Bcl-xL and UVRAG cause a monomer-dimer switch in Beclin1

doi:10.1074/jbc.M804723200

.2008年9月19日；283(38):26274-82.

doi:10.1074/jbc。M804723200。 Epub 2008年7月18日。

Bcl-xL和UVRAG导致Beclin1中的单体双分子开关

克里斯蒂安·诺布尔¹, 景明东, 爱德华·曼瑟, 宋海伟

附属公司

PMID： 18641390
预防性维修识别码： PMC3258859
内政部： 10.1074/jbc。M804723200型

Bcl-xL和UVRAG导致Beclin1单体二聚体转换

克里斯蒂安·诺布尔等人。生物化学杂志. 2008.

.2008年9月19日；283(38):26274-82.

doi:10.1074/jbc。M804723200。 Epub 2008年7月18日。

作者

克里斯蒂安·诺布尔¹, 景明东, 爱德华·曼瑟, 宋海伟

附属

¹分子和细胞生物学研究所，61 Biopolis Dr.，Proteos，Singapore 138673。

PMID： 18641390
预防性维修识别码： PMC3258859
内政部： 10.1074/jbc。M804723200型

摘要

Beclin1在自噬的启动中起着关键的调节作用，是一种肿瘤抑制因子。我们研究了病毒或人类Bcl-2样蛋白与UVRAG之间的相互作用及其对Beclin1的相反影响。我们证明，Beclin1在体内和体外通过其线圈域在溶液中形成二聚体。病毒Bcl-2独立地与Beclin1二聚体上的两个位点结合，一个具有高亲和力，另一个具有低亲和力，而人类Bcl-x（L）以相对较低的亲和力平等地结合这两个位点。UVRAG破坏Beclin1-dimer界面，与Beclin1形成异二聚体，表明这就是UVRAG如何影响Beclin1-激活自噬。两种Bcl-2样蛋白都将UVRAG对Beclin1的亲和力降低了约4倍，表明它们稳定了Beclin1-二聚体。此外，联合免疫沉淀分析表明，UVRAG显著降低体内Beclin1二聚体。这些数据解释了Bcl-2、UVRAG和Beclin1之间的浓度依赖性相互作用，因为两种肿瘤抑制因子UVRAG和Beclin 1在人类癌症中都有单拷贝突变。此外，我们的数据表明，开发抗癌化合物的另一种策略是破坏Beclin1-dimer界面。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
**Beclin1 CCD在溶液中二聚。**Beclin1 CCD公司(A类)和Beclin1 BH3-CCD公司(B类)通过沉降平衡和符合理想的单物种模型。适合每种蛋白质的代表性如图所示。C类，Beclin1 CCD和Beclin1BH3-CCD也通过沉降速度，并与*c（c）*(*S公司*)和*c（c）*(*M（M）*)大小分布函数。这个*c（c）*(*M（M）*)显示了这两种蛋白质的分布。

**图2。**
**两个vBcl-2分子结合Beclin1二聚体；一个高一个低密切关系。** A类，使用ITC对vBcl-2在注射注射器滴定到细胞中的Beclin1 BH3-CCD中。数据是符合双位点结合模型(*下部面板*).B类，一个vBcl-2-Beclin1 BH3-CCD复合物的联合纯化和分析沉积平衡。数据被拟合到异二聚体模型中vBcl-2通过两个单独的事件与Beclin1二聚体结合。A类显示了代表性配合。C类中vBcl-2的ITC滴定注射器和细胞中的Beclin1 BH3肽，数据被拟合到单站点模型。

**图3。**
**Bcl-x公司_L（左）通过不同的机制与Beclin1结合vBcl-2。**用Bcl-x滴定ITC_L（左）注射器和Beclin1中BH3-CCD(A类)或Beclin1 BH3(B类)细胞中的肽。数据适用于单站点模型。

**图4。**
**UVRAG破坏Beclin1二聚体界面。** A类、ITC注射注射器中UVRAG CCD和注射器中Beclin1 BH3-CCD的滴定单元格。B类，凝胶过滤分析曲线，在210 nm下测量Beclin1 CCD、UVRAG CCD或两者的混合。C类，ITC滴定注射注射器中的vBcl-2和细胞中的Beclin1 BH3-CCDUVRAG CCD的2倍过剩。ITC数据被拟合到单站点模型。

**图5。**
**Bcl-x公司_L（左）和Bcl-2对Beclin1的UVRAG。**注射器和Beclin1中UVRAG CCD的ITC滴定存在2倍vBcl-2的电池中的BH3-CCD(A类)或Bcl-x_L（左）(B类). 数据被拟合到一个单站点模型在Bcl-x的见证下_L（左）.n个保持不变1

**图6。**
**Beclin1与Bcl-x联合本地化_L（左）在线粒体中取决于BH3域。** A类，HeLa细胞转染YPet-Beclin1(*a-c公司*)、YPet-Beclin1和mCherry-Bcl-x_L（左）(*d-f型*)，或YPet-Bcl-x_L（左）(*h-i型*)6小时后固定。使用MitoTracker评估线粒体共定位(b条和克).面板c、f、和我是的合并图像一和*b、 d日*和*e（电子）*、和克和小时，分别是。这个插入显示放大区域（×3.4）。B类，表达COS-7细胞的代表性图像YPet-Beclin1-（95-266）和mCherry-Bcl-x_L（左）(*a-c公司*)或YPet-Beclin1-（133-266）和mCherry-Bcl-x_L（左）(d日-*（f）*).面板c和*（f）*是的合并图像一和b条和或d日和*e（电子）*分别是。

**图7。**
**Beclin1通过其CCD结构域二聚化，这种相互作用被抑制由UVRAG提供体内**.A类，COS7总细胞裂解物(*TCL公司*，400μg）共表达FLAG-SBP-Beclin1和YPet-fusion在25μl链霉亲和素琼脂糖上收集所示的蛋白质水洗后，用Western印迹法对10%的材料进行评估结合YPet蛋白。使用总细胞裂解液（5%）进行比较。*GFP公司*，绿色荧光蛋白。B类，COS7细胞表达血凝素(哈)-Beclin1 BH3-CCD、YPet-Beclin1 BH3-CC和FLAG在25μl链霉亲和素琼脂糖上收集所示的构建物珠子和加工为A类.

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