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.2009年1月15日；15(2):532-42.
doi:10.1158/1078-0432.CCR-08-1733。

Delta-crystallin增强子结合因子1控制人头颈鳞癌细胞系上皮-间充质转化表型和对表皮生长因子受体抑制剂埃洛替尼的耐药性

亚斯敏·哈达德 1, 崔顺勇, 大卫·J·麦康基
附属公司

Delta-crystallin增强子结合因子1控制人头颈鳞癌细胞系上皮-间充质转化表型和对表皮生长因子受体抑制剂埃洛替尼的耐药性

亚斯敏·哈达德等。 临床癌症研究. .

摘要

目的：虽然表皮生长因子受体（EGFR）在大多数头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）中过度表达，但只有少数患者从EGFR抑制剂中获得实质性临床益处。我们启动了本研究，以确定HNSCC细胞株中埃洛替尼耐药的机制。

方法：我们使用[（3）H]胸腺嘧啶核苷掺入法来表征一组27人HNSCC细胞对厄洛替尼介导的生长抑制反应的异质性。我们使用六种埃洛替尼敏感和埃洛替尼耐药性HNSCC株的代表性子集来表征与耐药性相关的分子机制。

结果：埃洛替尼对HNSCC细胞DNA合成具有异质性影响，与上皮-间充质转化（EMT）的分子标记密切相关。具体来说，药物敏感株表达高水平的E-cadherin，并且显示出有限的侵袭和迁移能力。相反，厄洛替尼耐药的HNSCC株表达高水平的E-钙粘蛋白阻遏物δ-晶体增强子结合因子1（deltaEF1；Zeb-1）和其他间充质标记物，以及低水平的E-cadherin，并且具有高度侵袭性和迁移性。在埃洛替尼耐药细胞系（1386LN和UMSCC1）中，小干扰RNA介导的deltaEF1敲除导致E-cadherin上调，并以E-cadherin-dependent的方式增加埃洛替尼敏感性。

结论：DeltaEF1控制间充质表型并驱动HNSCC细胞中的厄洛替尼耐药性。E-钙粘蛋白和deltaEF1可能被证明是预测EGFR抑制剂反应性的有用标志物。

PubMed免责声明

数字

图1
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厄洛替尼对27株HNSCC细胞株的异质性生长抑制作用。在1μM厄洛替尼浓度下显示50%以上生长抑制的细胞被任意归类为“敏感”细胞，在1μM厄洛替尼浓度下生长抑制低于50%的细胞被鉴定为耐药细胞。
图2
图2
厄洛替尼对HNSCC细胞株（p27，EGFR和p-EGFR）表达的影响。答：。Western blot分析显示，暴露于1μM erlotinb 24h后，三个敏感细胞系（TU138、MDA183和TU358B）中的p27上调。而三种耐药细胞系（MDA1386LN、UMSCC1和TU167LN）在暴露于1μM厄洛替尼24小时后，p27表达水平没有变化。肌动蛋白的表达显示为负载对照。B。厄洛替尼敏感和厄洛替尼耐药细胞系的基线状态（EGFR和p-EGFR）。注意，厄洛替尼抑制了所有厄洛替尼敏感细胞系中EGFR的基线磷酸化，但对厄洛替宁耐药细胞系中的EGFR基线磷酸化没有影响。
图2
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厄洛替尼对HNSCC细胞株（p27，EGFR和p-EGFR）表达的影响。答：。Western blot分析显示，暴露于1μM erlotinb 24h后，三个敏感细胞系（TU138、MDA183和TU358B）中的p27上调。而三种耐药细胞系（MDA1386LN、UMSCC1和TU167LN）在暴露于1μM厄洛替尼24小时后，p27表达水平没有变化。肌动蛋白的表达显示为一种负载控制。B。厄洛替尼敏感和厄洛替尼耐药细胞系的基线状态（EGFR和p-EGFR）。注意，厄洛替尼抑制了所有厄洛替尼敏感细胞系中EGFR的基线磷酸化，但对厄洛替宁耐药细胞系中的EGFR基线磷酸化没有影响。
图3
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EMT标记物在HNSCC细胞中的表达。实时定量RT-PCR检测E-cadherin、vimentin、fibronectin和DeltaEF1的mRNA表达水平，免疫印迹法检测蛋白表达。肌动蛋白的表达显示为一种负载控制。答：。E-cadherin表达。B。波形蛋白表达。C、。纤维连接蛋白表达。D。DeltaEF1表达式。层粘连蛋白B的表达显示为HNSCC细胞系中细胞核部分的负荷控制。
图3
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EMT标记物在HNSCC细胞中的表达。通过定量实时RT-PCR测量E-钙粘蛋白、波形蛋白、纤连蛋白和DeltaEF1的mRNA表达水平，并通过免疫印迹测量蛋白质表达。肌动蛋白的表达显示为负载对照。答：。E-cadherin表达。B。波形蛋白表达。C、。纤维连接蛋白表达。D。DeltaEF1表达式。层粘连蛋白B的表达显示为HNSCC细胞系中细胞核部分的负荷控制。
图3
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EMT标记物在HNSCC细胞中的表达。实时定量RT-PCR检测E-cadherin、vimentin、fibronectin和DeltaEF1的mRNA表达水平，免疫印迹法检测蛋白表达。肌动蛋白的表达显示为负载对照。答：。E-cadherin表达。B。波形蛋白表达。C、。纤维连接蛋白表达。D。DeltaEF1表达式。层粘连蛋白B的表达显示为HNSCC细胞系中细胞核部分的负荷控制。
图3
图3
EMT标记物在HNSCC细胞中的表达。实时定量RT-PCR检测E-cadherin、vimentin、fibronectin和DeltaEF1的mRNA表达水平，免疫印迹法检测蛋白表达。肌动蛋白的表达显示为一种负载控制。答：。E-cadherin表达。B。波形蛋白表达。C、。纤维连接蛋白表达。D。DeltaEF1表达式。层粘连蛋白B的表达显示为HNSCC细胞系中细胞核部分的负荷控制。
图4
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耐药与敏感HNSCC细胞系的伤口愈合和侵袭试验。答：。伤口愈合分析。按照材料和方法进行分析。注意，24小时暴露于1μM埃洛替尼对耐药细胞株的迁移率没有影响，但显著降低了敏感细胞株的转移率。B。侵入分析。按照材料和方法中的说明进行改良的Boyden室分析。注意，厄洛替尼对抗性系的入侵没有影响，但对敏感系的入侵有显著降低。
图4
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耐药与敏感HNSCC细胞系的伤口愈合和侵袭试验。答：。伤口愈合分析。按照材料和方法进行分析。注意，24小时暴露于1μM埃洛替尼对耐药细胞株的迁移率没有影响，但显著降低了敏感细胞株的转移率。B。侵入分析。按照材料和方法中的说明进行改良的Boyden室分析。注意，厄洛替尼对抗性系的入侵没有影响，但对敏感系的入侵有显著降低。
图4
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耐药与敏感HNSCC细胞系的伤口愈合和侵袭试验。答：。伤口愈合试验。按照材料和方法进行分析。注意，24小时暴露于1μM埃洛替尼对耐药细胞株的迁移率没有影响，但显著降低了敏感细胞株的转移率。B。侵入分析。按照材料和方法中的说明进行改良的Boyden室分析。注意，厄洛替尼对抗性系的入侵没有影响，但对敏感系的入侵有显著降低。
图4
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耐药与敏感HNSCC细胞系的伤口愈合和侵袭试验。答：。伤口愈合分析。按照材料和方法进行分析。注意，24小时暴露于1μM埃洛替尼对耐药细胞株的迁移率没有影响，但显著降低了敏感细胞株的转移率。B。侵入分析。按照材料和方法中的说明进行改良的Boyden室分析。注意，厄洛替尼对抗性系的入侵没有影响，但对敏感系的入侵有显著降低。
图5
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DeltaEF1维持HNSCC细胞的间充质表型。答：。沉默δEF1对（1386LN，UMSCC1）细胞系中δEF1和E-cadherin mRNA水平的影响。按照材料和方法中的描述进行沉默和实时PCR。此外，对1386LN细胞株进行了免疫印迹。肌动蛋白的表达作为负荷控制。B。沉默deltaEF1与或不沉默E-cadherin对埃洛替尼敏感性的影响。三H-胸腺嘧啶核苷掺入试验用于测量厄洛替尼对（1386LN，UMSCC1）细胞DNA合成的影响。请注意，deltaEF1敲除恢复了对药物的敏感性，这些作用通过联合沉默deltaEF 1和E-cadherin而被逆转。C、。deltaEF1敲低对细胞迁移的影响。用靶向deltaEF1的siRNA或脱靶对照转染1386LN细胞48小时，并如材料和方法中所述进行伤口愈合测定。注意，沉默会减少迁移，而接触1μM埃洛替尼会进一步减少迁移。D。击倒对入侵的影响。用靶向deltaEF1或非靶向对照的siRNAs转染1386LN细胞，然后在改良的Boyden室中进行分析，如材料和方法所述。注意，在侵袭和迁移试验中观察到沉默和厄洛替尼的类似作用。
图5
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DeltaEF1维持HNSCC细胞的间充质表型。答：。沉默δEF1对（1386LN，UMSCC1）细胞系中δEF1和E-cadherin mRNA水平的影响。按照材料和方法中的描述进行沉默和实时PCR。此外，在1386LN细胞系中进行了免疫印迹。肌动蛋白的表达作为负荷控制。B。沉默deltaEF1与或不沉默E-cadherin对埃洛替尼敏感性的影响。三H-胸腺嘧啶核苷掺入试验用于测量厄洛替尼对（1386LN，UMSCC1）细胞DNA合成的影响。请注意，deltaEF1敲除恢复了对药物的敏感性，这些作用通过联合沉默deltaEF 1和E-cadherin而被逆转。C、。deltaEF1敲除对细胞迁移的影响。用靶向deltaEF1或非靶向对照的siRNAs转染1386LN细胞48小时，并按照材料和方法中的描述进行伤口愈合试验。注意，沉默会减少迁移，而接触1μM埃洛替尼会进一步减少迁移。D。击倒对入侵的影响。用靶向deltaEF1或非靶向对照的siRNAs转染1386LN细胞，然后在改良的Boyden室中进行分析，如材料和方法所述。注意，在侵袭和迁移试验中观察到沉默和厄洛替尼的类似作用。
图5
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DeltaEF1维持HNSCC细胞的间充质表型。答：。沉默δEF1对（1386LN，UMSCC1）细胞系中δEF1和E-cadherin mRNA水平的影响。按照材料和方法中的描述进行沉默和实时PCR。此外，对1386LN细胞株进行了免疫印迹。肌动蛋白的表达作为负荷控制。B。沉默deltaEF1与或不沉默E-cadherin对埃洛替尼敏感性的影响。三H-胸腺嘧啶核苷掺入试验用于测量厄洛替尼对（1386LN，UMSCC1）细胞DNA合成的影响。请注意，deltaEF1敲除恢复了对药物的敏感性，这些作用通过联合沉默deltaEF 1和E-cadherin而被逆转。C、。deltaEF1敲除对细胞迁移的影响。用靶向deltaEF1或非靶向对照的siRNAs转染1386LN细胞48小时，并按照材料和方法中的描述进行伤口愈合试验。注意，沉默会减少迁移，而接触1μM埃洛替尼会进一步减少迁移。D。击倒对入侵的影响。用靶向deltaEF1的siRNA或脱靶对照转染1386LN细胞，然后如材料和方法中所述在改良的Boyden室中进行分析。注意，在入侵和迁移测定中观察到沉默和埃洛替尼的类似效果。
图5
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DeltaEF1维持HNSCC细胞的间充质表型。答：。沉默δEF1对（1386LN，UMSCC1）细胞系中δEF1和E-cadherin mRNA水平的影响。按照材料和方法中的描述进行沉默和实时PCR。此外，对1386LN细胞株进行了免疫印迹。肌动蛋白的表达作为负荷控制。B。沉默deltaEF1与或不沉默E-cadherin对埃洛替尼敏感性的影响。三H-胸腺嘧啶核苷掺入试验用于测量厄洛替尼对（1386LN，UMSCC1）细胞DNA合成的影响。注意，deltaEF1敲低恢复了对药物的敏感性，并且通过deltaEF1和E-钙粘蛋白的联合沉默来逆转这些作用。C、。deltaEF1敲除对细胞迁移的影响。用靶向deltaEF1或非靶向对照的siRNAs转染1386LN细胞48小时，并按照材料和方法中的描述进行伤口愈合试验。注意，沉默会减少迁移，而接触1μM埃洛替尼会进一步减少迁移。D。击倒对入侵的影响。用靶向deltaEF1或非靶向对照的siRNAs转染1386LN细胞，然后在改良的Boyden室中进行分析，如材料和方法所述。注意，在侵袭和迁移试验中观察到沉默和厄洛替尼的类似作用。
图6
图6
在埃洛替尼耐药细胞中，DeltaEF1与E-cadherin启动子相互作用。使用抗deltaEF1抗体和设计用于扩增E-cadherin启动子中包含E-box的区域的引物进行染色质免疫沉淀分析。注意，deltaEF1在所有测试的埃洛替尼耐药株中与E-cadherin启动子相互作用，但在埃洛替尼敏感性细胞中与启动子不相互作用。还应注意，在这些分析中，染色质上未检测到E-cadherin启动子活性和EMT（蜗牛，Zeb-2）的其他候选调节物。
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