Structural Basis for Cooperative Function of Mettl3 and Mettl14 Methyltransferases

doi:10.1016/j.molcel.2016.05.041

.2016年7月21日；63(2):306-317.

doi:10.1016/j.molcel.2016.05.041。 Epub 2016年6月30日。

Mettl3和Mettl14甲基转移酶协同作用的结构基础

王平（Ping Wang）¹, 凯特琳·A Doxtader¹, Yunsun Nam公司²

附属公司

¹美国德克萨斯州达拉斯市德克萨斯大学西南医学中心Cecil H.和Ida Green生殖生物学中心，邮编75390；德克萨斯大学西南医学中心妇产科基础生殖生物学研究部，达拉斯，德克萨斯州75390，美国；美国德克萨斯州达拉斯市德克萨斯大学西南医学中心生物物理系，邮编75390。
²美国德克萨斯州达拉斯市德克萨斯大学西南医学中心Cecil H.和Ida Green生殖生物学中心，邮编75390；德克萨斯大学西南医学中心妇产科基础生殖生物学研究部，达拉斯，德克萨斯州75390，美国；美国德克萨斯州达拉斯市德克萨斯大学西南医学中心生物物理系，邮编75390。电子地址：yunsun.nam@utsouthwestern.edu。

PMID： 27373337
预防性维修识别码：项目经理4958592
内政部： 2016年10月10日/j.molcel.2016.05.041

Mettl3和Mettl14甲基转移酶协同作用的结构基础

王平（Ping Wang）等。分子电池. 2016.

.2016年7月21日；63(2):306-317.

doi:10.1016/j.molcel.2016.05.041。 Epub 2016年6月30日。

作者

王平（Ping Wang）¹, 凯特琳·A Doxtader¹, Yunsun Nam公司²

附属公司

¹美国德克萨斯州达拉斯市德克萨斯大学西南医学中心Cecil H.和Ida Green生殖生物学中心，邮编75390；得克萨斯大学西南医学中心妇产科基础生殖生物学研究部，美国得克萨斯州达拉斯75390；美国德克萨斯州达拉斯市德克萨斯大学西南医学中心生物物理系，邮编75390。
²美国德克萨斯州达拉斯市德克萨斯大学西南医学中心Cecil H.和Ida Green生殖生物学中心，邮编75390；德克萨斯大学西南医学中心妇产科基础生殖生物学研究部，达拉斯，德克萨斯州75390，美国；美国德克萨斯州达拉斯市德克萨斯大学西南医学中心生物物理系，邮编75390。电子地址：yunsun.nam@utsouthwestern.edu。

PMID： 27373337
预防性维修识别码：项目经理4958592
内政部： 2016年10月10日/j.molcel.2016.05.041

摘要

N（6）-甲基腺苷（m（6）A）是一种普遍存在的、可逆的功能性RNA化学修饰，对生物学中的中心事件非常重要。核心m（6）A写作者是Mettl3和Mettl14，它们都包含甲基转移酶结构域。Mettl3和Mettl14如何协同催化腺苷甲基化仍然是个谜。我们展示了以载脂蛋白形式存在的Mettl3/Mettl14甲基转移酶结构域复合物的晶体结构，以及在催化位点与结合的S-腺苷蛋氨酸（SAM）或S-腺苷酸同型半胱氨酸（SAH）的晶体结构。我们确定甲基转移酶结构域的异二聚体复合物与CCCH基序结合，构成体外产生m（6）A修饰的最低要求区域。我们还表明Mettl3是催化活性亚单位，而Mettl14在底物识别中起着关键的结构作用。我们的模型为Mettl3和Mettl14的某些突变导致甲基转移酶复合物功能受损提供了分子解释。

PubMed免责声明

数字

**图1。Mettl3/Mettl14甲基转移酶结构域复合物的结构**
**（A）**人类Mettl3和Mettl14的领域架构。结晶构造用下面的彩色编码条表示，并带有相应的残留物编号。MTD14的端子延伸部分为黄色。CCCH表示Cys-Cys-Cys-His母题。**（B）**全长Mettl3/Mettl14复合物的多角度光散射（SEC-MALS）尺寸隔离色谱图。左轴表示280 nm处的吸光度（蓝色峰），右轴表示每个洗脱体积散射（橙色线）测得的分子量。1:1 Mettl3/Mettl14络合物的理论分子量为118KDa，从MALS测得的平均分子量为122KDa。**（C）**MTD3/MTD14综合体的SEC-MALS剖面图。类似于**（B）**1:1的MTD3/MTD14配合物的理论分子量为65KDa，从MALS测得的平均分子量为68KDa。**（D）**MTD3/MTD14综合体整体结构的卡通表现。MTD3以绿色显示，MTD14以橙色显示。N端子（N）和C端子（C）端子如图所示，MTD14的端子扩展部分为黄色。**（E）**动画表现中MTD3和MTD14的叠加。另请参见图S1。

**图2。Mettl3是活性亚单位，Mettl14催化基序是可有可无的**
**（A）**包含催化基序DPPW（Mettl3）和EPPL（Mettl14）的区域的序列比对。片段的二级结构显示在序列上方。**（B）**MTD3（绿色表面表示）和MTD14（橙色卡通和棍棒表示）的叠加。MTD14中提议的催化腔（黑圈）更加闭塞。**（C）**MTD3和MTD14的表面表示上显示的序列守恒。MTD3和MTD14都是根据保护得分着色的。提议的活动场地用黑色圆圈标记。**（D）**在大肠杆菌中表达的全长Mettl3/Mettl14复合物的体外甲基转移酶活性，每个多肽具有指示的点突变。条形对应于甲基化RNA底物中掺入的氚量，以同源序列（GGACU=红色）或突变序列的每分钟崩解数（DPM）表示。数据显示为三个重复的平均+/-SD。**（E）**从HEK293细胞（蓝条）纯化的全长Mettl3/Mettl14复合物的体外甲基转移酶活性（带有指示点突变）。数据显示为三个重复的平均+/-SD。**（F）**SDS-PAGE分析（用无染色染料显示），然后对图2E中体外甲基化试验中使用的HEK293细胞中表达的蛋白质进行western blot。另请参见图S2和S3。

**图3。MTD3的SAM和SAH装订袋**
**（A）**以1.0σ等高线绘制的复合省略图显示了SAM的清晰电子密度（蓝色网格），以棍状表示显示，主干颜色为青色。**（B）**以1.0σ等高线绘制的复合省略图显示SAH的清晰电子密度（蓝色网格），以黄色主干的棒状表示显示。**（C）**SAM（青色条）和MTD3（绿色卡通表示）活动站点的详细交互。与SAM接触的特定残留物以绿色棒状表示，并用黑色文本标记。催化基序DPPW用红色文本标记。参与SAM结合的重要水分子显示为红色球体。氢键用黑色虚线表示。SAM的甲基和提议的催化残留物D395之间的距离用双头箭头（3.8º）标记。**（D）**投影在MTD3表面的进化序列保守性在SAM结合位点附近显示出高保守性。SAM以棒状表示，主干以青色显示。**（E）**SAH（黄色条）和MTD3（绿色卡通表示）活动站点的详细交互。与SAH接触的特定残留物以绿色棒表示，并用黑色文本标记。活性位点DPPW基序用红色文本标记。参与SAM结合的重要水分子显示为红色球体。氢键标记为黑色虚线。另请参见图S4。

**图4。Mettl14稳定并促进Mettl3催化活性**
**（A）**结合SAM的MTD3/MTD14复合体的整体结构以卡通表示。SAM以棒状表示显示，主干颜色为青色。Ligplot识别为畴间接触的残留物显示为侧链的棒状物（MTD3为绿色，MTD14为橙色）。**（B）**MTD3的绿色表面表示，与MTD14接触的残留物以灰色显示。**（C）**MTD3的方向与**（B）**，但被序列守恒所着色。**（D）**MTD14的橙色表面表示，与MTD3接触的残留物以灰色显示。**（E）**MTD14的方向与**（D）**，但被序列守恒所着色。**（F）**以卡通形式显示的SAM-bound MTD3/MTD14复合体的整体结构。SAM显示为青色条。虚线矩形提供了MTD3/MTD14绑定接口的特写视图。异二聚体形成的关键残基显示为绿色条，并用绿色文本（MTD3）或橙色条标记，用红色文本（MTD14）标记。调节氢键的水分子显示为红色小球，氢键显示为黑色虚线。**（G）**在HEK293细胞中表达的全长Mettl3/Mettl14复合物或Mettl3单独的体外甲基转移酶活性。数据显示为三个重复的平均+/-SD。**（H）**在大肠杆菌中表达的全长Mettl3/Mettl14复合物的体外甲基转移酶活性，具有指示的点突变或截断（MTD）。数据显示为三个重复的平均+/-SD。**（一）**具有指示点突变的HEK293细胞中表达的全长Mettl3/Mettl14复合物的体外甲基转移酶活性。数据显示为三个重复的平均+/-SD。另请参见图S5。

**图5。与Mettl3/Mettl14复合物的拟议RNA底物相互作用**
**（A）**在大肠杆菌中表达的全长Mettl3/Mettl14复合物的体外甲基转移酶活性，具有指示的点突变或截断（MTD）。**（B）**在具有指示点突变的HEK293细胞中表达的全长Mettl3/Mettl14复合物的体外甲基转移酶活性。数据显示为三个重复的平均+/-SD。**（C）**通过将mDNMT1-DNA复合物结构（PDB:4DA4）叠加到MTD3/MTD14复合物上，对RNA结合位点进行建模。mDNMT1-DNA的复杂结构的建模DNA底物以紫色卡通表示，并且为了简单起见省略了mDNMT1的MTD。特写视图（虚线矩形）显示SAM甲基中的Y406残基6.3º（青色棒）。**（D）**具有指示点突变的大肠杆菌中表达的全长Mettl3/Mettl14复合物的体外甲基转移酶活性。数据显示为三个重复的平均+/-SD。**（E）**具有指示点突变的HEK293细胞中表达的全长Mettl3/Mettl14复合物的体外甲基转移酶活性。数据显示为三个重复的平均+/-SD。**（F）**MTD3/MTD14复合物的真空静电势着色的表面表示与**（C）**。靠近模型DNA的基本补丁由绿色虚线框表示。SAM以棒状表示显示，颜色为青色。另请参见图S6。

**图6。MTD3/MTD14复合结构的注释模型**
显示了MTD3（绿色卡通）和MTD14（橙色卡通，黄色终端扩展）复合结构。MTD14的终端扩展延伸至MTD3（黄色丝带）。SAM（青色棒）结合催化腔的一端，延伸至畴间界面（浅紫色球体）。MTD之间的凹面空间由三个“围栏”环（紫色）包围。本研究中突变的特异性残基和显著降低酶活性的残基显示为深蓝色球体，MTD14催化位点的弱突变显示为灰色球体。所有突变残基都被标记（MTD3：绿色，MTD14：橙色）。

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中的注释

m（6）A甲基转移酶复合物的结构：具有不同但协调作用的两个亚单位。
周凯，潘婷。周凯等。分子细胞。2016年7月21日；63(2):183-185. doi:10.1016/j.molcel.2016.07.005。分子细胞。2016 PMID：27447983 免费PMC文章。

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