Miton、E.C.Campbell、C.J.Jackson和N.Tokuriki（未出版作品）
26	5瓦/小时	锌²⁺和二甲氨基甲酸酯	1.60	C.M.Miton、E.C.Campbell、C.J.Jackson和N.Tokuriki（未出版作品）
27	6百马力	锌²⁺和二甲氨基甲酸酯	1.40	C.M.Miton、E.C.Campbell、C.J.Jackson和N.Tokuriki（未出版作品）
28	1i0d个	锌²⁺，镉²⁺和乙二醇	1.3	本宁等。(2001)
29	上午6点	锌²⁺和二甲氨基甲酸酯	1.46	C.M.Miton、E.C.Campbell、C.J.Jackson和N.Tokuriki（未出版作品）
30	3季度	有限公司²⁺和乙二醇	1.9	伊利等。（2010年 )
31	6制动马力7	锌²⁺和二甲氨基甲酸酯	1.40	C.M.Miton、E.C.Campbell、C.J.Jackson和N.Tokuriki（未出版作品）
32	6千兆字节	锌²⁺和二甲氨基甲酸酯	1.95	科尔松斯基等。(2018)
活性部位有底物类似物/抑制剂
1	4e3吨	己基（萘-2-酰氧基）膦酸（在一个单体中）	1.65	德力等。(2012)
2	第6页第2页	己基（萘-2-酰氧基）膦酸	1.77	德力等。(2012)
三	3欧元5	有限公司²⁺和磷酸二乙酯	1.6	济等。(2012)
4	3urb（城市）	有限公司²⁺和磷酸二乙酯	1.77	济等。(2012)
5	3瓮	有限公司²⁺和甲基膦酸环己酯	1.95	济等。(2012)
6	3个urq	有限公司²⁺和甲基膦酸环己酯	2.1	济等。(2012)
7	3袋	有限公司²⁺和磷酸氢二乙酯	1.83	基姆等。(2008)
8	3e3小时	有限公司²⁺和4-甲基苄基膦酸二乙酯	2.15	里夫斯等。(2008 )
9	第1季度7^{^}	有限公司²⁺和4-甲基苄基膦酸盐（不在活性部位）	1.9	格里姆斯利等。(2005)
10	1年	锌²⁺和磷酸三乙酯	1.9	本宁等。(2000)
11	1盎司2	锌²⁺和甲基膦酸二异丙酯	1.9	本宁等。(2000)
12	1分米	锌²⁺和4-甲基苄基膦酸二乙酯	2.1	范胡克等。(1996)
13	2d2克	有限公司²⁺和硫代磷酸氢二甲酯	1.85	杰克逊等。(2005)
14	2小时	有限公司²⁺和磷酸三甲酯	1.8	杰克逊等。(2005)
15	3个7	有限公司²⁺和磷酸根离子	2.2	伊利等。(2012 )
16	3c86公司	有限公司²⁺和二乙基硫代磷酸氢	1.8	杰克逊等。(2008 )
17	1磅/平方英寸	镉²⁺和4-甲基苄基膦酸二乙酯（不在活性部位）	2	本宁等。(1995)
18	2r100万	铁²⁺，公司²⁺和磷酸氢二乙酯	1.55	杰克逊等。(2008)
19	第二个	铁²⁺，公司²⁺和4-甲基苄基膦酸二乙酯	1.7	杰克逊等。(2008)
20	2r1000个	铁²⁺，公司²⁺和磷酸氢二乙酯	2.1	杰克逊等。(2008)
21	第二位	铁²⁺，公司²⁺和O（运行），O（运行）-三磷酸氢二乙酯	1.95	纳克维等。(2014 )
22	3岁	有限公司²⁺和4-甲基苄基磷酸二乙酯	1.89	伊利等。(2010)
23	4np7型	铁²⁺，公司²⁺和O（运行），O（运行）-三磷酸氢二乙酯	1.99	伊利等。(2010)
24	第7页85	锌²⁺和4-甲基苄基膦酸乙酯	1.47	工作等。(2023)
25	3a3周	有限公司²⁺和4-甲基苄基磷酸二乙酯	1.85	富·杰克逊等。(2009)

图2
PTE变体。(一)在因子Xa裂解基序（IEGR）和八肽间隔序列之前融合的麦芽糖结合蛋白（MBP）的示意图，²⁶ISEFITNS公司³³然后是从Gly34开始的成熟PTE蛋白序列。因子Xa在裂解基序的精氨酸残基后裂解，留下²⁶ISEFITNS公司³³连接到PTE的连接器，Gly34–Ser365。(b条)wt PTE、PDB条目的序列比对1小时、A53、C23、C23M、A53_T、C23_T和C23M_T。最后三个带有八肽标签。PDB入口的二级结构元素1小时标记在路线上方：α-螺旋线和3₁₀-螺旋线（用符号表示η)由线圈和β-用箭头绞合。所有变体中保守的残基均为红色。使用MultAlin公司（Corpet，1988年

)图形是使用创建的电子脚本（Robert&Gouet，2014）

（i）保留用于蛋白质表达的残余标记的效果。

（ii）使用A53、C23和C23M的三种不同结晶条件来优化PTE-OP络合物的形成。

（iii）四个不同的空间群允许研究晶体堆积对PTE–OP复合物形成的影响。

（iv）使用四种不同的OP配体可以识别配体特异性相互作用以及三种PTE变体之间这些相互作用的差异。

2.材料和方法

2.1. PTE变异体的表达和纯化

PTE变异体在没有融合蛋白或标签的情况下表达，或者作为与麦芽糖结合蛋白（MBP）的融合蛋白表达。在后一种情况下，MBP通过因子Xa裂解基序与PTE融合：IEGR（Cherny等。, 2013)和八个氨基酸残基的间隔序列：ISEFITNS（参见图2中的示意图一). 使用MBP融合伙伴的目的是增加PTE变体的表达水平和溶解度。然而，在结晶试验之前，通过因子Xa消化去除MBP融合伙伴。

2.1.1. 无标签PTE变体的表达

PTE建造A53、C23和C23M（Cherny等。, 2013)根据修改后的协议（Tokuriki）生成等。, 2012 ; 图2b条). 这些变体（残基Gly34–Ser365）没有任何标签，被克隆到pET-21中。他们是5岁大的 l文化大肠杆菌BL21细胞在30°C下用0.5 米M（M）异丙基β-D类-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）。细菌颗粒于20年重新悬浮米M（M）HEPES pH 7.5补充0.1 米M（M）氯化锌₂将细胞超声处理2 min，采用30脉冲 s开，30 s关，在4°C下，在Vibracell仪器（美国康涅狄格州纽敦市超音速材料公司）中以35%的振幅。将澄清的裂解液装入HiTrap DEAE FF 5 ml柱（GE Healthcare）预平衡0.1 米M（M）氯化锌₂, 20 米M（M）HEPES pH值7.5。含PTE的部分用0–1洗脱 M（M）同一缓冲液中的NaCl梯度。对含有PTE的峰馏分进行透析，对比0.1 米M（M）氯化锌₂, 50 米M（M）MES pH 6.0并加载到Tricorn Mono S 10/100 GL阳离子交换柱（GE Healthcare）上，用相同的缓冲液进行平衡。再次用0–1洗脱PTE M（M）同一缓冲液中的NaCl梯度。然后将含有PTE的馏分浓缩至5 ml并加载到凝胶过滤柱（HiLoad Superdex 75 16/60）上，用50平衡米M（M）氯化钠，25 米M（M）HEPES pH 8.0。集合洗脱液将组分应用于Tricorn Q 10/100 GL阴离子交换柱上，该柱与50 米M（M）Tris pH 8.0，用0–1洗脱 M（M）同一缓冲液中的NaCl梯度。最后的蛋白质溶液浓缩至13-17 毫克毫升⁻¹用于结晶筛选。

2.1.2. MBP-PTE融合蛋白的表达与纯化

为了提高PTE的表达水平和溶解性，将麦芽糖结合蛋白（MBP）作为融合伴侣引入三种PTE变体中，同时引入因子Xa切割基序序列：IEGR（Zhao等。, 2013 )然后是PTE之前的八肽间隔物（ISEFITNS）（图2一). 如前所述，表达并纯化这些融合蛋白（Cherny等。, 2013). 简而言之，大肠杆菌用携带所需突变的PTE质粒转化BL21细胞。这个大肠杆菌BL21细胞在37°C的溶原肉汤中培养过夜（LB；Bertani，1951 )补充氨苄西林（100 微克毫升⁻¹). 然后对其进行继代培养[1%(v（v）/v（v）)LB中添加0.2 米M（M）氯化锌₂和氨苄西林（100 微克毫升⁻¹)并允许在37°C下生长至OD_600 纳米达到0.6–0.8，然后导入0.4 米M（M）IPTG和14-18年的进一步增长 h，温度为20°C。细胞颗粒悬浮在缓冲液中A类(0.1 米M（M）氯化锌₂, 10 米M（M）氯化钠_三, 100 米M（M）氯化钠，100 米M（M）Tris pH 8.0），含0.4 毫克毫升⁻¹溶菌酶，50单位的苯甲酸酶和1 米M（M）苯甲基磺酰氟，并按照所述对未包装的蛋白质进行超声处理。在7500℃下离心获得透明细胞裂解物转速最小值⁻¹对于30 最小直链淀粉珠与缓冲液平衡A类被塞进了一个10 ml柱。通过重力将澄清的裂解液加载到柱上，并用缓冲液清洗A类MBP-PTE融合变体用10 米M（M）缓冲液中的麦芽糖A类用12%SDS–PAGE分析洗脱部分。合并含有MBP-PTE的级分，并对照缓冲液透析过夜A类.蛋白质浓度测量值为280 使用95的MBP-PTE摩尔消光系数 800 厘米⁻¹ M（M）⁻¹.

对于结晶试验，A53、C23和C23M变体在2.5–5 l文化如上所述。使用细胞破碎器（Constant Systems，Low March，United Kingdom）对悬浮颗粒进行破碎，并通过离心进行澄清，然后将其应用于含有直链淀粉颗粒的柱上。MBP-PTE变体用麦芽糖洗脱，MBP用25 每800μg因子Xa ml培养基（赵等。, 2013)对于40 4°C时为h。清洗后，将溶液在装有新鲜直链淀粉珠的色谱柱上传递四次，以保留劈开的MBP和任何剩余的未劈开MBP-PTE，而无标记PTE出现在流动中。在PTE仍被残留MBP污染的某些情况下，使用阴离子交换柱将无标签PTE与残留MBP分离。在这些情况下，对蛋白溶液进行透析，以0.1 米M（M）氯化锌₂，10%甘油，200 米M（M）氯化钠，20 米M（M）Tris pH 8.0并加载到Tricorn Q10/100色谱柱上（GE Healthcare）。在这些条件下，在柱的流动中获得了纯PTE，而保留了MBP。根据缓冲液透析无标签PTEA类并浓缩至～11 毫克毫升⁻¹.

2.2. OP配体的合成

2.2.1. 甲基膦酸

甲基膦酸（图3一)通过滴加266得到 mg甲基膦酰氯在3中 ml丙酮至5 毫升H₂4°C时为0。在室温（RT）下放置三天后，在真空下除去水和丙酮的混合物，生成粘性油，然后固化。只有一种³¹观察到P-NMR信号化学变换(δ)第页，共34.0页下午D点₂O.该信号对应于甲基膦酸中P原子的共振（图3一).

图3
用PTE变体结晶的甲基膦酸酯。(一)甲基膦酸(b条)O（运行）-乙基甲基膦酸(c（c）)O（运行）-乙基-O（运行）-(N个，N个-二异丙基氨基乙基）甲基膦酸盐（VX的氧代类似物）(d日)O（运行）-异丙基甲基膦酸。在所有四个结构中，CH_三部分指向远离观察平面的方向，因此看不到。OP显示为条形图，其中C原子为黄色，N原子为蓝色，O原子为红色，P原子为橙色。

2.2.2.O（运行）-乙基甲基膦酸

100的溶液毫克O（运行）-乙基甲基膦酰氯（Levy&Ashani，1986 )在5中将ml丙酮逐滴添加至10 毫升H₂O，4°C，搅拌30 min。在真空下除去水和丙酮的混合物，得到粘性油。这个³¹核磁共振波谱δD区下午35.5点₂O.该信号对应于中P原子的共振O（运行）-乙基甲基膦酸（图3b条).

2.2.3.O（运行）-乙基-O（运行）-(N个，N个-二异丙基氨基乙基）甲基膦酸酯

O（运行）-乙基甲基膦酰氯（7.7 25中的g ml干醚）滴入等摩尔量为5的冷（冰碱）溶液中 g三乙胺和7.5 克N个，N个-30中的二异丙基氨基乙醇 ml干燥乙醚以获得O（运行）-乙基-O（运行）-(N个，N个-二异丙基氨基乙基）甲基膦酸酯（图3c（c）). 搅拌48后在室温下h，过滤掉沉淀的固体，并用冷蒸馏水多次清洗乙醚。乙醚用无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下除去，留下8.5 g淡黄色粘性油。A类³¹P-NMR信号在δ第页，共33.8页 CDCl中的p.p.m_三此信号对应于中P原子的共振O（运行）-乙基-O（运行）-(N个，N个-甲基膦酸二异丙基氨基乙酯（图3c（c）). 化学位移和信号模式¹H-NMR光谱（300 兆赫，CDCl_三)与纯化配体的结构一致。δ：4.08（m，10条线，2H），2.85（m，十条线，3H），2.97（隔，2H。

2.2.4.O（运行）-异丙基甲基膦酸

O（运行）-通过反应合成了异丙基甲基膦酰氯O（运行），O（运行）-甲基膦酸二异丙酯与草酰氯按照上述方法进行O（运行）-乙基甲基膦酰氯。因此，7.8 克O（运行）-搅拌时逐滴添加异丙基甲基膦酰氯至60 ml水在冰浴中预冷。60岁之后 min，在真空下除去水，剩余油溶解于100 ml苯。有机溶液在无水硫酸钠上干燥，过滤并在真空下蒸发，留下～5 g无色油。只有一种³¹观察到P-NMR信号δ第页，共36.0页下午，D₂O.该信号对应于中P原子的共振O（运行）-异丙基甲基膦酸（图3d日).

2.2.5. wt PTE与OP产物配体配合物离解常数的测定

为了确定PTE和两种酸产品之间的结合强度，甲基膦酸（图3一)和O（运行）-乙基甲基膦酸（图3b条)，使用Lineweaver–Burk slopes（Radić等。1993年 ). 将越来越多的OP酸添加到1 米M（M）对氧磷50 米M（M）氯化钠，50 米M（M）Tris pH 8.0，含0.1%Tergitol。在前2段中记录了wt PTE水解对氧磷的初始速度 min，通过监测第页-400时的硝基苯酚纳米。

2.3. 结晶和结构测定PTE变体

三种PTE变体A53、C23和C23M的晶体在19°C下使用蚊子机器人（SPT Labtech，Cambridge，Massachusetts，USA）通过吊滴蒸汽扩散技术生长。PTE变体的晶体是在三种不同的结晶条件下获得的：（i）聚乙二醇（PEG）6000和2-甲基-2,4-戊二醇（MPD），（ii）甘油和硫酸铵（AS）和（iii）聚丙烯酸（PAA）。晶体生长在四个不同的空间群中：P（P）2₁2₁2（PEG 6000和MPD，A53_1），P（P）2₁2₁2₁（PEG 6000和MPD，C23_1），P（P）2₁（PEG 6000和MPD，A53_3；PAA，A53_4）和P（P）4_三2₁2（AS和甘油、A53_2、A53_5、C23_2、C23_3、C23_4、C23~5、C23G_1和C23M_2）。除C23_1外，晶体衍射到1.38–2.00范围内的高分辨率 Å. 结晶优化实验是使用吊滴蒸汽扩散技术手动设置的。四个甲基膦酸配体与A53、C23和C23M变体共结晶（图3). 分析了12种晶体结构，包括载脂蛋白A53、C23和C23M变体，以及与膦酸配体的几种配合物。

X射线数据采集是在低温条件下进行的（100 K）在Rigaku RU-H3R仪器内部或法国格勒诺布尔ESRF的波束线ID14-4和ID23-1上（表2). 所有衍射图像均使用索引和积分MOSFLM公司（莱斯利和鲍威尔，2007年 )积分反射用SCALA公司（埃文斯，2006年 ). 使用以下公式计算结构因子振幅截断（弗伦奇和威尔逊，1978年 )来自中央处理器4套房（Agire等。, 2023 ). 载脂蛋白A53（A53_1）的结构由分子置换具有相位器（麦考伊等。, 2007 )使用同源的精细结构Bd公司_PTE（PDB条目1小时; 本宁等。, 2001 )作为起始模型。原子的所有步骤精细化用REFMAC公司（穆尔舒多夫等。, 2011 )和凤凰（利布施内尔等。, 2019 ). 模型被构建到电子密度图中，使用库特（埃姆斯利等。, 2010 ). 随后，将精制A53_1结构用作模型，以确定所有其他PTE变体的结构（表2). 所有模型都使用进行了优化PDB-重做（乔斯顿等。, 2014 )和进行了评估摩尔概率（陈）等。, 2010 ). 的详细信息细化统计如表2所示A53_1、A53_2、A53_3、A54_4、A53_5、C23_1，C23_2、C23_3，C24_4，C23_5，C23M_1和C23M_2结构的坐标已以PDB代码存放在蛋白质数据库中8页7页，第87小时8点，8p7i型，87公里，8p7米，8p7n（第7页），第87页，8页7页，8页7秒，8p7吨，8p7u和8p7伏分别是。

表2
结晶、数据收集和细化统计对于PTE

括号中的值表示最高分辨率外壳。

	A53_1型	A53_2型	A53_3型	A53_4型	A53_5页	C23_1型
活性部位配体	载脂蛋白，1锌⁺²	阿波，X3B	载脂蛋白，X3E	聚丙烯酸	甲基膦酸盐	阿波
结晶条件	12%聚乙二醇6000，5%MPD，0.1 M（M）HEPES pH值7.5	1.5 M（M）（NH₄)₂SO公司₄，17%甘油，0.1 M（M）Tris pH值7.5	16%聚乙二醇6000，2%MPD，0.1 M（M）HEPES pH值7.5，0.1 M（M）甘氨酸	22%聚丙烯酸，0.02 M（M）氯化镁₂, 0.1 M（M）HEPES pH值7.5	1.5 M（M）（NH₄)₂SO公司₄，12%甘油，0.1 M（M）Tris pH 7.5	10%聚乙二醇6000，2%聚乙二醇400，15%MPD，0.1 M（M）HEPES pH 7.5
数据收集
来源	ID14-4，欧洲战略参考框架	Rigaku家庭来源	里加库主场来源	Rigaku家庭来源	Rigaku家庭来源	ID14-4、ESRF
PDB代码	8页7页	8p7小时	8p7i型	87公里	8p7米	8p7n（第7页）
“空间”组	P（P）2₁2₁2	P（P）4_三2₁2	P（P）2₁	P（P）2₁	P（P）4_三2₁2	P（P）2₁2₁2₁
一，b条，c（c）(Å)	79.70, 93.67, 44.59	69.67, 69.67, 186.83	54.23, 81.25, 70.66	55.03, 81.49, 70.81	69.74, 69.74, 186.76	88.89, 119.90, 161.49
α，β，γ(°)	90, 90, 90	90, 90, 90	90, 94.80, 90	90, 94.99, 90	90, 90, 90	90, 90, 90
非对称单元中的副本	1	1	2	2	1	4
分辨率（Ω）	39.85–2.00	25.48–1.77	36.77–1.70	32.37–1.93	27.94–1.85	77.78–3.20
外壳（Ω）	2.071–2.00	1.84–1.77	1.76–1.70	2.00–1.93	1.92–1.85	3.31–3.20
独特的反射	23037 (2273)	44626 (4284)	67098 (6633)	46379 (4410)	39668 (3811)	29131 (2870)
完整性（%）	98.91 (99.91)	97.93 (95.84)	99.69 (98.94)	98.69 (93.67)	98.24（96.43）	99.61 (99.90)
平均值我/σ(我)	12.50 (4.20)	22.90 (7.40)	20.06 (4.06)	10.80 (2.16)	36.19 (11.23)	7.24 (2.64)
多重性	5.3 (5.5)	17.0 (16.7)	6.1 (5.8)	3.5 (2.9)	17.2 (17.0)	4.1 (4.2)
科科斯群岛_1/2	0.727 (0.638)	0.952 (0.910)	0.925 (0.925)	0.995 (0.772)	1 (0.989)	0.987 (0.823)
R（右）_下午。	0.218 (0.306)	0.086（0.141）	0.024 (0.176)	0.052（0.338）	0.014 (0.063)	0.09627 (0.3261)
精炼
分辨率范围（Å）	39.85–2.00	25.48–1.77	36.77–1.70	32.37–1.93	27.94–1.85	71.41–3.20
反思[我/σ(我)>0]	23010 (2271)	44611	67085	46363	39642	29063
测试集中的反射	2000 (197)	4283	3397	2355	3809	1412
R（右）_工作/R（右）_自由的	0.2014/0.2297	0.1574/0.1894	0.1511/0.1808	0.1593/0.2119	0.1612/0.1876	0.1830/0.2546
蛋白质原子	2163	2535	5067	5015	2506	9890
水分子	86	401	537	463	313	8
总体平均值B类系数（Ω²)	41.93	20.23	25.16	27.32	18.52	44.15
根-平方偏差
粘结长度（Ω）	0.007	0.006	0.006	0.007	0.006	0.010
粘结角度（°）	0.85	0.85	0.85	0.83	0.92	1.21
拉马钱德兰阴谋
最受欢迎（%）	97.50	96.94	97.58	97.25	97.24	95.69
额外允许（%）	2.14	3.06	2.42	2.75	2.76	4.08
不允许（%）	0.36	0	0	0	0	0.23

	C23_2型	C23_3型	C23_4型	C23_5型	C23M_1型	C23M_2型
活性部位配体	O（运行）-甲基膦酸异丙酯	甲基膦酸盐	O（运行）-乙基甲基膦酸	O（运行）-甲基膦酸乙酯	Apo，X3T（锌波长）	甲基膦酸酯
结晶条件	1.5 M（M）（NH₄)₂SO公司₄，17%甘油，0.1 M（M）Tris pH 7.0	1.5 M（M）（NH₄)₂SO公司₄，17%甘油，0.1 M（M）Tris pH值8.5	1 M（M）（NH₄)₂SO公司₄，12%甘油，0.1 M（M）Tris pH值7.5	1.5 M（M）（NH₄)₂SO公司₄，17%甘油，0.1 M（M）Tris pH值8.5	1.5 M（M）（NH₄)₂SO公司₄，12%甘油，0.1 M（M）Tris pH 8.0	1.5 M（M）（NH₄)₂SO公司₄，12%甘油，0.1 M（M）Tris pH 8.0
数据收集
来源	Rigaku家庭来源	Rigaku家庭来源	Rigaku家庭来源	Rigaku家庭来源	ID23-1，欧洲战略参考框架	Rigaku家庭来源
PDB代码	8p7个	8页7页	8页7秒	8p7吨	8p7u	8p7伏
“空间”组	P（P）4_三2₁2	P（P）4_三2₁2	P（P）4_三2₁2	P（P）4_三2₁2	P（P）4_三2₁2	P（P）4_三2₁2
一，b条，c（c）(Å)	69.56, 69.56, 186.64	69.83, 69.83, 186.78	69.54, 69.54, 185.84	69.45, 69.45, 186.97	69.69, 69.69, 187.07	69.70, 69.70, 186.48
α，β，γ(°)	90.0、90.0、90.0	90, 90, 90	90, 90, 90	90, 90, 90	90, 90, 90	90、90、90
非对称单元中的副本	1	1	1	1	1	1
分辨率（Å）	34.78–1.77	28.43–1.85	33.77–1.77	23.19–1.80	18.11–1.38	25.46–1.74
外壳（Ω）	1.87–1.77	1.92–1.85	1.84–1.77	1.86–1.80	1.42–1.38	1.80–1.74
独特的反射	45349 (4453)	40443 (3956)	45145 (4428)	42215 (4018)	96151 (9438)	47579 (4555)
完整性（%）	99.92 (100.00)	99.94（100.00）	99.89 (99.84)	97.23 (94.96)	99.15 (98.70)	98.25 (96.36)
平均值我/σ(我)	18.97 (6.41)	33.96 (5.21)	30.97 (12.07)	22.59 (5.53)	6.87 (2.03)	20.05 (3.92)
多重性	20.4 (20.6)	12.0 (11.7)	11.8 (11.4)	20.4（20.6）	6.5 (6.4)	20.0（20.0）
科科斯群岛_1/2	0.999 (0.974)	0.859 (0.689)	0.888（0.914）	0.999 (0.948)	0.992 (0.776)	0.999 (0.895)
R（右）_下午。	0.0241 (0.0978)	0.1528 (0.2906)	0.09951 (0.1210)	0.02038 (0.1358)	0.05118 (0.2740)	0.02354 (0.2009)
精炼
分辨率范围（Ω）	31.11–1.77	28.43–1.85	31.10–1.77	22.97–1.80	18.11–1.38	24.88–1.74
反思[我/σ(我) > 0]	45340	40437	45111	42212	95540	47567
测试集中的反射	4453	2015	4428	4107	4684	2326
R（右）_工作/R（右）_自由的	0.1670/0.1910	0.1548/0.1782	0.1602年1月1841日	0.1569/0.1844	0.1572/0.1781	0.1668/0.1886
蛋白质原子	2499	2541	2540	2522	2557	2506
水分子	259	377	346	268	372	305
总体平均值B类系数（Ω²)	19.17	17.54	18.88	20.07	19.53	20.12
根-平方偏差
粘结长度（Ω）	0.016	0.006	0.006	0.006	0.066	0.007
粘结角度（°）	2	0.92	0.92	1.03	0.95	1.02
拉马钱德兰阴谋
最受欢迎（%）	96.34	97.26	97.85	97.26	96.34	97.86
额外允许（%）	3.35	2.74	2.15	2.74	3.66	1.83
不允许（%）	0.30	0	0	0	0	0.31

3.结果

3.1. 锌的存在之间的相关性²⁺没有标签：A53_1和C23_1

无任何标记的A53变体在12%PEG 6000、5%MPD、0.1的存在下结晶 M（M）HEPES pH 7.5，晶体衍射至2.0 分辨率（表2中的A53_1). (β/α)₈A53_1的TIM带宽折叠与wt非常相似Bd公司_PTE（PDB条目1小时; 本宁等。, 2001). 然而，A53_1是单体，只有一个Zn²⁺活性位点中的离子。PTE的活性部位需要两个二价金属离子，这有助于其活性和稳定性（Benning等。, 1995). 去除这两种金属离子中的任何一种都会导致酶活性的丧失。暴露在外的α-锌²⁺PTE结构中的离子，如PDB条目中所示1小时（本宁等。, 2001)由His55、His57和Asp301结扎β-锌²⁺离子由His201和His230连接，而氨基甲酸酯功能群结合Lys169与两种锌相互作用²⁺离子（图1b条). 这些发现与金属酶的一般观察结果一致，即亲水活性位点嵌入在疏水核心（山下等。, 1990 ).

A53_1和PDB入口1个pta（本宁等。, 1994 )在相同的条件下结晶空间组 P（P）2₁2₁2，具有几乎相同的单元：一= 79.7,b条=93.7，c（c）= 44.6 奥和一= 80.2,b条= 93.7,c（c） = 45.0 分别为：。有趣的是，带有PDB代码的结构1个pta不含任何锌²⁺活性部位的离子（图4一)尽管在结构上与A53_1变体非常相似（r.m.s.d.为0.498 ？），其中含有一个Zn²⁺离子，对应于埋藏的α-锌²⁺离子，在其活性部位（图4b条). PDB条目的假定活性位点1个pta和A53_1结构与含有两个锌的典型活性位点显著不同²⁺离子，就像其他PTE结构一样，例如PDB入口1小时（图4c（c）).

图4
不同锌含量PTE活性位点区域的比较²⁺离子。(一)PDB条目1个pta不含锌²⁺离子。(b条)A53_1，含一个锌²⁺离子。(c（c）)PDB条目1小时，含两个锌²⁺离子。锌²⁺离子以品红色显示，桥接水以青色显示。

据报道，结晶过程中使用的一些试剂可以作为螯合剂，与锌形成配位键²⁺溶液中的离子，从而减少它们有效浓度，Tris就是这样一种试剂（Fischer等。1979年 ). 在本研究中，Tris被用于高浓度，>50 米M（M）在PTE变体的纯化和一些结晶试验中。Tris能螯合金属离子，尤其是锌²⁺通过其胺N原子（Handing等。, 2018 ). 它存在于净化缓冲液中，从而减少有效浓度游离锌含量²⁺，很难合并两个锌²⁺离子进入PTE变异体的活性位点。由于两种锌的存在²⁺离子和活性位点中残基的正确定向对于维持催化活性对于PTE，可以合理地假设A53_1单体是催化活性的。避免形成含有少于两个锌的非活性PTE分子²⁺活性部位的离子，添加氯化锌至关重要₂在蛋白表达、纯化和结晶过程中。表2中列出的所有结构除A53_1和C23_1外，其余均是通过添加ZnCl纯化介质的制剂获得的₂确实显示了含有两个Zn的分子二聚体²⁺每个单体活性中心的离子。

PDB条目比较1小时，含两个锌²⁺含有A53_1（仅含一个）的离子的r.m.s.d.为0.65 C上的奥数^α原子。对A53_1活性位点的检查表明α-锌²⁺离子为～2.5 Å远离PDB入口中的相应离子1小时（图4b条和4c（c））。此外，关键活性位点残基存在明显的构象偏差（图4). 这些偏差可归因于β-锌²⁺离子，预计将与His201和His230的侧链协调（图1b条和4c（c）). 有趣的是，A53_1的结构与PDB入口的结构更为相似1个pta，不含锌²⁺离子（图4b条和4一）。

虽然PDB中的几乎所有PTE都与分子二聚体结晶非对称单元，A53_1只显示一个分子非对称单元。将晶体双轴应用于空间组 P（P）2₁2₁2.然而，该二聚体界面利用了不同的残基，与其他PTE中的典型非晶体学二聚体相比，该界面相当松散，表明它不是生理性二聚体。参与标准PTE二聚体界面的两个片段，残基60–79和301–313，在图5所示的A53_1结构示意图中显示出明显的构象差异此外，203–209、254–275和314–320三个区域无序，因此在电子密度图中不可见（图5). 残基314–320接近残基301–313，残基涉及标准PTE二聚体界面。由于无序区域中的一些残基位于活性位点附近，因此它们的无序性、残基60–79和301–313中观察到的显著构象变化以及只有一个锌的存在似乎是合理的²⁺离子，阻止A53_1结构的二聚化并消除催化活性。事实上，A53_1在溶液中以单体形式出现，如凝胶过滤所示（未显示）。

图5
载脂蛋白A53_2（米黄色）和载脂蛋白A 53_1（绿色）单体结构主干的卡通管图。显示明显构象差异（残基60-79）的区域用黑色虚线圈出。该区域参与A53_2、A53_3和A53_4结构中二聚体的形成，这些结构与A53_1结构非常相似，也有显著差异。A53_1中缺失的区域，即残基203-210、254-274和314-320被涂成红色，并用红色虚线圈出。两个锌²⁺A53_2中的离子显示为洋红色球体，结合它们的残基显示为棒状。

无标记C23变体在无MBP融合标记的情况下表达，并通过常规纯化技术进行纯化。从10%PEG 6000、15%MPD、2%PEG 400、0.1中获得的C23_1晶体 M（M）HEPES pH 7.5衍射至3.2 分辨率（表2). 由于晶体衍射很差，它被认为不适合用于OP共结晶实验。

3.2. A53、C23和C23M的标记构建体的结构

添加氯化锌₂在表达、纯化和结晶过程中产生了两种锌²⁺A53_2、A53_3和A53_4活性中心的离子在不同的结晶条件下结晶。两个Zn的配位几何²⁺这三种结构的活性位点中的离子与在其他PTE结构中观察到的离子相似，如PDB进入1小时有趣的是晶体结构A53_2的单体非对称单元二聚体是通过晶体双轴形成的空间组 P（P）4_三2₁2，在其他几种PTE的结构中观察到：A53_5、C23_2、C23_3、C23_4、C23~5、C23G_1和C23M_2。然而，A53_3和A53_4在空间组 P（P）2₁含有二聚体非对称单元（表2).

3.3. 残留标签对A53、C23和C23M变体的载脂蛋白结构的影响

为了便于纯化，A53、C23和C23M变异体被表达为带有N末端MBP标签的结构体（图2一). 因子Xa裂解产生N末端带有八肽连接子（ISEFITNS）的蛋白质，随后是成熟PTE蛋白序列，起始于Gly34，用于构建体A53_T、C23_T和C23M_T（图2b条).

用三种不同的结晶沉淀剂获得了八肽标记的A53变体的载脂蛋白结构：带有甘油的AS、带有MPD的PEG 6000和PAA，这三种沉淀剂分别形成了A53_2、A53_3和A53_4晶体结构。使用三种沉淀剂获得apo C23晶体：PEG 6000与MPD（C23_1）、PAA和AS与甘油（数据未显示）。

C23_1结晶于空间组 P（P）2₁2₁2₁中含有两个二聚体非对称单元。标记的C23（C23_2、C23_3、C23_4和C23_5）和C23M（C23M_1和C23M_2）晶体由AS和甘油生长而成，其中一个单体位于空间组第4页_三2₁2，因此正则二聚体是由晶体学对称性生成的。

在A53_3和A53_4的晶体结构中，与八肽间隔区残基相对应的电子密度²⁶ISEFITNS公司³³意外观察到（图2中的A53_Tb条). 因此，亚基的残余八肽B类被发现渗透到对称性相关亚单位的活性部位A类，以便在A53_3中A类亚基和亚基八肽的N末端（Ile26）B类约为4.5 奥（图6). 亚基八肽的残基B类与对称性相关亚基中的Trp131、Glu132、Gln173、Phe203、Ala270、Phe306、Ser308和Tyr309接触A类有趣的是，尽管A53_3和A53_4的晶体是从不同的结晶条件（分别具有MPD和PAA的PEG 6000）获得的，但两者都在空间组 P（P）2₁两者都保留了残留的八肽。值得注意的是，A53在PEG 8000存在下结晶空间组 P（P）2₁还包含活性位点中残留的八肽（数据未显示）。因为八肽只存在于晶体中空间组 P（P）2₁，可以合理地假设残余八肽进入活性位点是空间基团依赖性的。活性位点中八肽的存在可能会干扰OP的结合。这确实解释了为什么在A53_3和A53_4晶体中没有发现OP（图6). 八肽的行为类似于肽-抑制剂模拟物，因此可能有助于确定底物与长侧链的结合模式。

图6
A53_3变体的带状表示。它显示了亚单位上的八肽标签B类穿透对称性相关亚单位的活性位点区域A类。标签以洋红色显示。对称相关链的活性位点残基A类以黄色显示，残留物在5以内以青色显示的标记的编号。绿色电子密度对应于省略八肽的省略图（轮廓为3σ). 环状化合物X3E可能是从蛋白质表达和纯化过程中携带过来的，可见于活性部位，黑色电子密度对应于2F类_o个−F类_c（c）地图（等高线为1σ). 两个锌²⁺离子显示为品红球体。

3.4. 聚丙烯酸作沉淀剂制备的PTE晶体结构

PTE变体也使用聚丙烯酸（PAA）结晶，包括A53（A53_4；表2)和C23（数据未显示）。在这些情况下，没有水分子直接与锌结合²⁺离子，由于PAA单体，即活性部位检测到丙烯酸（AA）。结合的AA作为配体桥接两个锌²⁺金属离子，模拟羧酸盐水解过程中形成的四面体中间体酯类和OP（图7). PTE活性部位中存在结晶试剂并不罕见，因为在其他PTE结构中也有类似的观察结果（表2). 因此，在许多PTE结构中观察到二甲氨基甲酸盐，其两个O原子与两个Zn结合²⁺离子（例如，PDB条目4倍d3，4倍d4，4xd5型，4×d6，4英尺/平方英寸，4袋，4路，6千兆字节和其他；坎贝尔等。，2016年 ). 在有机磷酸酐酶（OPAA；PDB条目）的结构中4zwo个)，在活性部位观察到类似丙烯酸的乙醇酸，其两个O原子与两个Mn结合²⁺离子（Daczkowski等。, 2015 ). 许多关于使用PAA衍生物进行鼻腔给药的研究已经发表，其生物粘附性得到了公认（Arkaban等。, 2022 ; Sabale公司等。, 2020 ). 事实上，其强大的生物粘附性和与蛋白质结合的高度能力（Dai等。, 2006 )可以解释其在PTE变异体的活性位点中的存在。此外，除AA外，A53_4活性位点还含有八肽，这是在空间组 P（P）2₁（如第3.3节所述). 这表明结晶试剂PAA最初与溶液中PTE的活性部位结合。随后，八肽间隔区²⁶ISEFITNS公司³³在晶体形成期间穿透活性部位空间组 P（P）2₁由于从PAA结晶的任何PTE变体中都没有观察到共结晶OP配体的电子密度，因此后者可能对Zn有较高的亲和力²⁺离子比OP多。

图7
A53_4的活性部位。可以清楚地看到丙烯酸（AA；蓝色棒）结合在活性位点。绿色电子密度对应于带有AA和两个Zn的省略图²⁺省略离子（轮廓为3σ). 黑色电子密度对应于2F类_o个−F类_c（c）地图（等高线为1σ). 两个锌²⁺离子显示为品红球体。

3.5. 识别PTE活性部位内的金属离子

识别蛋白质-金属络合物结构中内在结合的金属离子对于确保它们与表达、纯化和结晶步骤中使用的溶液一致至关重要（郑等。, 2008 ). 意外的金属离子可能会取代预期的金属离子，导致数据不正确或误导。对于PTE变体，必须确认活性位点中金属离子的身份。因此，在锌吸收边波长处收集了AS和甘油结晶的C23M_1的X射线数据(λ= 1.2724 在ESRF的光束线ID23-1上，晶体衍射至1.38 分辨率（表2中的C23M_1; 图8一)，显示与锌对应的峰值吸收边缘。活性中心区域的异常省略电子密度图明确表明活性中心内的两个金属离子确实都是锌²⁺离子，从而确认其预期特性（图8b条和9).

图8
(一)C23M_1晶体在一定能量范围内的扫描显示出对应于锌的峰值吸收边缘（顶部）。分散系数(（f）'和（f）“”）绘制为能量的函数（底部）。(b条)C23M_1活性位点区域的异常省略电子密度图，等高线为6σ，以黑色显示。两个锌²⁺离子显示为洋红色球体，在计算电子密度时被忽略。

图9
电子密度省略了C23M_1活性位点区域的图谱。两个锌²⁺在计算电子密度时，省略了标记为X3T的未鉴定的六元环配体的离子和电子密度。第2个F类_o个−F类_c（c）省略地图，等高线为1σ，以黑色显示。这个F类_o个−F类_c（c）省略地图，等高线为3σ，以绿色显示。两个Zn²⁺离子显示为品红球体。

可以看出，C23M_1的活性位点中有明确的电子密度，对应于一个未知的六元环配体（X3T）。下一节将更详细地讨论这种配体。

3.6. PTE活性位点中的环状化合物

如前所述，用于蛋白质表达和纯化的结晶沉淀剂和化合物在蛋白质结构的活性部位（Dym等。，2016年). PEG和MPD用作沉淀剂，用于A53_1、A53_3和C23_1的结晶（表2). 如上所述，A53_1可能是含有一个Zn的非活性单体²⁺其活性部位的离子和C23_1衍射到低分辨率。A53_3结晶于空间组 P（P）2₁，剩余的八肽指向活性位点。此外，在含有两个O原子的活性部位观察到一种未经鉴定的六元环配体（X3E），可能起到螯合剂的作用，协调两个Zn²⁺PTE活性部位存在的离子（图6). 对于从PEG 6000和MPD结晶的A53，未检测到共结晶OP配体的电子密度，与从PAA结晶的A5一样。有趣的是，A53_3和A53_4的活性部位分别含有X3E和AA，它们在空间组 P（P）2₁，剩余的八肽指向其活性部位。

从AS和甘油结晶的A53_2和C23M_1的载脂蛋白结构也表明存在六元环配体：X3B（图10)和X3T（图9)分别是。这些配体类似于X3E，作为螯合剂来协调锌²⁺活性部位的离子。因此，它们很可能是从蛋白质表达和纯化过程中携带过来的。值得一提的是，在一些已发布的PTE结构中，即PDB条目3a4j公司（富·杰克逊等。, 2009 )，水分子被分配到活性位点内。然而，它们在活性部位也含有电子密度，这可能对应于与我们观察到的类似的未识别的六元环。

图10
电子密度省略了A53_2活性中心区域的图。两个Zn²⁺在计算电子密度时，忽略了离子和一个未知六元环（标记为X3B）的电子密度。第2个F类_o个 − F类_c（c）省略地图，轮廓为1σ，以黑色显示。这个F类_o个−F类_c（c）省略地图，等高线为3σ，以绿色显示。两个锌²⁺离子显示为品红球体。

值得注意的是，当AS和甘油用作沉淀剂时，OP配体的结合取代了最初在apo结构中观察到的环状化合物X3B或X3T。下文将更详细地讨论OP的位移和约束。

3.7. OP共结晶和浸渍到PTEs中

将配体浸泡在晶体中是获得蛋白质-配体复合物结构的常用方法。然而，它需要仔细考虑几个因素，包括将配体溶解在结晶沉淀剂或不会破坏蛋白质晶体的溶剂中的要求、预期的浸泡时间和有效配体浓度的选择。浸泡的一个重要限制是要求晶体具有可接近的配体结合位点，或具有易于被感兴趣的配体取代的结合配体。在PTE变体的情况下，尝试将OP底物的产物浸泡到天然酶的现有晶体中是不成功的，因为活性位点已经被配体占据，例如八肽间隔区（图6)，AA（图7)或图9所示的未识别的六元环和10，与协调α-锌²⁺和β-锌²⁺离子，从而使浸泡的配体很难替换它们。

使用的OP配体无法取代活性部位中的配体，可能是由于结晶蛋白缺乏灵活性、晶体阻塞限制或产物的结合可能比进入的OP底物更紧密。这些限制加在一起，导致了试图将OP配体浸泡到PTE变体的现有晶体中时面临的挑战。克服这些挑战的一种方法是采用共结晶，这可以在不受预先存在的晶体结构限制的情况下促进活性位点内的配体交换。

当配体不溶于结晶沉淀剂、晶体堆积限制阻止浸泡、配体结合与构象变化有关或活性部位被无法被相关配体取代的配体占据时，共结晶是一种选择方法。事实上，在所研究的PTE变体中，OP水解产物只能在采用共结晶方法时的活性部位观察到，并且只能在从AS和甘油中获得的晶体中观察到空间组 P（P）4_三2₁2.与甲基膦酸共结晶的A53_5、C23_3和C23M_2结构活性中心的电子密度（图11一)清楚地表明，配体取代了载脂蛋白结构中的六元环（A53_2中的X3B和C23M_1中的X3T），并且OP的三个O原子中的两个与两个Zn紧密接触²⁺原子间距为1.9–2.0的离子 Å. 令人费解的是，在甲基膦酸与三种PTE变体A53、C23和C23M的配合物中，CH的甲基_三P明确地向同一方向投射，这与在其他OP共轭体中观察到的明显不同（图11b条, 11c（c）和11d日). 在与正品共结晶的情况下O（运行）-乙基甲基膦酸（C23_5；图11)，观察到的电子密度只能解释OCH的第一个C原子₂中国_三取代基。由于第二个C原子不会与任何其他原子接触氨基酸残留，它很可能是混乱的。在C23_4结构与O（运行）-乙基-O（运行）-(N个，N个-甲基膦酸二异丙基氨基乙酯（图3c（c）)，电子密度与其水解产物一致，O（运行）-乙基甲基膦酸（图11b条). 这表明O（运行）-乙基-O（运行）-(N个，N个-二异丙基氨基乙基）甲基膦酸盐，储存在库存或结晶介质中。该化合物的快速水解将在其他地方描述。分离的束缚无序部分的存在N个，N个-不能排除二异丙基氨基乙醇。

图11
电子密度省略图(F类_o个−F类_c（c）)PTE的活性位点区域。两个锌²⁺计算中省略了离子和OP。(一)在C23M_2结构中观察到甲基膦酸盐。(b条)O（运行）-在C23_5中观察到乙基甲基膦酸。然而，电子密度只能解释OCH的第一个C原子₂中国_三取代基。(c（c）)O（运行）-乙基甲基膦酸，水解产物O（运行）-乙基-O（运行）-(N个，N个-在C23_4结构中观察到甲基膦酸二异丙基氨基乙酯。(d日)O（运行）-在C23_2中观察到异丙基甲基膦酸。所有OP酸产品中P-O键的O原子之间的原子间距为1.9–2.0 Å. 这个F类_o个−F类_c（c）省略地图，等高线为3σ，以绿色显示。与两个锌结合的六个残基²⁺离子以棒状表示，C原子为黄色，N原子为蓝色，O原子为红色，P原子为橙色。

本研究中wt-PTE与正品可逆络合物的离解常数O（运行）-乙基甲基膦酸(K（K）_我= 4.3 米M（M）)是甲基膦酸的八倍(K（K）_我= 0.54 米M（M）). 当对氧磷为底物时，两者都是PTE的不良抑制剂。甲基膦酸亲和力的增强归因于由于第三个P-O键而产生的更大的负电荷密度。这证实了负电荷密度对PTE双核中心关联的贡献。这个O（运行）-C23_2中的异丙基甲基膦酸（图11d日)方向类似于O（运行）-C23_5和C23_4活性位点中的乙基甲基膦酸（图11b条和11c（c））。因此，基于不同产物配体投影的可视化，在C23_2、C23_4和C23_5中，以下残基在脱附后容纳了P–O–乙基和P–O-异丙基部分离开组：His57、Gly60、Ile106、Trp131、Asp301、Leu303、Phe306和Ser308。CH公司_三CH集团_三这些OP配体中的P部分投射到由His230、His257、Leu271、Asp301和Phe306定义的空间中，这与之前使用非水解配体的报告一致O（运行），O（运行）-甲基膦酸二异丙酯（本宁等。, 2000 ). 然而，在甲基膦酸的三种晶体结构（A53-5、C23-3和C23M-2）的情况下，相同的甲基朝向不同的方向，进入由His57、Ile106、Trp131、Asp301和Leu303定义的空间。在非水解OP或OP底物的酸性产物的P原子上附着的各种取代基的晶体结构中观察到的多个取向可以解释PTE的杂乱性。

早期的研究表明O（运行），O（运行）-4-甲基苄基膦酸二乙酯（PDB条目1分米; 表1; 范胡克等。1996年 )和甲基膦酸二异丙酯（PDB条目1盎司2; 表1; 本宁等。, 2000)在其wt-PTE复合物中，与更多暴露的β-锌²⁺距离为3.5和2.5的离子 Å，从而将其命名为催化Zn²⁺值得注意的是，在这两种结构中，观察到膦基O原子的距离分别为4.7和5.0 Å，分别来自被掩埋的α-锌²⁺离子。本研究中观察到的OP酸产物的实验测定三维结构与PTE与其他两种酸产物络合物的报道三维结构一致：O（运行），O（运行）-二乙基磷酸（DEP；PDB入口3袋; 表1; 基姆等。, 2008 )和乙基-4-甲基苄基膦酸盐（mEBP；PDB条目第7页85; 表1; 工作等。, 2023 ). PTE–DEP和PTE–mEBP的P-O O原子对称地位于2.0–2.2 远离两个Zn²⁺离子，而对于三酯基类似物的络合物（C₂H（H）₅O）₂P（O）CH公司₂苯基聚碳酸酯_三P=O O原子是3.5和4.7 来自暴露的β-锌²⁺和被埋的α-锌²⁺分别为（Vanhouke等。1996年). 这些观察结果与PTE活性位点的灵活性一致，这导致了广泛的特异性。

酸性产物的P-O O原子与埋藏体之间的短距离α-锌²⁺在C23_2、C23_4和C23_5结构中，以及在O（运行），O（运行）-二乙基磷酸（Kim等。, 2008)和O（运行）-乙基-4-甲基苄基膦酸（Job等。, 2023)，表明两种锌的参与²⁺催化中的离子。

4.讨论

本研究描述了在获得OP配体与PTE酶复合物的晶体结构时遇到的挑战。结晶溶液中含有一系列化学物质，用作蛋白质沉淀剂、缓冲液和/或试剂，以提高蛋白质稳定性。溶液中的有效金属浓度可能因与某些此类化学品形成金属络合物而大幅降低。表达和纯化过程中使用的一些结晶试剂或化合物也可以作为螯合剂来协调金属离子。因此，有必要仔细考虑从表达到结晶的管道中使用的试剂的选择和浓度，以确保它们不会干扰目标蛋白的功能状态（Newman，2004).

锌²⁺离子在300多种酶的活性中起着关键作用，包括PTE（McCall等。, 2000 ). 在最初尝试获得适用于OP浸泡的PTE晶体时，我们获得了A53变体的晶体，该变体被证明含有一个只有一个Zn的非活性单体²⁺离子，对应于α-锌²⁺离子，在其活性部位。相反，这种酶的活性形式是二聚体，含有α-锌²⁺并暴露在外β-锌²⁺每个亚单位中的离子，对于稳定酶的结构和促进其催化活性（霍尔顿和劳希尔，2021年 ). 在所研究的晶体结构中看到的两种金属离子确实是锌²⁺在锌层收集的X射线数据的异常差异图证实了离子吸收边缘。避免形成含有少于两个锌的非活性PTE分子²⁺活性部位的离子，添加氯化锌至关重要₂在蛋白表达、纯化和结晶过程中。

为了提高PTE的表达水平和溶解度，引入麦芽糖结合蛋白（MBP）作为融合伙伴，并在结晶试验前用因子Xa消化去除。出乎意料的是，观察到电子密度，这可归因于残留的八肽间隔区对PTE活性位点的穿透。活性位点和八肽N末端之间的距离约为4.5 Å. 值得注意的是，在从几种结晶条件下获得的PTE晶体中观察到残留的八肽，所有这些晶体仅在空间组 P（P）2₁活性位点中八肽的存在可能会干扰OP的结合。因此，很明显空间组其中蛋白质结晶会影响蛋白质的构象和配体的结合。这是因为空间组决定晶体堆积，进而影响蛋白质分子周围的局部环境。值得注意的是空间组在计算机辅助药物设计方法中，通常不考虑蛋白质结晶的情况，这些方法用于确定有希望的候选药物，而这些药物仅依赖蛋白质结构来预测结合。此外，我们的结果强调了在尝试研究蛋白质复合物和结合物的3D结构之前，去除用于提高表达和纯化水平的残留标签的重要性。事实上，当我们覆盖最近确定的PTE与乙基-4-甲基苄基膦酸酯（mEBP；PDB条目）络合物的结构时第7页85; 表1; 工作等。, 2023)在A53_3上，mEBP的苄基非常靠近八肽标记的Ile26侧链。这有力地支持了八肽与大肽结合的位置离开组OP.的。

在本研究中，观察到一些用于表达和纯化过程的结晶沉淀剂和化合物可能滞留在PTE的活性部位。具体而言，在PTE变体的活性部位检测到用作沉淀剂的PAA的AA单体，当PEG6000与MPD或AS与甘油一起用于结晶试验时，在PTE活性部位观察到与未识别的六元环化合物相对应的明确电子密度。将OP浸泡在三种不同结晶条件下生长的载脂蛋白PTE变体的晶体中，无法取代活性部位中观察到的六元环化合物或AA。我们通过采用共结晶协议克服了这一限制。因此，我们在用于结晶载脂蛋白形式的相同条件下，在OP的存在下共同结晶A53、C23或C23M变体。然而，在以PEG6000和MPD或PAA作为结晶条件的共结晶实验中，六元环（X3E）和AA也分别滞留在PTE的活性部位，阻碍了OP的结合。在获得的晶体中空间组 P（P）2₁活性位点还包含用于表达的残余八肽标签，这只在本研究中观察到空间组。这种八肽的行为类似于肽-抑制剂模拟物，因此可能有助于确定底物与脂肪族离去基团的结合模式。

只有当PTE变体和OP从AS中与甘油共结晶时空间组 P（P）4_三2₁2 OP配体能否取代最初在apo结构中观察到的环状化合物X3B或X3T。因此，在三种PTE变体A53、C23和C23M的活性位点中观察到与甲基膦酸盐相对应的电子密度（见表2). 电子密度图表明甲基（CH_三)甲基膦酸盐部分在所有三个变体中明确地以相同的方向投射。这个O（运行）-甲基膦酸乙酯和O（运行）-在C23结构的活性部位观察到甲基膦酸异丙酯部分（见表2). 电子密度对应于O（运行）-甲基膦酸乙酯，预期较少的水解产物O（运行）-乙基-O（运行）-(N个，N个-二异丙基氨基乙基）甲基膦酸酯，这意味着该配体在水溶液中的快速水解。异丙基O（运行）-甲基磷酸异丙酯和乙基O（运行）-甲基膦酸乙酯向同一方向投射，这与观察到的甲基膦酸甲酯明显不同。AS与甘油共结晶实验的结果空间组 P（P）4_三2₁2定义了一个O（运行）-烷基结合囊。

PTE水解OP三酯的公认催化机理基于与S_N个2型亲核置换离开组直接攻击P原子（Bigley&Raushel，2013 ; 科卡等。, 2001 ). 这个亲核剂被认为是一种水分子（或氢氧化离子），可以清楚地看到它是桥接两个锌的明确的电子密度²⁺高分辨率PTE结构中的离子（PDB条目第二组第三组). 因此，第一步很可能是形成五配位过渡态（TS），形成两个部分带电的P-O键，如下图所示，用于水解O（运行）-甲基膦酸烷基酯离开组（LG）（图12).

图12
水解假定TS的示意图O（运行）-甲基膦酸烷基酯。这个亲核剂是一种氢氧化离子，来源于连接两个锌的水分子²⁺离子。LG代表离开组。所显示的几何图形用于说明和讨论。

本研究的结果可能有助于合理解释PTE中活性中心的作用。C23晶体结构中观察到的OP产物（图11)处于基态。然而，它们模仿假定的带电TS水解O（运行）-烷基甲基膦酸盐，通过提供连接两个Zn的两个P-O键²⁺原子间距为1.9–2.0的双齿模式离子？（图11). 与类似的短距离（2.0–2.2 报道了PTE与酸性OP产物的络合物，如O（运行），O（运行）-二乙基磷酸（Kim等。, 2008)和O（运行）-乙基-4-苄基膦酸（Job等。, 2023)结果表明，无论取代基的大小如何，酶都有足够的灵活性来利用两个锌提供的稳定机制²⁺离子。因此，埋藏和暴露的锌²⁺建议使用离子来稳定发展中的高能带电TS，从而降低其能量含量，并伴随着相对于水的反应加速。对于锌，也有类似的可能性²⁺-含有碳酸酐酶，其中设想了负电荷过渡状态（Christianson&Cox，1999 ). 锌形成的双金属活性中心²⁺离子似乎不仅在极化P=O键和使P原子更容易受到亲核攻击方面起主要作用，而且通过静电作用稳定TS，这与它在酶催化中的关键作用一致（Warshel等。, 2006 ). 酸性OP产品的快速分离保证了OP底物的高周转率，例如，在对氧磷的情况下扩散控制反应速率的变化。事实上，尽管酸性OP产物在固态中具有紧密的配位，但其离解常数K（K）_我第4.3页米M（M）观察到的O（运行）-乙基甲基膦酸在水溶液中对PTE的亲和力较差。类似地，分析晶体结构在乐果水解产物P=S的络合物中，硫代磷酸二甲酯表明，与P=O同系物相比，磷酸三酯对硫代磷酸酯的转换速度慢了约1000倍，这可能是由于双金属催化中心（Jackson等。, 2005 ). 然而，还需要进一步的实验来证实这一论点。

我们的研究强调了几个因素对蛋白质-配体复合物成功结晶的重要影响。这些因素包括所使用的分子构建体、残留标签的存在、空间基团的选择、用于结晶的化合物以及蛋白质表达和纯化过程中携带的化合物。在PTE的情况下，我们观察到这些化合物可以占据活性位点，有效地与OP竞争，甚至阻止OP的结合，这对药物开发特别重要。这可能会导致对候选先导药物的错误识别。通过考虑并建设性地解决这些因素，可以提高获得蛋白质-配体复合物晶体的可能性，这些晶体忠实地代表所需的相互作用，从而更准确可靠地表征配体结合，并有助于合理设计潜在的治疗剂。

支持信息

3D视图

PDB参考：A53_1，8p7f;A53_2，8p7小时;A53_3，第8页;A53_4，8p7k;A53_5，8p7m;C23_1，8p7n;C23_2，8p7q;C23_3，8p7r;C23_4，8p7s;C23_5，8p7吨;C23M_1，8p7u;C23M_2，8p7v

脚注

‡当前地址：PL Biologicals Ltd，M2K Corporate Park，Sector 51 Gurugram，Haryana 122 003，India。

§2021年5月4日去世。

致谢

这项研究得益于以色列魏茨曼科学研究所的结构蛋白质组学单元，这是一个Instruct-ERIC中心。

资金筹措信息

以色列魏茨曼科学研究所科学卓越中心提供了财政支持。

工具书类

Agirer，J.、Atanasova，M.、Bagdonas，H.、Ballard，C.B.、Basle，A.、Beilsten-Edmands，J.，Borges，R.J.、Brown，D.G.、Burgos-Mármol，J.J.、Berrisford，J.M.、Bond，P.S.、Caballero，I.、Catapano，L.、Chojnowski，G.、Cook，A.G.、Cowtan，K.D.、Croll，T.I.、Debreczeni，J。，Devenish，N.E.，Dodson，E.J.，Drevon，T.R.，Emsley，P.，Evans，G.，Evans，P.R.，Fando，M.，Foadi，J.，Fuentes-Montero，L.，Garman，E.F.，Gerstel，M.、Gildea，R.J.，Hatti，K.，Hekkelman，M.L。，Heuser，P.，Hoh，S.W.，Hough，M.A.，Jenkins，H.T.，Jiménez，E.，Joosten，R.P.，Keegan。，Murshudov，G.N.，Nicholls，R.A.，Noble，M.E.M.，Oeffner，R.，Pannu，N.S.，Parkhurst，J.M.，Pearce，N.，Pereira，J.，Perrakis，A.，Powell，H.R.，Read，R.J.，Rigden，D.J.，Rochira，W.，Sammito，M.，Sánchez Rodríguez，F.，Sheldrick，G.M。，Tews，I.、Thomas，J.M.H.、Thorn，A.、Valls，J.T.、Uski，V.、Usón，I.、Vagin，A.、Velankar，S.、Vollmar，M.、Walden，H.、Waterman，D.、Wilson，K.S.、Winn，M.D.、Winter，G.、Wojdyr，M.和Yamashita，K.（2023年）。《水晶学报》。D类79, 449–461. 科学网交叉参考 IUCr日志谷歌学者
 Aharoni，A.、Amitai，G.、Bernath，K.、Magdassi，S.和Tawfik，D.S.（2005）。化学。生物。 12, 1281–1289. 交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Arkaban，H.，Barani，M.，Akbarizadeh，M.R.，Pal Singh Chauhan，N.，Jadoun，S.，Dehghani Soltani，M.&Zarintaj，P.（2022年）。聚合物，14, 1259. 交叉参考公共医学谷歌学者
 Benning，M.M.、Hong，S.B.、Raushel，F.M.和Holden，H.M.（2000）。生物学杂志。化学。 275, 30556–30560. 交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Benning，M.M.，Kuo，J.M.、Raushel，F.M.和Holden，H.M.（1994）。生物化学，33，15001–15007交叉参考中国科学院公共医学科学网谷歌学者
 Benning，M.M.，Kuo，J.M.、Raushel，F.M.和Holden，H.M.（1995）。生物化学，34，7973–7978交叉参考中国科学院公共医学科学网谷歌学者
 Benning，M.M.、Shim，H.、Raushel，F.M.和Holden，H.M.（2001）。生物化学，40, 2712–2722. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Berman，H.M.、Westbrook，J.、Feng，Z.、Gilliland，G.、Bhat，T.N.、Weissig，H.、Shindyalov，I.N.和Bourne，P.E.（2000年）。核酸研究。 28, 235–242. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Bertani，G.（1951年）。《细菌学杂志》。 62, 293–300. 交叉参考公共医学中国科学院科学网谷歌学者
 Bigley，A.N.、Mabanglo，M.F.、Harvey，S.P.和Raushel，F.M.（2015）。生物化学，54, 5502–5512. 交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 Bigley，A.N.和Raushel，F.M.（2013年）。生物化学。生物物理学。学报，1834, 443–453. 交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 Bigley，A.N.、Xu，C.、Henderson，T.J.、Harvey，S.P.和Raushel，F.M.（2013）。美国化学杂志。Soc公司。 135, 10426–10432. 交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 Burley，S.K.，Berman，H.M.，Duarte，J.M.，Feng，Z.，Flatt，J.W.，Hudson，B.P.，Lowe，R.，Peisach，E.，Piehl，D.W.，Rose，Y.，Sali，A.，Sekharan，M.，Shao，C.，Vallat，B.，Voigt，M.（2022年）。生物分子，12, 1425. 交叉参考公共医学谷歌学者
 坎贝尔，E.，卡尔滕巴赫，M.，科里，G.J.，卡尔，P.D.，波列布斯基，B.T。，Livingstone，E.K.、Afriat-Jurnou，L.、Buckle，A.M.、Weik，M.、Hollfelder，F.、Tokuriki，N.和Jackson，C.J.（2016）。自然化学。生物。 12, 944–950. 科学网交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 Campbell，E.C.、Grant，J.、Wang，Y.、Sandhu，M.、Williams，R.J.、Nisbet，D.R.、Perriman，A.W.、Lupton，D.W.和Jackson，C.J.（2018年）。高级生物科学。 2, 1700240. 交叉参考谷歌学者
 Chen，V.B.、Arendall，W.B.、Headd，J.J.、Keedy，D.A.、Immormino，R.M.、Kapral，G.J.，Murray，L.W.、Richardson，J.S.和Richardsson，D.C.（2010）。《水晶学报》。D类66, 12–21. 科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 Cherny，I.、Greisen，P.Jr、Ashani，Y.、Khare，S.D.、Oberdorfer，G.、Leader，H.、Baker，D.和Tawfik，D.S.（2013）。ACS化学。生物。 8, 2394–2403. 交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 Christianson，D.W.和Cox，J.D.（1999）。每年。生物化学评论。 68, 33–57. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Corpet，F.（1988年）。核酸研究。 16, 10881–10890. 交叉参考中国科学院公共医学科学网谷歌学者
 Daczkowski，C.M.、Pegan，S.D.和Harvey，S.P.（2015）。生物化学，54, 6423–6433. 交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 Dai，J.、Bao，Z.、Sun，L.、Hong，S.U.、Baker，G.L.和Bruening，M.L.（2006）。朗缪尔，22, 4274–4281. 交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Dauter，Z.、Wlodawer，A.、Minor，W.、Jaskolski，M.和Rupp，B.（2014）。IUCrJ大学，1, 179–193. 科学网交叉参考中国科学院公共医学 IUCr日志谷歌学者
 Despotović，D.、Aharon，E.、Dubovetskyi，A.、Leader，H.、Ashani，Y.和Tawfik，D.S.（2019年）。蛋白质工程设计。选择。 32，第169–174页公共医学谷歌学者
 Despotović，D.、Aharon，E.、Trofimyuk，O.、Dubovetskyi，A.、Cherukuri，K.P.、Ashani，Y.、Eliason，O.，Sperfeld，M.、Leader，H.、Castelli，A.、Fumagalli，L.、Savidor，A.、Levin，Y.，Longo，L.M.、Segev，E.和Tawfik，D.S.（2022年）。程序。美国国家科学院。科学。美国，119电话：e2203604119公共医学谷歌学者
 Dym，O.、Song，W.、Felder，C.、Roth，E.、Shnyrov，V.、Ashani，Y.、Xu，Y.，Joosten，R.P.、Weiner，L.、Sussman，J.L.和Silman，I.（2016）。蛋白质科学。 25, 1096–1114. 科学网交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 Ely，F.、Hadler，K.S.、Gahan，L.R.、Guddat，L.W.、Ollis，D.L.和Schenk，G.（2010年）。生物化学。J。 432, 565–573. 交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 Ely，F.、Pedroso，M.M.、Gahan，L.R.、Ollis，D.L.、Guddat，L.W.和Schenk，G.（2012）。无机生物化学杂志。 106, 19–22. 交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 Emsley，P.、Lohkamp，B.、Scott，W.G.和Cowtan，K.（2010年）。《水晶学报》。D类66, 486–501. 科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 Evans，P.（2006）。《水晶学报》。D类62, 72–82. 科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 Fischer，B.E.，Häring，英国，Tribolet，R.&Sigel，H.（1979）。欧洲生物化学杂志。 94, 523–530. 交叉参考中国科学院公共医学科学网谷歌学者
 French，S.&Wilson，K.（1978年）。《水晶学报》。A类34, 517–525. 交叉参考中国科学院 IUCr日志科学网谷歌学者
 Goldsmith，M.、Aggarwal，N.、Ashani，Y.、Jubran，H.、Greisen，P.J.、Ovchinnikov，S.、Leader，H.，Baker，D.、Sussman，J.L.、Goldenzweig，A.、Fleishman，S.J.和Tawfik，D.S.（2017年）。蛋白质工程设计。选择。 30, 333–345. 交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 Goldsmith，M.、Eckstein，S.、Ashani，Y.、Greisen，P.Jr、Leader，H.、Sussman，J.L.、Aggarwal，N.、Ovchinnikov，S.，Tawfik，D.S.、Baker，D.、Thiermann，H.和Worek，F.（2016）。架构（architecture）。毒物。 90, 2711–2724. 交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 Grimsley，J.K.、Calamini，B.、Wild，J.R.和Mesecar，A.D.（2005）。架构（architecture）。生物化学。生物物理学。 442, 169–179. 交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Gupta，R.D.、Goldsmith，M.、Ashani，Y.、Simo，Y.，Mullokandov，G.、Bar，H.、Ben-David，M.，Leader，H.，Margalit，R.、Silman，I.、Sussman，J.L.和Tawfik，D.S.（2011年）。自然化学。生物。 7, 120–125. 交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 Handing，K.B.，Niedzialkowska，E.，Shabalin，I.G.，Kuhn，M.L.，Zheng，H.&Minor，W.（2018年）。《国家协议》。 13，1062–1090科学网交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 Harper，L.L.、McDaniel，C.S.、Miller，C.E.和Wild，J.R.（1988年）。申请。环境。微生物。 54, 2586–2589. 交叉参考中国科学院公共医学科学网谷歌学者
 Hill，C.M.、Li，W.S.、Thoden，J.B.、Holden，H.M.和Raushel，F.M.（2003）。美国化学杂志。Soc公司。 125, 8990–8991. 交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Holden，H.M.和Raushel，F.M.（2021）。生物化学，60, 3413–3415. 交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 Holm，L.&Sander，C.（1997）。蛋白质，28, 72–82. 交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 Horne，I.、Sutherland，T.D.、Harcourt，R.L.、Russell，R.J.和Oakeshott，J.G.（2002）。申请。环境。微生物。 68, 3371–3376. 交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Jackson，C.、Kim，H.K.、Carr，P.D.、Liu，J.W.和Ollis，D.L.（2005）。生物化学。生物物理学。学报，1752，56–64科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Jackson，C.J.、Foo，J.-L.、Kim，H.-K.、Carr，P.D.、Liu，J.-W.、Salem，G.&Ollis，D.L.（2008）。分子生物学杂志。 375，1189–1196交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Jackson，C.J.、Foo，J.-L.、Tokuriki，N.、Afriat，L.、Carr，P.D.、Kim，H.-K.、Schenk，G.、Tawfik，D.S.和Ollis，D.L.（2009年）。程序。美国国家科学院。科学。美国，106, 21631–21636. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Jackson，C.J.、Weir，K.、Herlt，A.、Khurana，J.、Sutherland，T.D.、Horne，I.、Easton，C.、Russell，R.J.、Scott，C.和Oakeshott，J.G.（2009年）。申请。环境。微生物。 75, 5153–5156. 交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Job，L.，Köhler，A.，Eichinger，A.，Testanera，M.，Escher，B.，Worek，F.&Skerra，A.（2023）。生物化学，62, 942–955. 交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 Joosten，R.P.、Long，F.、Murshudov，G.N.和Perrakis，A.（2014）。IUCrJ大学，1, 213–220. 科学网交叉参考中国科学院公共医学 IUCr日志谷歌学者
 Khersonsky，O.，Lipsh，R.，Avizomer，Z.，Ashani，Y.，Goldsmith，M.，Leader，H.，Dym，O.和Rogotner，S.，Trudeau，D.L.，Prilusky，J.，Amengual-Rigo，P.，Guallar，V.，Tawfik，D.S.和Fleishman，S.J.（2018）。分子电池，72, 178–186. 交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 Kim，J.、Tsai，P.C.、Chen，S.L.、Himo，F.、Almo，S.C.和Raushel，F.M.（2008）。生物化学，47, 9497–9504. 交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Koca，J.、Zhan，C.G.、Rittenhouse，R.C.和Ornstein，R.L.（2001）。美国化学杂志。Soc公司。 123，817–826页公共医学中国科学院谷歌学者
 Leslie，A.&Powell，H.（2007）。高分子晶体学的发展方法由R.J.Read和J.Sussman编辑，第41–51页。多德雷赫特：施普林格。谷歌学者
 Levy，D.&Ashani，Y.（1986年）。生物化学。药理学。 35, 1079–1085. 交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 Liebschner，D.，Afonine，P.V.，Baker，M.L.，Bunkóczi，G.，Chen，V.B。，Croll，T.I.，Hintze，B.，Hung，L.-W.，Jain，S.，McCoy，A.J.，Moriarty，N.W.，Oeffner，R.D.，Poon，B.K.，Prisant，M.G.，Read，R.J。，理查德森·J·S、理查德森·D·C、萨米托·M·D、索博列夫·O·V、斯托克韦尔·D·H、特威利格·T·C、乌尔珠姆塞夫·A·G、维多·L·L·L.、威廉姆斯·C·J和亚当斯·P·D（2019）。《水晶学报》。D类75, 861–877. 科学网交叉参考 IUCr日志谷歌学者
 Masson，P.&Rochu，D.（2009年）。化学战剂毒理学手册由R.C.Gupta编辑，第1053–1065页。圣地亚哥：学术出版社。谷歌学者
 McCall，K.A.、Huang，C.和Fierke，C.A.（2000）。《营养学杂志》。 130，1437S–1446S。科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 McCoy，A.J.、Grosse-Kunstleve，R.W.、Adams，P.D.、Winn，M.D.、Storoni，L.C.和Read，R.J.（2007年）。J.应用。克里斯特。 40, 658–674. 科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 McLoughlin，S.Y.、Jackson，C.、Liu，J.W.和Ollis，D.（2005）。蛋白质实验。净化。 41, 433–440. 交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Murshudov，G.N.、Skubák，P.、Lebedev，A.A.、Pannu，N.S.、Steiner，R.A.、Nicholls，R.A、Winn，M.D.、Long，F.&Vagin，A.（2011）。《水晶学报》。D类67, 355–367. 科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 Naqvi，T.、Warden，A.C.、French，N.、Sugrue，E.、Carr，P.D.、Jackson，C.J.和Scott，C.（2014）。公共科学图书馆一号，9，电话94177交叉参考公共医学谷歌学者
 Newman，J.（2004）。《水晶学报》。D类60，610–612科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 Radić，Z.，Pickering，N.A.，Vellom，D.C.，Camp，S.&Taylor，P.（1993）。生物化学，32, 12074–12084. 公共医学谷歌学者
 Reeves，T.E.、Wales，M.E.、Grimsley，J.K.、Li，P.、Cerasoli，D.M.和Wild，J.R.（2008）。蛋白质工程设计。选择。 21, 405–412. 交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Robert，X.和Gouet，P.（2014）。核酸研究。 42，W320–W324科学网交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 Sabale，A.、Kulkarni，A.和Sabale（2020）。J.药物。Deliv公司。疗法。 10, 183–197. 交叉参考谷歌学者
 Selleck，C.、Guddat，L.W.、Ollis，D.L.、Schenk，G.和Pedroso，M.M.（2017年）。无机生物化学杂志。 177, 287–290. 交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 Singh，B.K.（2009）。自然修订版微生物。 7, 156–164. 交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Sussman，J.L.、Lin，D.、Jiang，J.、Manning，N.O.、Prilusky，J.、Ritter，O.和Abola，E.E.（1998年）。《水晶学报》。D类54, 1078–1084. 科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 Tokuriki，N.、Jackson，C.J.、Afriat-Jurnou，L.、Wyganowski，K.T.、Tang，R.和Tawfik，D.S.（2012）。国家公社。 三, 1257. 交叉参考公共医学谷歌学者
 Tsai，P.C.、Fox，N.、Bigley，A.N.、Harvey，S.P.、Barondeau，D.P.和Raushel，F.M.（2012）。生物化学，51, 6463–6475. 交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 Vanhouke，J.L.、Benning，M.M.、Raushel，F.M.和Holden，H.M.（1996）。生物化学，35, 6020–6025. 交叉参考中国科学院公共医学科学网谷歌学者
 Warshel，A.、Sharma，P.K.、Kato，M.、Xiang，Y.、Liu，H.和Olsson，M.H。(2006).化学。版次。 106, 3210–3235. 交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Weichenberger，C.X.、Afonine，P.V.、Kantardjieff，K.和Rupp，B.（2015）。《水晶学报》。D类71, 1023–1038. 科学网交叉参考 IUCr日志谷歌学者
 Worek，F.、Seeger，T.、Goldsmith，M.、Ashani，Y.、Leader，H.、Sussman，J.L.、Tawfik，D.、Thiermann，H.和Wille，T.（2014）。架构（architecture）。毒物。 88, 1257–1266. 交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 Yamashita，M.M.、Wesson，L.、Eisenman，G.和Eisenberg，D.（1990年）。程序。美国国家科学院。科学。美国，87, 5648–5652. 交叉参考中国科学院公共医学科学网谷歌学者
 Yang，C.-Y.，Renfrew，P.D.，Olsen，A.J.，Zhang，M.，Yuvienco，C.，Bonneau，R.&Montclare，J.K.（2014）。化学生物化学，15, 1761–1764. 交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 Yang，H.，Carr，P.D.，McLoughlin，S.Y.，Liu，J.W.，Horne，I.，Qiu，X.，Jeffries，C.M.，Russell，R.J.，Oakeshott，J.G.&Ollis，D.L.（2003）。蛋白质工程。 16, 135–145. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Zhao，X.，Li，G.和Liang，S.（2013）。J.分析。方法。化学。 2013, 581093. 交叉参考公共医学谷歌学者
 Zheng，H.、Chruszcz，M.、Lasota，P.、Lebioda，L.和Minor，W.（2008年）。无机生物化学杂志。 102, 1765–1776. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者

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