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.2009年5月1日；124（9）：2200-9。
doi:10.1002/ijc.24160。

丹酚酸B通过环氧合酶-2和凋亡途径在体内外抑制头颈部鳞癌的生长

郝玉斌 1, 谢天培, 亚历山德鲁·科洛特科夫, 周燕飞, 庞晓武, 梁山, 《红光记》, 拉贾戈帕兰·斯里达尔, 王保罗, 约瑟夫·卡利法诺, 顾新斌
附属公司

丹酚酸B通过环氧合酶-2和凋亡途径在体内外抑制头颈部鳞癌的生长

郝玉斌等。 国际癌症杂志. .

摘要

口腔黏膜中环氧合酶-2（COX-2）的过度表达与头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）的风险增加有关。塞来昔布是一种非甾体抗炎药，可抑制COX-2，但不抑制COX-1。这种选择性COX-2抑制剂有望成为癌症预防剂。由于担心塞来昔布的心脏毒性，限制了其在长期化学预防和治疗中的应用。丹参酚酸B（Sal-B）是丹参的主要生物活性成分，在中国用于治疗肿瘤和慢性炎症疾病。本研究的目的是研究Sal-B抑制HNSCC生长的机制。通过溶剂萃取和两个色谱步骤从丹参中分离出Sal-B。通过评估COX-2表达、细胞活力和caspase依赖性凋亡，评估Sal-B在HNSCC和其他细胞系中的药理活性。Sal-B抑制HNSCC JHU-022和JHU-013细胞的生长，IC（50）分别为18和50 microM。用Sal-B（80 mg/kg/天）或塞来昔布（5 mg/kg/日）治疗患有HNSCC实体瘤异种移植物的裸鼠25天，以研究COX-2抑制剂的体内效应。Sal-B治疗组的肿瘤体积显著低于塞来昔布治疗组或未治疗对照组（p<0.05）。Sal-B抑制培养的HNSCC细胞和从肿瘤异种移植物分离的HNSSC细胞中COX-2的表达。无论有无脂多糖刺激，Sal-B也会导致前列腺素E（2）合成的剂量依赖性抑制。综上所述，Sal-B有望成为预防和治疗HNSCC的COX-2靶向抗癌药物。

PubMed免责声明

数字

图1
图1。Sal-B通过第二步色谱后的HPLC图谱
通过C-18色谱柱，Sal-B峰位于10.2分钟的保留时间。
图2
图2。Sal-B对HNSCC细胞生长的细胞毒性在体外
一个用125µM Sal-B处理13个不同的细胞株24小时，用MTT法测定细胞活力。与未经处理的平行细胞相比，对细胞活力的抑制百分比（除HL-60和JHU-019细胞系外，大多数细胞系的抑制百分比均p<0.05）。B类将OKF-6、JHU-013和JHU-022细胞系用1.25-125µM的Sal-B处理24小时，然后在无Sal-B的条件下继续培养7天。用集落形成法测定细胞活力。C类将JHU-013或JHU-022细胞暴露于相同最终浓度的Sal-B（125µM）下，使用纯度为40%至95%的不同Sal-B储备溶液，持续24小时。D类将JHU-013细胞暴露于相同量（100µg/ml）的Sal-B批次粉末中24小时，粉末纯度为40%至95%。所有分析均表示两个独立实验的平均值±标准偏差（使用三份培养皿）。
图2
图2。Sal-B对HNSCC细胞生长的细胞毒性在体外
一个用125µM Sal-B处理13个不同的细胞株24小时，用MTT法测定细胞活力。与未经处理的平行细胞相比，对细胞活力的抑制百分比（除HL-60和JHU-019细胞系外，大多数细胞系的抑制百分比均p<0.05）。B类将OKF-6、JHU-013和JHU-022细胞系用1.25-125µM的Sal-B处理24小时，然后在无Sal-B的条件下继续培养7天。用集落形成法测定细胞活力。C类，将JHU-013或JHU-022细胞暴露于相同终浓度的Sal-B（125µM）下24小时，使用纯度在40%至95%之间的不同Sal-B储备溶液。D类将JHU-013细胞暴露于相同量（100µg/ml）的Sal-B批次粉末中24小时，粉末纯度为40%至95%。所有分析均表示两个独立实验的平均值±标准偏差（使用三份培养皿）。
图2
图2。Sal-B对HNSCC细胞生长的细胞毒性在体外
一个用125µM Sal-B处理13个不同的细胞株24小时，用MTT法测定细胞活力。与未经处理的平行细胞相比，对细胞活力的抑制百分比（除HL-60和JHU-019细胞系外，大多数细胞系的抑制百分比均p<0.05）。B类将OKF-6、JHU-013和JHU-022细胞系用1.25-125µM的Sal-B处理24小时，然后在无Sal-B的条件下继续培养7天。用集落形成法测定细胞活力。C类将JHU-013或JHU-022细胞暴露于相同最终浓度的Sal-B（125µM）下，使用纯度为40%至95%的不同Sal-B储备溶液，持续24小时。D类将JHU-013细胞暴露于相同量（100µg/ml）的Sal-B批次粉末中24小时，粉末纯度为40%至95%。所有分析均表示两个独立实验的平均值±标准偏差（使用三份培养皿）。
图2
图2。Sal-B对HNSCC细胞生长的细胞毒性在体外
一个用125µM Sal-B处理13个不同的细胞株24小时，用MTT法测定细胞活力。与未经处理的平行细胞相比，对细胞活力的抑制百分比（除HL-60和JHU-019细胞系外，大多数细胞系的抑制百分比均p<0.05）。B类，OKF-6、JHU-013和JHU-022细胞系用1.25至125µM的Sal-B处理24小时，然后在无Sal-B的条件下继续培养7天。用集落形成法测定细胞活力。C类将JHU-013或JHU-022细胞暴露于相同最终浓度的Sal-B（125µM）下，使用纯度为40%至95%的不同Sal-B储备溶液，持续24小时。D类将JHU-013细胞暴露于相同量（100µg/ml）的Sal-B批次粉末中24小时，粉末纯度为40%至95%。所有分析均表示两个独立实验的平均值±标准偏差（使用三份培养皿）。
图3
图3。Sal-B对HNSCC细胞生长的细胞毒性体内
一个，中空纤维分析。从纤维植入后第三天开始，通过腹腔注射5-FU（80 mg/kg/天）或不同剂量的Sal-B（20 mg、40 mg、80 mg/kg/天）对小鼠进行治疗，每天持续治疗四天。在五天的处理期后，从小鼠的皮下部位取出带细胞的纤维，并通过MTT法测量细胞活力。将治疗组和未治疗对照组的细胞活力水平进行比较（*=P<0.05）。B类，JHU-013异种移植生长。DS-Red JHU-013细胞接种日为实验开始日。小鼠在注射JHU-013细胞后每天腹腔注射Sal-B（80 mg/kg）或塞来昔布（5 mg/kg），并在第25天处死所有小鼠。顶部面板显示了肿瘤的生长情况，在25天的实验期间，在不同的日子里定期监测肿瘤的生长。底部面板显示了在通过手术切除小鼠肿瘤组织后的最后一天测量的肿瘤质量（g）。每组的平均肿瘤质量用粗体条表示。与未治疗组比较P值。C类，右上面板显示了在实验第14天和第22天从同一只老鼠上拍摄的MR图像。圆圈表示肿瘤部位、右侧肿瘤（RT）和左侧肿瘤（LT）。右下角显示w个用箭头指示有无肿瘤的动物图像。
图3
图3。Sal-B对HNSCC细胞生长的细胞毒性体内
一个，中空纤维分析。从纤维植入后第三天开始，通过腹腔注射5-FU（80 mg/kg/天）或不同剂量的Sal-B（20 mg、40 mg、80 mg/kg/天）对小鼠进行治疗，每天持续治疗四天。在五天的治疗期后，从小鼠皮下取出含有细胞的纤维，用MTT法测定细胞活力。将治疗组和未治疗对照组的细胞活力水平进行比较（*=P<0.05）。B类，JHU-013异种移植生长。DS-Red JHU-013细胞接种日为实验开始日。小鼠在注射JHU-013细胞后每天腹腔注射Sal-B（80 mg/kg）或塞来昔布（5 mg/kg），并在第25天处死所有小鼠。顶部面板显示了肿瘤的生长情况，在25天的实验期间，在不同的日子里定期监测肿瘤的生长。底部面板显示了在通过手术切除小鼠肿瘤组织后的最后一天测量的肿瘤质量（g）。各组的平均肿瘤质量以粗体条表示。P值与未治疗组比较。C类，右上面板显示了在实验第14天和第22天从同一只老鼠上拍摄的MR图像。圆圈表示肿瘤部位、右侧肿瘤（RT）和左侧肿瘤（LT）。右下角显示w个用箭头指示有无肿瘤的动物图像。
图3
图3。Sal-B对HNSCC细胞生长的细胞毒性体内
一个，中空纤维分析。从纤维植入后第三天开始，通过腹腔注射5-FU（80 mg/kg/天）或不同剂量的Sal-B（20 mg、40 mg、80 mg/kg/天）对小鼠进行治疗，每天持续治疗四天。在五天的处理期后，从小鼠的皮下部位取出带细胞的纤维，并通过MTT法测量细胞活力。将治疗组和未治疗对照组的细胞活力水平进行比较（*=P<0.05）。B类，JHU-013异种移植生长。DS-Red JHU-013细胞接种日为实验开始日。小鼠在注射JHU-013细胞后每天腹腔注射Sal-B（80 mg/kg）或塞来昔布（5 mg/kg），并在第25天处死所有小鼠。顶部面板显示了肿瘤的生长情况，在25天的实验期间，在不同的日子里定期监测肿瘤的生长。底部面板显示了在通过手术切除小鼠肿瘤组织后的最后一天测量的肿瘤质量（g）。每组的平均肿瘤质量用粗体条表示。与未治疗组比较P值。C类，右上面板显示了在实验第14天和第22天从同一只老鼠上拍摄的MR图像。圆圈表示肿瘤部位、右侧肿瘤（RT）和左侧肿瘤（LT）。右下角显示w个用箭头指示有无肿瘤的动物图像。
图4
图4。Sal-B对PGE2合成的抑制作用
在一个和B类，t吨通过Western blot分析COX-2蛋白水平，并根据COX-2/β肌动蛋白相关强度进行半定量。一个六种HNSCC细胞系和一种非癌性人类口腔角质形成细胞系（OKF-6）中COX-2蛋白水平。B类经Sal-B（12.5和125µM）处理24小时的JHU-013细胞的COX-2蛋白水平。C类用Sal-B（125μM）或塞来昔布（10μM）处理JHU-013细胞24小时后，测定PGE2水平。PGE2水平表示为总细胞培养的pg/ml。结果代表了两个独立实验的平均值±SD（使用三个重复的培养皿）。与未治疗组比较P值。
图4
图4。Sal-B对PGE2合成的抑制作用
在一个和B类，t吨通过Western blot分析COX-2蛋白水平，并根据COX-2/β肌动蛋白相关强度进行半定量。一个，六种HNSCC细胞系和一种非癌性人类口腔角质形成细胞系（OKF-6）中COX-2蛋白水平。B类经Sal-B（12.5和125µM）处理24小时的JHU-013细胞的COX-2蛋白水平。C类用Sal-B（125μM）或塞来昔布（10μM）处理JHU-013细胞24小时后，测定PGE2水平。PGE2水平表示为总细胞培养的pg/ml。结果代表了两个独立实验的平均值±SD（使用三个重复的培养皿）。与未治疗组比较P值。
图4
图4。Sal-B对PGE2合成的抑制作用
在一个和B类，t吨通过Western blot分析COX-2蛋白水平，并根据COX-2/β肌动蛋白相关强度进行半定量。一个六种HNSCC细胞系和一种非癌性人类口腔角质形成细胞系（OKF-6）中COX-2蛋白水平。B类，用Sal-B（12.5和125µM）处理24小时的JHU-013细胞的COX-2蛋白水平。C类用Sal-B（125μM）或塞来昔布（10μM）处理JHU-013细胞24小时后，测定PGE2水平。PGE2水平表示为总细胞培养的pg/ml。结果代表了两个独立实验的平均值±SD（使用三个重复的培养皿）。与未治疗组比较P值。
图5
图5。Sal-B选择性抑制COX-2表达
一个用Sal-B或塞来昔布处理JHU-013细胞后，用FITC-结合COX-2抗体流式细胞术分析COX-2蛋白水平。顶部面板显示了用125µM Sal-B或10µM塞来昔布处理24小时的培养JHU-013细胞中的COX-2水平。底部面板显示了不同治疗组的肿瘤分解分离出的JHU-013细胞的COX-2水平。B类用不同浓度的Sal-B（12.5、125和250µM）处理JHU-013细胞24小时后，用特异性COX-1或COX-2引物实时PCR分析COX-1和COX-2 mRNA水平的抑制率。C类采用酶免疫分析法测定JHU-013细胞在LPS（100 ng/ml）和Sal-B（12.5、125或250µM）作用4小时后的PGE2水平。右上方插入的是用LPS（100 ng/ml）单独处理JHU-013细胞2到8小时后测量的PGE2水平。PGE2水平以pg/ml为单位进行报告。PGE2分析的结果代表了两个独立实验的平均值±SD（使用三份培养皿）。P值与LPS单独治疗进行比较（*=P<0.05）。D类将JHU-022细胞暴露于含或不含Sal-B的LPS（100 ng/ml）（12.5~250µM）中4小时，然后用FITC-结合COX-2抗体流式细胞术分析COX-2水平。
图5
图5。Sal-B选择性抑制COX-2表达
一个用Sal-B或塞来昔布处理JHU-013细胞后，用FITC-结合COX-2抗体流式细胞术分析COX-2蛋白水平。顶部面板显示了用125µM Sal-B或10µM塞来昔布处理24小时的培养JHU-013细胞中的COX-2水平。底部面板显示了不同治疗组的肿瘤分解分离出的JHU-013细胞的COX-2水平。B类用不同浓度的Sal-B（12.5、125和250µM）处理JHU-013细胞24小时后，用特异性COX-1或COX-2引物实时PCR分析COX-1和COX-2 mRNA水平的抑制率。C类采用酶免疫分析法测定JHU-013细胞在LPS（100 ng/ml）和Sal-B（12.5、125或250µM）作用4小时后的PGE2水平。右上角的插入物是用LPS（100ng/ml）单独处理JHU-013细胞2至8小时后测量的PGE2水平。PGE2水平以pg/ml为单位进行报告。PGE2分析的结果代表了两个独立实验的平均值±SD（使用三份培养皿）。P值与LPS单独治疗进行比较（*=P<0.05）。D类将JHU-022细胞暴露于含或不含Sal-B的LPS（100 ng/ml）（12.5~250µM）中4小时，然后用FITC-结合COX-2抗体流式细胞术分析COX-2水平。
图5
图5。Sal-B选择性抑制COX-2表达
一个用Sal-B或塞来昔布处理JHU-013细胞后，用FITC-结合COX-2抗体流式细胞术分析COX-2蛋白水平。顶部面板显示了用125µM Sal-B或10µM塞来昔布处理24小时的培养JHU-013细胞中的COX-2水平。底部面板显示了不同治疗组的肿瘤分解分离出的JHU-013细胞的COX-2水平。B类，在JHU-013细胞用分级浓度的Sal-B（12.5、125和250µM）处理24小时后，用特异性COX-1或COX-2引物通过实时PCR分析对COX-1和COX-2 mRNA水平的抑制率。C类采用酶免疫分析法测定JHU-013细胞在LPS（100 ng/ml）和Sal-B（12.5、125或250µM）作用4小时后的PGE2水平。右上方插入的是用LPS（100 ng/ml）单独处理JHU-013细胞2到8小时后测量的PGE2水平。PGE2水平以pg/ml为单位进行报告。PGE2分析的结果代表了两个独立实验的平均值±SD（使用三份培养皿）。P值与LPS单独治疗进行比较（*=P<0.05）。D类将JHU-022细胞暴露于含或不含Sal-B的LPS（100 ng/ml）（12.5~250µM）中4小时，然后用FITC-结合COX-2抗体流式细胞术分析COX-2水平。
图5
图5。Sal-B选择性抑制COX-2表达
一个用Sal-B或塞来昔布处理JHU-013细胞后，用FITC-结合COX-2抗体流式细胞术分析COX-2蛋白水平。顶部面板显示了用125µM Sal-B或10µM塞来昔布处理24小时的培养JHU-013细胞中的COX-2水平。底部面板显示了不同治疗组的肿瘤分解分离出的JHU-013细胞的COX-2水平。B类用不同浓度的Sal-B（12.5、125和250µM）处理JHU-013细胞24小时后，用特异性COX-1或COX-2引物实时PCR分析COX-1和COX-2 mRNA水平的抑制率。C类采用酶免疫分析法测定JHU-013细胞在LPS（100 ng/ml）和Sal-B（12.5、125或250µM）作用4小时后的PGE2水平。右上方插入的是用LPS（100 ng/ml）单独处理JHU-013细胞2到8小时后测量的PGE2水平。PGE2水平以pg/ml为单位进行报告。PGE2分析的结果代表了两个独立实验的平均值±SD（使用三份培养皿）。P值与LPS单独治疗进行比较（*=P<0.05）。D类将JHU-022细胞暴露于含或不含Sal-B的LPS（100 ng/ml）（12.5~250µM）中4小时，然后用FITC-结合COX-2抗体流式细胞术分析COX-2水平。
图6
图6。Sal-B诱导JHU-013细胞凋亡的作用
将JHU-013细胞与Sal-B 125µM或250µM培养3、6、12和24小时，然后使用FITC-结合的Annexin V抗体通过流式细胞术测量细胞膜中的Annessin V蛋白。细胞也用碘化丙啶（PI）染色。一个流式细胞仪分析的散点显示：每个面板的右下象限显示V-FITC-阳性和PI-阴性细胞，表明细胞处于凋亡早期，右上象限的细胞同时被PI和Annexin V染色，表明细胞凋亡晚期或不再存活。B类，流式细胞仪分析直方图：Sal-B处理的JHU-013细胞的凋亡和死亡细胞水平（125µM，实心条；250µM的阴影条）。数据显示为平均值±标准差（p<0.05）。C类和D类将JHU-013细胞暴露于Sal-B（125µM）中6、12和24小时，用凋亡调节蛋白抗体探针，如caspase-3、p53、MDM-2、NF-κB、Bcl-2和Bcl-xL，通过Western blot评估凋亡标记物的表达水平。通过Western blot分析PARP的表达和降解水平，以估计完整PARP（116 kD）及其裂解形式（85 kD）的水平。通过比较β-肌动蛋白带的强度，将蛋白质量归一化。
图6
图6。Sal-B诱导JHU-013细胞凋亡的作用
将JHU-013细胞与Sal-B 125µM或250µM培养3、6、12和24小时，然后使用FITC-结合的Annexin V抗体通过流式细胞术测量细胞膜中的Annessin V蛋白。细胞也用碘化丙啶（PI）染色。一个流式细胞仪分析的散点显示：每个面板的右下象限显示V-FITC-阳性和PI-阴性细胞，表明细胞处于凋亡早期，右上象限的细胞同时被PI和Annexin V染色，表明细胞凋亡晚期或不再存活。B类，流式细胞术分析的直方图：Sal-B处理的JHU-013细胞的凋亡和死亡细胞水平（125µM，实心条；250µM，阴影条）。数据显示为平均值±S.D.（p<0.05）。C类和D类将JHU-013细胞暴露于Sal-B（125µM）中6、12和24小时，用凋亡调节蛋白抗体探针，如caspase-3、p53、MDM-2、NF-κB、Bcl-2和Bcl-xL，通过Western blot评估凋亡标记物的表达水平。通过Western blot分析PARP的表达和降解水平，以估计完整PARP（116 kD）及其裂解形式（85 kD）的水平。通过比较β-肌动蛋白带的强度，将蛋白质量归一化。
图6
图6。Sal-B诱导JHU-013细胞凋亡的作用
将JHU-013细胞与Sal-B 125µM或250µM培养3、6、12和24小时，然后使用FITC-结合的Annexin V抗体通过流式细胞术测量细胞膜中的Annessin V蛋白。细胞也用碘化丙啶（PI）染色。一个流式细胞仪分析的散点显示：每个面板的右下象限显示V-FITC-阳性和PI-阴性细胞，表明细胞处于凋亡早期，右上象限的细胞同时被PI和Annexin V染色，表明细胞凋亡晚期或不再存活。B类，流式细胞仪分析直方图：Sal-B处理的JHU-013细胞的凋亡和死亡细胞水平（125µM，实心条；250µM的阴影条）。数据显示为平均值±S.D.（p<0.05）。C类和D类将JHU-013细胞暴露于Sal-B（125µM）中6、12和24小时，用凋亡调节蛋白抗体探针，如caspase-3、p53、MDM-2、NF-κB、Bcl-2和Bcl-xL，通过Western blot评估凋亡标记物的表达水平。通过Western blot分析PARP的表达和降解水平，以估计完整PARP（116 kD）及其裂解形式（85 kD）的水平。通过比较β-肌动蛋白带的强度，将蛋白质量归一化。
图6
图6。Sal-B诱导JHU-013细胞凋亡的作用
将JHU-013细胞与Sal-B 125µM或250µM培养3、6、12和24小时，然后使用FITC-结合的Annexin V抗体通过流式细胞术测量细胞膜中的Annessin V蛋白。细胞也用碘化丙啶（PI）染色。一个流式细胞仪分析的散点显示：每个面板的右下象限显示V-FITC-阳性和PI-阴性细胞，表明细胞处于凋亡早期，右上象限的细胞同时被PI和Annexin V染色，表明细胞凋亡晚期或不再存活。B类，流式细胞仪分析直方图：Sal-B处理的JHU-013细胞的凋亡和死亡细胞水平（125µM，实心条；250µM的阴影条）。数据显示为平均值±S.D.（p<0.05）。C类和D类将JHU-013细胞暴露于Sal-B（125µM）中6、12和24小时，用凋亡调节蛋白抗体探针，如caspase-3、p53、MDM-2、NF-κB、Bcl-2和Bcl-xL，通过Western blot评估凋亡标记物的表达水平。还通过蛋白质印迹分析PARP的表达和降解水平，以估计完整的PARP（116kD）及其裂解形式（85kD）的水平。通过比较β-肌动蛋白带的强度，将蛋白质量归一化。
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