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.2011;6（6）：e21573。
doi:10.1371/journal.pone.0021573。 Epub 2011年6月24日。

厚朴酚抑制细胞周期，诱导细胞凋亡，并增强吉西他滨对人胰腺癌细胞的细胞毒性作用

苏米特·阿罗拉 1, 阿伦·巴德瓦吉, Sanjeev K Srivastava公司, 西玛·辛格, 史蒂文·麦克莱伦, 王斌, 阿杰·辛格
附属公司

厚朴酚抑制细胞周期，诱导细胞凋亡，增强吉西他滨对人胰腺癌细胞的细胞毒作用

苏米特·阿罗拉等。 公共科学图书馆一号. 2011.

摘要

胰腺癌患者的生存率极低，因为其无症状进展到晚期和转移阶段，而目前的治疗方法大多无效。因此，需要新的治疗药物和治疗方法来改善临床结果。在本研究中，我们测定了中药厚朴/广花的生物活性成分和厚朴酚单独或与标准化疗药物吉西他滨联合对两种胰腺癌细胞株MiaPaCa和Panc1的作用。厚朴酚通过引起细胞周期阻滞，对两种胰腺癌细胞株产生生长抑制作用₁ 细胞凋亡的分期和诱导。在分子水平上，和厚朴酚显著降低了细胞周期蛋白（D1和E）和细胞周期蛋白依赖性激酶（Cdk2和Cdk4）的表达，并导致Cdk抑制剂p21和p27的增加。此外，和厚朴酚治疗导致Bax/Bcl-2和Bax/Bcl-xL比率增加，有利于胰腺癌细胞的凋亡。这些变化伴随着NF-κB细胞质积累的增强，同时核分数也随之降低，NFκB应答启动子的转录活性降低。这与κBα抑制剂（IκB-α）磷酸化降低相关，导致其稳定，从而增加细胞水平。重要的是，和厚朴酚还通过限制吉西他滨诱导的NF-κB在治疗胰腺癌细胞系中的核累积，部分增强了吉西他宾的细胞毒性作用。总之，这些发现首次证明和厚朴酚对胰腺癌的生长抑制作用，并表明其作为一种新型天然药物在预防和治疗中的潜在用途。

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图1
图1。厚朴酚抑制人类胰腺癌细胞的生长。
(A类)MiaPaCa和Panc1细胞接种在6孔板（1×10）中5在和厚朴酚（10–60µM）处理48小时之前，使其达到70–80%的融合。处理后，在相控显微镜下观察到两种细胞类型的细胞形态发生了显著变化。细胞变圆、萎缩，并以剂量依赖的方式从细胞表面脱落。代表性显微照片来自用20、40或60µM和厚朴酚处理的细胞的任意视野之一（放大200倍）。(B类)MiaPaCa和Panc1细胞生长在96孔微孔板（1×10）中4细胞/孔），并用和厚朴酚（10–60µM）在70–80%汇合处处理。在24、48和72小时后，通过WST-1分析测定细胞的存活率。对照细胞的OD值（用等量的二甲基亚砜处理，最终浓度<0.1%）被视为100%的生存率。和厚朴酚以剂量和时间依赖的方式抑制这两种细胞类型的细胞活力，这表明和厚朴酚具有抗肿瘤作用。数据表示为平均值±SD；（n） = 3） 。
图2
图2。厚朴酚导致G1人胰腺癌细胞的细胞周期阻滞。
MiaPaCa和Panc1细胞（1×106细胞/孔）在无血清培养基中培养72小时，然后在含血清培养基培养24小时，然后用和厚朴酚（20、40或60µM）或二甲基亚砜（对照）处理24小时，从而实现同步化。用碘化丙啶（PI）分析细胞周期不同阶段的细胞分布流式细胞术后染色。G中MiaPaCa和Panc1细胞的积累增强1和厚朴酚以剂量依赖性的方式（如流直方图所示）治疗后观察到细胞周期的时相，同时S期细胞减少。
图3
图3。厚朴酚诱导人胰腺癌细胞凋亡。
MiaPaCa和Panc1细胞在6孔板（1×10）中生长6细胞/孔），并允许达到70-80%的汇合。用和厚朴酚（20、40或60µM）或二甲基亚砜（对照）处理细胞24小时，然后用7-AAD和PE Annexin V染色，然后用流式细胞术进行检测。每个面板的左下象限显示活细胞（PE Annexin V和7-AAD均为阴性）。右上象限包含坏死或晚期凋亡细胞（PE Annexin V和7-AAD均阳性）。右下象限代表早期凋亡细胞（PE Annexin V阳性和7-AAD阴性）。数据显示，与对照细胞相比，用和厚朴酚治疗后，MiaPaCa和Panc1细胞中的凋亡细胞数量均呈剂量依赖性增加，表明和厚朴醇具有诱导凋亡的潜力。
图4
图4。厚朴酚治疗导致人类胰腺癌细胞中细胞周期相关蛋白的表达改变。
用和厚朴酚（20、40或60µM）或二甲基亚砜（对照）处理胰腺癌细胞（MiaPaCa和Panc1）24小时。分离总蛋白，并对各种细胞周期相关蛋白（细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白E、Cdk2、Cdk4、p21和p27）进行免疫印迹分析。β-actin作为负荷对照。免疫反应带的强度通过密度计进行量化。标准化密度测定值显示在条带顶部，表明细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白E、Cdk2和Cdk4的表达呈剂量依赖性减少，而细胞周期蛋白抑制剂的表达则增加；p21和p27，暴露于和厚朴酚后，在这两种细胞类型中。
图5
图5。厚朴酚调节人胰腺癌细胞中的Bax/Bcl-2和Bax/Bcl-xL比率。
（A） MiaPaCa和Panc1细胞用和厚朴酚（20、40或60µM）或二甲基亚砜（对照）处理24小时。对Bcl-xl、Bcl-2和Bax蛋白进行免疫印迹，然后对免疫反应带进行密度测定。归一化密度测量值显示在波段顶部。（B） 条形图总结了和厚朴酚治疗对Bax/Bcl-2比率（上面板）和Bax/Bcl-xL比率（下面板）的影响。数据表明和厚朴酚通过上调促凋亡Bax蛋白和下调抗凋亡Bcl-2和Bcl-xL蛋白诱导凋亡。
图6
图6。厚朴酚通过抑制人胰腺癌细胞中NF-κB/p65的核移位来减弱构成性NF-κ的B活化。
（A） MiaPaCa和Panc1细胞（0.5×106细胞/孔）接种在12孔板中。第二天，在60%的汇合处，细胞与NF-κB荧光素酶报告子和TK-肾小球荧光素酶（对照）质粒共同转染。转染后24小时，用和厚朴酚（20、40或60µM）处理细胞24小时。制备蛋白裂解物，并使用双荧光素酶分析系统评估荧光素瘤酶（Fire-fly；test和Renilla，转染效率控制）活性。数据表示为荧光素酶活性的标准化折叠变化（平均值±SD；n = 3，*p<0.05）。（B） 从用和厚朴酚（20、40或60µM）处理6 h的细胞中制备总提取物、核提取物和细胞质提取物，并通过Western blot分析测定NF-κB/p65、p-IκB-α（S32/36）和IκBα的表达。β-actin作为负荷对照。免疫反应带的强度通过密度计进行量化。正常密度测定值显示在条带顶部，表明核内NF-κB/p65的定位降低，同时细胞质也随之增加。相反，p-IκB-α的表达降低，导致IκBα水平升高。总之，这些数据清楚地表明和厚朴酚通过稳定IκB-α抑制NF-κB活性。
图7
图7。厚朴酚化疗使胰腺癌细胞对吉西他滨治疗敏感。
(A类)MiaPaCa和Panc1细胞生长在96孔微孔板（1×10）中4细胞/孔）。在亚汇合处，用吉西他滨（1.25–40µM）单独或与和厚朴酚（10或20µM。数据以未经处理或仅用和厚朴酚处理的细胞的相对存活率表示，以控制和厚朴醇的生长抑制作用（平均值±SD；n = 3.*，p<0.05）。IC显著下降50在与和厚朴酚共同作用的细胞中观察吉西他滨的价值。(B类)用吉西他滨（5、10和20µM）处理细胞6 h，通过Western blot分析测定核、细胞质和总细胞裂解物中NF-κB/p65的表达。吉西他滨对细胞的治疗以剂量依赖性的方式导致NF-κB/p65的核累积增强(C类)从吉西他滨（10µM）、和厚朴酚（20µM，honokiol）单独或联合处理6 h的细胞中制备细胞核和细胞质提取物。通过Western blot分析测定核、细胞质和总细胞裂解液中NF-κB/p65的表达。数据显示，和厚朴酚联合治疗限制了吉西他滨诱导的NF-κB/p65核积聚。总之，这些发现表明和厚朴酚作为一种化学增敏剂，增加了吉西他滨对胰腺癌的细胞毒性作用。
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