跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https公司

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
。2014年7月；28(7):3050-63.
doi:10.1096/fj.13-245126。 Epub 2014年4月14日。

蛋白激酶R在巨噬细胞通过TNFα和IFNβ对中性粒细胞弹性蛋白酶和TLR4杀伤利什曼原虫中的作用

玛丽亚·斯法里亚 1, Tereza C Calegari-Silva公司 1, 艾斯兰·德·卡瓦利奥·维瓦里尼 1, 杰里米·莫特伦 2, 乌利塞斯·加佐斯·洛佩斯 1, 安娜·保拉·C·A·利马 三
附属公司

蛋白激酶R在巨噬细胞通过TNFα和IFNβ对中性粒细胞弹性蛋白酶和TLR4的反应杀死主要利什曼原虫中的作用

玛丽莉亚·法里亚等。 美国财务会计准则委员会J。 2014年7月。

摘要

在皮肤利什曼病中，亚马逊利什曼原虫激活巨噬细胞双链RNA激活蛋白激酶R（PKR）以促进寄生虫生长。在我们的研究中，主要利什曼原虫在RAW细胞、表达RAW的显性阴性PKR（PKR-DN）细胞和PKR基因敲除小鼠的巨噬细胞中正常生长，表明PKR对巨噬细胞中主要利什曼杆菌的生长是不必要的。感染多聚I:C的巨噬细胞中PKR激活导致寄生虫死亡。中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）抑制剂ecotin-like serine peptidase inhibitor（ISP2；ΔISP2/isp3）的主要敲除株中有50%在129Sv小鼠的RAW细胞或巨噬细胞中因PKR激活而死亡。PKR或NE的抑制或Toll样受体4或2（TLR4或TLR2）的中和可防止Δisp2/isp3的死亡。Δisp2/isp3在129Sv-PKR（-/-）、tlr2（-/-/）、trif（-/－）和myd88（-/--）小鼠的RAW-PKR-DN细胞或巨噬细胞中正常生长，NE活性、PKR和TLR反应与寄生虫死亡相关。Δisp2/isp3以PKR依赖的方式使TNF-αmRNA和干扰素β（IFNβ）mRNA的表达增加2倍。TNF-α抗体逆转了Δisp2/isp3 95%的杀伤作用，而它们在干扰素受体敲除小鼠的巨噬细胞中正常生长。我们认为ISP2通过NE-TLR4-TLR2轴阻止PKR的激活，以控制导致主要L.major死亡的先天反应-Faria，M.S.、Calegari-Silva，T.C.、de Carvalho Vivarini，A.、Mottram，J.C.、Lopes，U.G.、Lima，A.P.C.A.蛋白激酶R在巨噬细胞通过TNFα和IFNβ对中性粒细胞弹性蛋白酶和TLR4的反应杀死主要利什曼原虫中的作用。

关键词：ISP2；伤亡人数；生态素；干扰素。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
NE依赖性吞噬和杀死大型乳酸杆菌Δ互联网服务提供商2/互联网服务提供商巨噬细胞需要PKR。一个,B类)稳定转染空质粒（RAW-Bla；一个)或显性负PKR结构（RAW-DN-PKR；B类)感染大型乳酸杆菌3小时，清洗并固定（3小时）或进一步培养过夜（24小时）。C,D类)129Sv小鼠的巨噬细胞(C)或pkr公司−/−老鼠(D类)如前所述，感染3 h，清洗并培养48–72 h。如有指示，添加NEi OMeSuc-AAPV-CMK至10μM。实验分三次独立进行。图表代表1个实验，并表示平均值±标准偏差一式三份的实验。使用单向法进行统计分析(一个,B类)或双向(C,D类)方差分析。开放式酒吧：WT L.major；实心钢筋：Δ互联网服务提供商2/互联网服务提供商3 L大调*P（P）< 0.001, **P（P）< 0.0002.
图2。
图2。
巨噬细胞感染L.majorΔisp公司2/互联网服务提供商3促进PKR的激活。一个)PKR实时PCR。RAW264.7细胞感染4h后清洗，cDNA样本作为qPCR模板。未感染细胞作为PKR mRNA水平的对照。条形代表平均值±标准偏差共进行了3次独立的实验。B类)PKR启动子激活检测：用构建物p503-WT转染RAW264.7细胞，该构建物包含荧光素酶报告基因上游的KCS和ISRE启动子元件，并感染24小时。对正常化的裂解液进行荧光素酶活性检测。实验分为两次独立进行，共三次。条形代表1个实验，表示平均值±标准偏差一式三份的实验。C)PKR磷酸化。RAW264.7细胞感染30 min，裂解产物进行Western blot分析，以抗磷酸-PKR和抗肌动蛋白抗体作为负荷对照。通过密度测定法计算的磷-PKR的相对水平显示在底部。
图3。
图3。
Δ的PKR相关调制isp公司2/互联网服务提供商3L.主要存活需要TLR2、CD11b和TLR4。RAW-Bla公司(一个,B类)或RAW-DN-PKR(C,D类)细胞感染Δ互联网服务提供商2/互联网服务提供商3 (一个,C)或WT L.专业(B类,D类)3小时，清洗并固定（3小时），或清洗并培养过夜（24小时）。如有指示，用5μg/ml的CD11b、TLR4、TLR2或对照大鼠IgG2a抗体预先培养培养物30分钟，并在添加寄生虫之前清洗。实验进行了3次独立的实验。图表代表1个实验，表示平均值±标准偏差. *P（P）< 0.0001, **P（P）< 0.05.
图4。
图4。
TLR2和TLR4被招募到Δ入口互联网服务提供商2/互联网服务提供商3 L主要是巨噬细胞，而杀死寄生虫需要MyD88和TRIF。一个,B类)用WT感染C57B6小鼠的巨噬细胞(一个)或Δ互联网服务提供商2/互联网服务提供商3 L大调(B类)1小时，用抗TLR2（红色）或抗TLR4（绿色）进行免疫荧光处理。样品采用共聚焦显微镜进行分析，从下到上在0.9μm处进行8次切片；图片显示了第3部分。比例尺=5μm。箭头表示寄生虫。C–F类)TLR2基因敲除小鼠的巨噬细胞(C)、MyD88基因敲除小鼠(D类)，129Sv小鼠(E类)，或TRIF-基因敲除小鼠(F类)感染3小时，洗涤，并固定或培养24小时。实验分别进行2次*P（P）< 0.001.
图5。
图5。
聚（I:C）激活PKR影响巨噬细胞中主要WT L.的存活。丝氨酸-苏氨酸激酶的抑制促进Δ的存活互联网服务提供商2/互联网服务提供商3 L大调。原始bla(一个)和RAW-DN-PKR(B类)C57B6小鼠的细胞或巨噬细胞感染WT(C)或Δisp公司2/互联网服务提供商3 L大调(D类)3小时，清洗并固定（3小时）或进一步培养（24–72小时）。感染3小时后立即用2AP（2 mM）处理感染细胞1小时，或用poly（I:C）（25μg/ml）隔夜处理。如有指示，感染细胞用2AP处理，然后用poly（I:C）处理。开口钢筋：WT；实心钢筋：Δ网络服务提供商2/3实验进行了3次独立的实验。图表代表1个实验，并表示平均值±标准偏差. *P（P）< 0.01, **P（P）< 0.001.
图6。
图6。
ISP2是感染大型乳酸杆菌的巨噬细胞持续核NF-κB所必需的。一个,C)将细胞感染2、5或8小时，然后处理核提取物，用NF-κB亚单位p65的抗体进行Western blot分析(一个)、IRF3(C)或核层粘连蛋白，作为负荷控制。B类)NF-κB启动子激活。用报告质粒p6Kb-LUC瞬时转染RAW细胞，该报告质粒包含6个NF-κB的共有结合位点，位于荧光素酶基因上游，并感染24小时。未感染的细胞用作基础荧光素酶活性的阴性对照。实验进行了两次独立的实验。开口钢筋：WT；实心钢筋：Δ网络服务提供商2/网络服务提供商3; 灰色条：Δisp2/isp3:isp2-isp3. *P（P）< 0.05.
图7。
图7。
Δ感染巨噬细胞的基因表达变化互联网服务提供商2/互联网服务提供商3 L.major依赖于PKR。细胞感染4h，cDNA作为模板用于qPCR分析。实验进行了3次独立的重复实验。图形表示平均值±标准偏差SOD1增加了一倍(一个)、iNOS(B类)，肿瘤坏死因子α(C、 D类)，IL-10(E类)和干扰素β(F类)与3个实验中未感染细胞（设为1.0）相关。插图：RAW细胞与重组IFNγ（100 ng/ml）孵育3 h，感染18 h。在无寄生虫上清液中评估亚硝酸盐浓度。实验进行了两次独立的实验。在D类感染前，细胞与重组IFNγ（100 ng/ml）孵育3h，并用ELISA检测上清液。实验进行了3次独立的实验。图代表了一个实验。开口钢筋：WT；实心钢筋：Δ网络服务提供商2/网络服务提供商3; 灰色条，未感染细胞。采用双向方差分析进行统计分析*P（P）< 0.05.
图8。
图8。
TNF-α是杀死细胞内Δ所必需的互联网服务提供商2个/互联网服务提供商3.原Bla(一个)或原始DN-PKR(B类)细胞感染3h，清洗，培养过夜（24h）。感染3小时后立即向培养物中加入10μg/ml的TNF-α、IL-10或对照大鼠IgG中和抗体，并放置过夜。实验分为两次独立进行，共三次。图表代表1个实验，并表示平均值±标准偏差实验一式三份*P（P）< 0.01, **P（P）< 0.001.
图9。
图9。
原代巨噬细胞中IFNβ和TNF-α的诱导限制了Δ的细胞内生长互联网服务提供商2个/isp公司3.C57B6的巨噬细胞(一个,B类)，129Sv(C,E类)、和若无风险−/−老鼠(D类)感染3 h，清洗，固定或培养24–72 h。重组干扰素β（1000 U/ml；一个,B类)或TNF-α抗体(F类)感染3h后立即加入培养物。实验进行了3次独立的实验。图中显示了一个实验的代表图。E类)将129Sv小鼠的巨噬细胞感染4 h，并将cDNA用作qPCR检测的模板。图表表示平均值±标准偏差相对于未感染细胞的倍数增加（设为1.0），这是两个独立实验的代表。采用双向方差分析进行统计分析*P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001与.所有其他时间点。
图10。
图10。
PKR控件体内Δ感染isp公司2/互联网服务提供商3 L大调。129Sv或pkr公司−/−小鼠接种2×105纯化亚环L.majorΔ互联网服务提供商2/互联网服务提供商3.48小时后，通过限制稀释和25°C下培养5-7天来评估寄生虫负荷。实验独立进行了3次(n个=5/组）。
图11。
图11。
感染大型乳酸杆菌的巨噬细胞中的分子相互作用。与亚马逊乳杆菌相反，PKR激活导致大乳杆菌死亡，ISP2是阻止PKR激活的因素。在没有ISP2的情况下，TLR4和TLR2被招募到寄生虫进入的位点，蛋白水解活性的NE触发这些受体(1)导致磷酸化(2). NF-κB亚单位p65的核水平(3a年)干扰素调节因子3（IRF3(3亿)相比之下，感染WT L.major的巨噬细胞数量减少。TNF-α的产生(4)和干扰素β(5)被诱导，导致寄生虫死亡(6). 激活TLR通过MyD88和TRIF对于在24小时内杀死约50%的内化寄生虫是必要的。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Williams B.R.（2001）通过PKR进行信号集成。科学STKE 2001，第2版。-公共医学
    1. Lee J.H.、Park E.J.、Kim O.S.、Kim H.Y.、Joe E.H.和Jou I.（2005）双标记RNA活化蛋白激酶是LPS诱导激活大鼠脑胶质细胞中STAT1炎症信号的必要条件。Glia格利亚50、66–79-公共医学
    1. Goh K.C.、deVeer M.J.、Williams B.R.（2000）p38 MAPK激活和对细菌内毒素的先天免疫反应需要蛋白激酶PKR。EMBO期刊19，4292–4297-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Cabanski M.、Steinmuller M.、Marsh L.M.、Surdziel E.、Seeger W.、Lohmeyer J.（2008）PKR调节小鼠肺泡巨噬细胞中TLR2/TLR4依赖性信号。美国J.Respir。细胞分子生物学。38, 26–31-公共医学
    1. Kedzierski L.、Sakthianandeswaren A.、Curtis J.M.、Andrews P.C.、Junk P.C.和Kedzirska K.（2009）利什曼病：新药和疫苗的当前治疗和前景。货币。医药化学。16, 599–614-公共医学

出版物类型

赠款和资金

LinkOut-更多资源