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.2009年5月；37(9):3110-23.
doi:10.1093/nar/gkp136。 Epub 2009年4月1日。

CK1delta通过AIB1以雌激素依赖的方式调节ERalpha的转录活性，并调节ERala-AIB1的相互作用

乔治·贾马斯 1, 莱安德罗·卡斯特拉诺, 秦峰, Uwe Knippschild公司, 吉米·雅各布, 罗斯·S·托马斯, 查尔斯·库姆斯, 卡罗琳·史密斯, 龙R角, 贾斯汀·斯特宾
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CK1delta通过AIB1以雌激素依赖的方式调节ERalpha的转录活性，并调节ERala-AIB1的相互作用

乔治·贾马斯等。 核酸研究. 2009年5月.

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摘要

乳腺癌的肿瘤发生通常需要核受体辅活化因子AIB1/SRC-3与雌激素受体α（ERalpha）联合作用的过度表达。ERalpha和AIB1的磷酸化对其功能有着深远的影响。此外，蛋白酶体介导的降解通过调节其稳定性和活性发挥重要作用。CK1delta是普遍存在的酪蛋白激酶-1家族的成员，与乳腺癌的进展有关。在本研究中，我们发现ERalpha和AIB1都是体外CK1delta的底物，并确定了一个新的由CK1delta-靶向的AIB1磷酸化位点（S601），对AIB1的协同激活功能具有重要意义。CK1delta能够在体内与ERalpha和AIB1相互作用，而细胞裂解物的联合免疫沉淀分析证实，乳腺癌细胞中CK1delta的过度表达会导致ERalpha与AIB1的相关性增加。使用基于siRNA的方法、荧光素酶报告子分析和qRT-PCR，我们观察到CK1delta沉默导致ERalpha转录活性降低，尽管ERalpha-水平增加，与蛋白酶体抑制类似。我们提供证据表明，CK1delta沉默以雌二醇依赖的方式降低AIB1蛋白水平；通过蛋白酶体抑制剂MG132的预处理可以抑制这种失稳。我们认为，由于ERalpha和AIB1与CK1delta的相互作用和磷酸化作用，特别是AIB1的稳定作用，它们所采用的不同活性会影响ERalpha1的转录活性，因此在乳腺癌的发展中发挥作用。

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图1。
图1。
CK1δ沉默降低ERα的转录活性并下调E2诱导的ERα靶基因的表达。(A类)MELN细胞（5 × 104)在含有10%剥离DSS的无酚红DMEM中，在24孔板中进行电镀。细胞转染5 nM干扰siRNA（CT siRNA）或5 nM CK1δsiRNA用于48 h并与E2（10）孵育或不孵育 nM）24 h.通过测量荧光素酶活性来量化ERE依赖性基因的表达，作为对照的倍数。误差条表示两个实验的SD。(B类)定量实时RT-PCR验证5 nM siRNA.MCF7细胞（2 × 105)在含有10%DSS的无酚红DMEM中用6孔板电镀。细胞转染5 nM CT siRNA或与5 nM siRNA靶向CK1δ并用E2（10）处理或不处理（载体） nM）24 h.收集细胞，提取总RNA，并通过逆转录合成cDNA，如“材料和方法”一节所述。基因表达(C类)pS2和(D类)通过实时定量RT-PCR测定PR。MCF-7细胞（2 × 105)在含有10%DSS的无酚红DMEM中用6孔板电镀。随后，将细胞培养24小时 用1μM CK1δ/ϵ特异性抑制剂IC261处理h，并用E2（10）处理或不处理（载体） nM）24小时 h.收集细胞，提取总RNA，并通过逆转录合成cDNA，如“材料和方法”一节所述。基因表达(E类)pS2和(F类)通过实时定量RT-PCR测定PR。用（EYFP）-CK1δ质粒转染MCF7细胞后，细胞凋亡增加(G公司)pS2表达。GAPDH用于归一化。误差条代表两个单独实验的SD，每个实验一式三份；在这些实验中观察到的变化具有统计学意义(P（P） < 0.05).
图2。
图2。
CK1δ在S118不磷酸化ERα。(A类)MCF7细胞（2 × 105)在含有10%DSS的无酚红DMEM中用6孔板电镀。未转染细胞或转染5 nM CT siRNA或5 nM CK1δsiRNA用于72 h和E2（100）处理或不处理 nM）45 分钟。收集细胞，进行裂解，并使用所示抗体对等量的蛋白质进行Western blotting分析。β-actin作为样品装载的对照。免疫印迹显示CK1δ沉默。(B类)定量分析ERαpS118、ERα蛋白水平和pS118:ERα比值，作为对照的倍数。(C类)Western blotting检测稳定转染的Hela-ERα细胞系中ERα表达水平。(D类)未转染或转染5 nM CT siRNA或与5 nM CK1δsiRNA用于72 h是否接受E2治疗（100 nM）45 分钟。免疫印迹细胞提取物。(E类)ERα磷酸-S118的定量分析作为对照倍数。所有数据都代表了两个独立实验的结果。误差条代表两个单独实验的SD，一式三份。
图3。
图3。
CK1δ沉默使ERα蛋白水平稳定。(A类)MCF7或(C类)T47D细胞未经转染或转染5 nM CK1δsiRNA用于72 h.MG132（5 μM）添加6 用E2（100）处理h和随后的细胞 nM）45 分钟。免疫印迹细胞提取物。免疫印迹显示CK1δ沉默。E2存在下MG132预处理前后ERα蛋白水平的定量分析(B类)MCF7或(D类)T47D细胞。所有数据都代表了两个独立实验的结果。误差条代表两个单独实验的SD，一式三份。
图4。
图4。
CK1δ沉默降低E2存在时AIB1蛋白水平。(A类)MCF7细胞（2 × 105)在含有10%DSS的无酚红DMEM中用6孔板电镀。未转染细胞或转染5 nM CT siRNA或5 nM CK1δsiRNA用于72 h和E2（100）处理或不处理 nM）45 分钟。收集细胞，裂解，并使用特定的AIB1小鼠单克隆抗体对等量的蛋白质进行免疫印迹。使用β-肌动蛋白特异性单克隆抗体对样品进行等量检测。(B类)AIB1蛋白水平的定量分析作为对照的倍数给出。(C类)未转染MCF7细胞或转染5 nM CT siRNA或5 nM CK1δsiRNA用于72 h.如有指示，用MG132（5μM）培养细胞6 h，然后用E2（100 nM）45 用AIB1抗体对细胞提取物进行免疫印迹。(D类)在E2存在的情况下，使用或不使用MG132预处理对AIB1蛋白水平进行定量分析。所有数据都是两个独立实验的代表性结果。(E类)对未转染的MCF7细胞或转染5 nM CK1δsiRNA用于72 h，然后添加E2（100 nM）45 分钟。所有细胞都生长在盖玻片上，然后按照“材料和方法”一节中的描述进行固定和染色。
图5。
图5。
CK1δ与ERα和AIB1相关体内并调节其相互作用。(A类)用CK1δ或非免疫IgG免疫沉淀未经处理或E2刺激的COS-1细胞的裂解液，然后用抗ERα、抗pS118/ERα和抗AIB1免疫印迹。(B类)MCF7细胞（i）未转染或（ii）转染（EYFP）-CK1δ质粒，用100 nM E2用于30 用抗AIB1抗体沉淀前min。使用抗ERα抗体通过免疫印迹法观察AIB1和ERα之间的相互作用。在两条通道中添加了等量的蛋白质。
图6。
图6。
CK1δ磷酸化ERα和AIB1在体外. (A类)人类ERα的示意图。AF：激活器功能。(B类)体外使用纯化的重组人CK1δ作为酶源，并以：（i）全长重组人ERα，（ii）GST-重组人ERβ（aa 1–280）和（iii）GST重组人ERγ（aa 283–595）为底物进行激酶分析。(C类)人类AIB1及其已知功能域的示意图。βHLS/PAS：基本helix-loop-helix/Per-Arnt-Sim域；RID：受体相互作用域；CID:CBP/p300交互域；HAT：组蛋白乙酰转移酶结构域。指出了所有已鉴定的磷酸化氨基酸的位置。(D类)体外使用重组人CK1δ作为酶源和底物进行激酶分析：（i）纯化全长AIB1和（ii）GST-重组人AIB1（aa 582-800）。(E类)CK1磷酸化AIB1的一个主要残基。GST–AIB1 aa 582–800被磷酸化在体外通过CK1催化亚基达到指定的时间。高达1.6 将mol磷酸盐/mol蛋白并入GST–AIB1 aa 582–800融合蛋白。(F类)通过CK1δ实现GST-AIB1融合蛋白的磷酸化。体外激酶分析使用重组人CK1δ作为酶源，并且：（i）GST–AIB1 aa 582-800（wt），（ii）GST-AIB1 aa582-800。蛋白质通过SDS-PAGE分离，磷酸化蛋白质通过放射自显影检测。通过切伦科夫计数测定磷酸化蛋白的磷酸盐掺入定量。误差条代表两个实验的SD，每个实验一式三份。C： 库马西。A： 自动放射自显影。
图7。
图7。
S601的CK1δ依赖性磷酸化在ERα依赖性转录中的功能作用。MCF7细胞（2 × 105)在含有10%DSS的无酚红DMEM中用6孔板电镀。(A类)细胞与1μg的：（i）pCMV-Flag-AIB1和（EYFP）–CK1δ质粒或 小时(B类)细胞转染1μg：（i）pCMV-Flag-AIB1和（ii）pCMV-Flag-AIBM1/S601A质粒 h、 然后用1进行治疗 3的μM IC261 h.随后，用E2（10）处理或不处理所有细胞（载体） nM）24 h.收集细胞，提取总RNA，并通过逆转录合成cDNA，如“材料和方法”一节所述。用qRT-PCR检测pS2的基因表达。误差条代表两个单独实验的SD，每个实验一式三份(P（P） < 0.05).
图8。
图8。
ERα转录活性调控模型，涉及CK1δ和AIB1。在E2存在下，CK1δ主要在S601和其他位点与AIB1相互作用并磷酸化，可能在它们之间形成一个复合物，这是ERα完整转录活性所必需的。抑制CK1δ介导的磷酸化，可能改变AIB1的构象并促进其蛋白酶体介导的降解；随后，ERα蛋白水平稳定，ERα活性降低。
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