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.2012年3月22日；119(12):2789-98.
doi:10.1182/bloud-2011-10-387902。 Epub 2012年2月2日。

HIF-1α缺失部分修复了Cited2缺乏引起的造血干细胞静止缺陷

杜金伟 1, 于晨, 李强, 祥子韩, 张芳弟, 王正奇, 大卫·丹尼尔普尔, 莎莉·L·邓伍德, 凯文·德·邦廷, 杨宇昌
附属公司

HIF-1α缺失部分修复了Cited2缺乏引起的造血干细胞静止缺陷

杜金伟等。 血液. .

摘要

Cited2是一种转录调节剂，参与包括胎肝造血在内的各种生物过程。在本研究中，在条件敲除小鼠中研究了Cited2在成年造血中的功能。使用Mx1-Cre删除Cited2导致造血干细胞（HSC）凋亡增加、静止丧失和循环增加，导致5-氟尿嘧啶治疗和长期移植评估的重建能力严重受损。转录谱分析显示，多个HSC静止和低氧相关基因，如Egr1、p57和Hes1，在Cited2缺陷的HSC中受到影响。由于Cited2是HIF-1的负调节因子，这对维持HSC静止至关重要，并且因为我们之前证明减少HIF-1α基因剂量可以部分地挽救因Cited2缺陷引起的心脏和晶状体缺陷，所以我们培育出了Cited2和HIF-1 a双敲除小鼠。在Cited2-knockout BM中额外删除HIF-1α，部分挽救了受损的HSC静止和重建能力。在转录水平上，HIF-1α的缺失使p57和Hes1的表达恢复到正常水平，但Egr1的表达没有恢复到正常的水平。我们的结果表明，Cited2通过HIF-1依赖性和HIF-1诱导性途径调节HSC静止。

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数字

图1
图1
有条件删除引用2导致LT-HSC数量减少。（A） pI-pC处理可有效删除引用2，由相对表达式确定引用2LSK细胞中mRNA归一化为18S RNA（平均值±SEM，n=8）。（B-D）pI-pC治疗后约2-3周，野生型（WT）和引用2Δ/Δ小鼠白细胞数（B）、骨髓细胞数（C）和LSK细胞数（D）。所示数据为平均值±SEM（n=6）。（E） 流式细胞术分析表明，与野生型对照组（顶部面板）相比，引用2Δ/ΔLSK细胞（底部面板）显示Flt3显著降低−CD34型−或CD48−CD150型+分数，对应于LT-HSC。WT和突变小鼠来自同一窝，并且独立进行至少两次实验。林中的数字−-门控图指示总BM单核细胞的百分比，而LSK门控图中的数字指示门控群体内的百分比。（F） LT-HSCs（CD48）的百分比−CD150型+或Flt3−CD34型−)、短期HSC（Flt3−CD34型+)和多能祖细胞（Flt3+CD34型+)LSK细胞中显示为平均值±SEM（n=4）。
图2
图2
Cited2缺陷导致HSC凋亡升高。（A） 细胞凋亡代表图（annexin V+DAPI公司−)在LSK（顶部面板）和CD34内−LSK（底部面板）分数。（B） 凋亡细胞的汇总数据显示为平均值±SEM（n=4）。（C） 的相对表达式彪马在LSK细胞中（平均值±SEM，n=4）。WT表示野生型。
图3
图3
引文2缺陷导致HSC停止。（A-C）Hoechst 33342和派罗宁Y染色。分析G处的细胞比例0pI-pC治疗4周后处死小鼠，并使用DNA染料Hoechst 33342和RNA染料pyronin Y结合细胞表面标记物对BM细胞进行染色。（A） 门控LSK（顶面板）或CD34内的细胞周期代表图−LSK（底部面板）。（B） WT（n=8）或引用2Δ/Δ（n=7）只小鼠。（C） CD34中静止细胞的汇总数据−LSK人群（n=4）。（D-E）BrdU染色。野生型和引用2Δ/Δ通过IP注射给予小鼠BrdU，48小时后处死小鼠，以测量LSK细胞内BrdU掺入量。（D） 流式细胞仪分析的代表图。（E） BrdU汇总数据+LSK细胞（n=6）。
图4
图4
引用2缺陷导致HSC重建能力下降。（A） 在5-FU治疗后的第0、4、8、12和16天，在WT和引用2Δ/Δ小鼠（n=8）。（B） 监测存活时间至少18天。总生存时间引用2Δ/Δ小鼠显著短于对照组（n=8）。（C） 供体或衍生B细胞的绝对数量（B220+)，髓细胞（Mac-1+或Gr-1+)和T细胞（CD3+)非竞争性移植16周后PB（平均值±SEM，n=6）。（D） 竞争性移植后16周受者PB嵌合（平均值±SEM，n=4）。
图5
图5
删除HIF-1型α部分恢复因Cited2缺乏引起的受损HSC静止。（A） LT-HSC的百分比（CD48−CD150型+通过FACS分析确定LSK细胞中的LSKs）。（B） 膜联蛋白V的百分比+DAPI公司−LSK细胞和CD34内的细胞−LSK细胞。（C） 相对mRNA水平彪马在LSK细胞中。（D） G中LSK细胞的百分比0（E）CD34的百分比−G中的LSK细胞0（F）BrdU的百分比+LSK细胞。所有数据均显示为平均值±SEM（n=4）。WT表示野生型。
图6
图6
删除HIF-1型α部分地挽救了因Cited2缺陷导致的受损HSC重建能力。（A-B）5-FU治疗。（A） 5-FU给药后指定时间的WBC计数（n＝10）。（B） 5-FU给药后小鼠的存活率（n=10）。与对照组相比，双敲除小鼠的存活率显著提高引用2-基因敲除小鼠(P（P）< .01). （C-E）移植实验。（C） 供体或衍生B细胞的绝对数量（B220+)，髓细胞（Mac-1+或Gr-1+)和T细胞（CD3+)非竞争性移植后16周，PB中（平均值±SEM，n=5）。（D） 竞争性移植后8周、12周和16周受者的PB嵌合体（n=6）。（E） 竞争性移植16周后受者骨髓嵌合。数据显示为平均值±SEM（n=6）。WT表示野生型。
图7
图7
Cited2缺乏影响HSC静止相关基因的表达。（A） 通过实时PCR进行基因表达分析。CD34型−对LSK细胞进行分类，从每个基因型中提取RNA。通过3或4个独立实验重复分析。每个基因型在每个实验中使用两只小鼠。数据显示为与WT对照组相比的相对表达（平均值±SEM）。（B-C）HIF-1α和HDAC1与赫斯1发起人。（B） 的相对表达式赫斯1在用DFO（100μM）处理的EML C1细胞中，加入或不加入亚甲酰苯胺羟肟酸（2μM）。（C） 用抗HIF-1α、抗HDAC1和IgG Abs对EML C1细胞进行ChIP检测。沉淀的DNA经过定量实时PCR，引物扩增nt−235 to−1的赫斯1发起人。（D-E）Cited2和Smad2/3被招募到埃及1发起人。（D） 的相对表达式埃及1用TGF-β1（7.5 ng/mL）处理饥饿的EML C1细胞达指定时间。（E） 用TGF-β1处理饥饿的EML C1细胞1小时，并用抗Smad2/3、抗Cited2和IgG Abs进行ChIP检测。沉淀的DNA通过引物扩增nt−2342至−1965进行实时定量PCR埃及1发起人。这些实验重复了3次*P（P）< .05; **P（P）< .01. NS表示不显著。
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