1.简介

20世纪80年代，雅克·杜博切特（Jacques Dubochet）及其同事建立了蛋白质溶液薄膜的玻璃化和成像电子显微镜（杜博切特等。, 1988). Dubochet的方法仍然是低温电子显微镜的标准方法，需要将几微升的蛋白质溶液涂敷在涂有碳膜或金膜的电子显微镜支撑格栅上，该薄膜上有许多微米级的孔。然后用滤纸吸走大部分溶液，留下约500–1000 一种厚厚的水膜，通过放入制冷剂浴中迅速冻结。尽管取得了巨大的成功，但这种方法仍有几个缺点。首先，这个过程非常浪费。例如，使用1 需要～3的MDa蛋白复合物 ～3时的样品ml 毫克 毫升⁻¹图像中粒子的最佳密度（Rubinstein等。, 2003)，所用溶液含有～9×10⁻⁶ g由~5×10组成的蛋白质¹²分子。如果吸墨纸形成1000 覆盖3层的厚膜 直径为mm的格栅，仅～2×10⁻⁹ g蛋白质或～1×10⁹分子仍然存在，这意味着实验中使用的材料损失了99.98%。目前，典型的分析可能包括～10⁶分子，相当于所用样品的～0.00002%。其次，用滤纸吸干样本的过程通常需要几秒钟。在此期间，样品的表面积与体积之比急剧增加，允许蛋白质与空气-水界面相互作用，从而导致优先取向或变性样品（Glaeser等。, 2016; D'Impima公司等。, 2019; 诺布尔，丹迪等。, 2018; Noble，魏等。, 2018). 印迹过程的速度较慢也使用于样本时间分辨可视化的实验设计复杂化。

已经描述了几种最新的方法来规避样本制备中吸墨法的部分或全部限制。时间分辨EM实验已经用压力驱动微流体（Feng等。, 2017; 卡莱洪卡尔等。, 2018)和电压辅助（Kontziampasis等。, 2019)喷洒装置。已经通过使用微毛细管施加小体积的样品溶液来解决样品损失问题，cryoWriter设备能够施加小于5 样本nl到传统EM网格（凯默林等。，2013年; 阿诺德等。, 2016, 2017; 施密德利等。, 2019). 这种方法使人类20S蛋白酶体结构的测定达到了~3.5 从1隔离后的分辨率 微升培养的人类细胞（Schmidli等。, 2019). 另一个最近描述的设备使用一个特制的压电换能器将样品应用于低温电磁网格，该换能器设计用于通过产生驻波（Ashtiani等。, 2018). NIH国家自动分子显微镜资源中心（Jain等。, 2012; 丹迪等。, 2018). Spotiton设备使用一个压电换能器耦合到一个微毛细管上，类似于喷墨打印机，将数十微微立方体的液滴流施加到电磁网格上。该小组最近的一项突破是开发了“自吸”电磁网格，大大提高了冰膜的质量（Wei等。, 2018; 拉津科夫等。, 2016). 这些网格是通过在碱性pH下用过硫酸铵溶液处理铜-铑EM网格来生产的，这会导致Cu（OH）的生长₂网格铜表面上的纳米线。纳米线的作用是从网格中去除多余的液体，类似于吸墨纸，但规模较小，速度更快。不幸的是，纳米线的生长过程破坏了已经覆盖有多孔碳或金膜的商用样品网格。然而，使用微接触印刷方法，可以很容易地用规则排列的孔生产塑料薄膜（切斯特等。, 2007; 马尔等。, 2014). 这些薄膜可以沉积在自吸网格上，然后涂上碳或金（Meyerson等。, 2014; Russo&Passmore，2014年). Spotiton设备允许快速制备样本，大大减少了所需的样本量，原则上允许进行时间分辨实验。

上述方法的几个方面需要对机械和光学组件进行精确的工程设计，这使得不专门从事仪器设计的实验室的建设变得复杂。在这里，我们提出了一种简单而廉价的低温电子显微镜样品制备装置，将样品作为水滴应用于自吸芯电子显微镜格栅，水滴由现成的超声波加湿器改装而成。该设备具有几个优点，包括快速制备样品、低样品消耗和执行时间分辨实验的能力。最重要的是，该设备可以很容易地适用于特定应用实验的设计。为了方便这个角色，我们用标准组件构建了这个设备，并用一台运行Python程序的廉价Raspberry Pi单板计算机控制它。所有定制零件的设计都以开源文件的形式提供，零件可以通过在线3D打印、CNC铣削和印刷电路板制造服务进行制造，即使实验室没有技术车间。这种设计理念将允许其他研究小组将该设备用于其他应用。由于使用了压电换能器来产生样品液滴，并且为了向率先使用自吸网格的Spotiton仪器致敬，我们将我们的设备命名为Shake-it-off或SIO。

2.方法和结果

2.1、。概述和过程控制

SIO设备使用四个主要部件来制备样本：压电喷雾器、自吸网格、带可拆卸镊子的插入螺线管和冷冻槽。不同电子过程的定时由树莓Pi（RPi）单板计算机（树莓Pi3B+；https://www.raspberrypi.org/)运行默认的Raspbian操作系统（v.8，“Jessie”）。RPi上的Python 3软件可以将RPi的通用输入输出（GPIO）引脚的电压设置为“高”（3.3 五） 或“低”（0 V） 。来自GPIO引脚的高信号应用于N沟道增强模式功率MOSFET（金属氧化物半导体场效应晶体管）的栅极，允许晶体管用作高速开关，需要时多个晶体管向器件的不同组件提供电源（图1一). 印刷电路板（图1b条)是用设计的Altium设计师v.18，由PCBWay制造(https://www.pcbway.com/). 汇总所有部件的零件清单如下所示支持信息.

图1 (一)SIO控制电路示意图。(b条)定制印制电路板的制造设计。(c（c）)定制印刷电路板。

2.2. 超声波分配溶液

SIO使用简单廉价的压电换能器和商用新型超声波加湿器的高频产生电路，将一股小液滴喷射到自吸EM格栅上（图2一). 加湿器设计为由5个 计算机的V USB端口。当置于水中时，水的导电性将装置中的电极与地面相连，从而使装置能够启动，避免压电换能器在空气中长时间通电而造成损坏。为了覆盖加湿器电路中的这种保护措施，添加了一根电线将电极接地（图2b条，蓝色圆圈），以便通过连接到5来激活电路 V电源。加湿器的压电换能器有一个中央阵列，约为3.5 直径为mm，有许多小孔，允许液体通过传感器（图2c（c）). 为了喷射网格，压电传感器被固定在网格附近，蛋白质样品（～1 µl）施加在传感器表面的中心，背对EM栅极。当高频产生电路被激活时，一小股液滴从压电传感器向栅极喷射。观察到SIO设备中使用的压电换能器的信号生成电路可以生成粗略的108 kHz信号，峰值振幅为～175 V，占空比为～11%。该特定压电换能器的液滴尺寸尚未通过实验进行表征。然而，对相关设备的分析显示，液滴的产量从100下降到10 当频率从200增加到2400时，直径为nm 千赫（Kudo等。, 2017)以及产生较小数量的较大液滴1-10 直径µm（Kudo等。, 2017; 罗德斯等。, 2007). 使用这些高频设备，液滴的精确尺寸也会随着盐浓度的变化而变化（Kudo等。, 2017). 我们发现一个2 μl液滴在5次～40次脉冲后完全雾化 ms，表明每个5 ms脉冲平均分配～50 nl.然而，雾化过程可能不是线性的，分配的体积可能会随着传感器上剩余的液体量而变化。为了准备网格，我们应用了～1 将µl样品涂在传感器上，尽管可以使用较小的体积。原则上，～1 µl的应用样品可用于制备大量的样品网格。然而，一些样品也可能因多次接触压电换能器所经历的高频振动而受损。虽然未使用的样品可以从换能器中回收并用于其他目的，但我们通常在准备每个网格后用薄纸去除剩余的样品。在去除样品后，用较大的水滴进一步清洁压电换能器(例如2–3 µl）并为传感器通电至200 ms连续5次。

图2 (一)USB超声波加湿器包含一个压电换能器和用于喷洒样品的高频产生电路。(b条)从加湿器中提取的压电换能器和高频生成电路如所示(一). 一根允许电路在水外启动的电线用蓝色圈出。(c（c）)一滴（1 µl）施加在与液体喷射方向相反的压电换能器表面。(d日)压电换能器安装连接器的设计。(e（电子）)样品应用位置（i）处的压电传感器、镊子和格栅，显示压电传感器（ii）的喷雾，压电传感器缩回至准备插入位置（iii）。

2.4. 格栅下沉

当网格与压电换能器保持足够的距离以允许镊子插入时，用液滴流重复撞击EM网格被证明具有挑战性。因此，压电换能器安装在一个小的“拉式”螺线管上。将压电换能器连接到螺线管的支架设计为Autodesk Fusion 360（图2d日). 多伦多大学医学院3D打印设备使用Fortus 450mc 3D打印机在聚碳酸酯中打印所有3D打印组件(https://www.uoftmedprint.com/). 螺线管的位置应确保在喷涂位置，压电换能器接触镊子，并为～1 距格栅mm（图2e（电子），i），使来自压电换能器的喷雾击中电网（图2e（电子），ii）。电磁阀断电后，压电换能器可由弹簧驱动从电网中缩回（图2e（电子），iii），为格栅插入冷冻剂提供必要的间隙，而镊子不会碰到换能器。从电感负载（如螺线管）中移除电流可能会在负载上产生突然的电压尖峰。为了避免此电压尖峰对MOSFET造成损坏，电路中包含一个反激二极管，其极性与施加的电压相反（图1一，二极管D1和D2）。

格栅的插入由带有30的大型电磁阀执行 mm的移动距离，与之前在crowWriter设备中用于相同目的的螺线管相同（Arnold等。, 2016, 2017; 凯默林等。，2013年). 该电磁阀还使用了一个反激二极管。为了方便快捷地将镊子与插入螺线管连接和断开，打印了一个磁性连接器（图3一). 该连接器的一半通过用环氧腻子固定到位的螺母连接到插入螺线管，而另一半连接到镊子。两半由圆柱形钕磁体（6 直径mm和3 mm厚）用环氧树脂固定。

图3 (一)磁性镊子连接器的设计。这两个部分由嵌入的磁铁固定在一起。(b条)制冷剂容器的3D设计适合于标准的Abcam聚苯乙烯泡沫塑料盒，由铝研磨而成。(c（c）)完全组装的SIO样品制备装置。

3.结构确定

确定了适合低温电解加工的冰的条件结构测定可以使用马脾脏脱铁蛋白（Sigma）持续生产。完整的样品制备过程如所示补充视频S1通过在TBS（50）中稀释20倍，样品中甘油的浓度从50%降低 米M（M）三氯化氢，150 米M（M）NaCl pH 7.4），并使用离心浓缩装置浓缩20倍 kDa分子量截留膜。在使用之前，格栅在空气中进行2次辉光放电 40时最小 25毫巴 Pelco-easiGlow辉光放电装置中的毫安电流，栅极的纳米线表面朝向放电装置的等离子体。答1 5μl载脂蛋白溶液滴 毫克 毫升⁻¹在TBS中放置在压电换能器的背面。5 毫克 毫升⁻¹是我们实验室使用传统网格分离设备制备样品网格时脱铁蛋白的典型浓度。为了将样品应用于电网，高频产生电路通电5 5时为毫秒 ms，通过使压电定位螺线管断电而使压电从电网缩回，并且使插入螺线管通电。安装在插入螺线管上的红外障碍物避免传感器（Keyestudio），以及在2.5时录制慢速视频 使用移动电话摄像机（OnePlus 6），每帧毫秒，两者都表明从喷雾开始到将格栅完全浸入～90的制冷剂中的总时间 毫秒(补充视频S2). 用Spotiton装置冷冻大约这个长度的时间已经被证明可以减少蛋白质与空气-水界面相互作用的择优取向（Noble，Wei等。, 2018)，但我们还没有在这里证明这一优势。

使用FEI Tecnai F20显微镜在200℃下对格栅进行表征 kV，显微照片记录为15 s电影，30帧，每秒5个电子/像素，标定像素大小为1.45 每像素奥。在泰坦Krios G3电子显微镜上收集了324部高分辨率电影的数据集，该电子显微镜工作温度为300 kV，记录为180帧，超过30帧 Falcon 3EC上的s，曝光率为每秒0.8个电子/像素，校准像素大小为1.06 每像素Ω，总曝光21 电子 Å⁻²网格的地图集图像（图4一和4b条)显示该设备创建了一个由网格方格带包围的厚冰区域，网格方格中有适合数据采集的冰。格栅的这种外观是典型的，似乎与喷洒的样品无关。这大概是因为压电换能器喷雾的中心和最强烈区域向栅极上沉积的液体比纳米线的芯吸作用所能清除的液体更多。通过进一步缩短喷射期间压电换能器通电的时间，可以减少格栅此区域的冰厚度。网格正方形的图像（图4b条，插图）显示网格方形的边缘可能有无冰的洞，这可能是由于自吸湿网格清除了多余的材料，而网格方形的中心有适合成像的冰。从该区域的孔洞中可以看到脱铁蛋白颗粒，也可以看到一些污染或损坏的颗粒，这些颗粒可能来自商用脱铁蛋白的长期储存（图4c（c）). 图像分析冷冻SPARCv.2（旁遮普语等。, 2017)允许选择308 将752张粒子图像简化为172张数据集 通过2D和3D分类的469个粒子图像。这些图像用于计算2.6的3D地图 分辨率（图4d日).

图4 (一,b条)Titan Krios显微镜的网格地图集显示了大片厚冰[在(b条)]外围区域为适合数据采集的冰[在(b条)]. 比例尺，500 mm.插图，一个区域的网格正方形，有合适的冰用于成像，显示其外围有一些过度磨损。比例尺，20 微米。(c（c）)来自TF20显微镜的图像显示冰中的马脱铁蛋白颗粒。比例尺，500 Å. (d日)马载脂蛋白2.6的3D图谱 Titan Krios显微镜的分辨率。

4.讨论

在这里，我们已经表明，一个简单的设备结合了3D打印和CNC铣削零件、印刷电路板和廉价的消费类组件，能够生产出适合于高分辨率低温电子显微镜分析的样品，样品的含量为～100 毫秒时间分辨率。这种时间分辨率可以进行简单的混合和冷冻实验，例如，放置两个分开的～500 nl压电换能器上的反应物滴，而不是单个～1 ml滴。设备的3D打印和CNC铣削部件的所有设计，以及印刷电路板和Python仪器控制软件的设计文件，均可在https://github.com/johnrubinstein网站通过这些设计，对技术车间和设备访问有限的科学家可以通过使用互联网上访问的服务轻松构建自己的设备。

这种开源设计的目的是，SIO设备可以轻松定制和修改，以用于特殊应用。设备的各种组件也可能需要改进。例如，该装置的第二个版本已经计划好，通过使用xyz公司定位阶段。此外，该设备的一个简单吸墨纸版本也正在构建中，它将以较小的成本提供商用网格冻结设备（如Vitrobot、Gatan CP3和Leica EM GP）的优势，并具有各种所需的定制功能。这里描述的仪器通过从样品中产生气溶胶来工作。因此，在处理气溶胶可能对健康造成潜在危害的样品时，如处理某些病毒、毒素或朊病毒蛋白时，不应使用。