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.2008年2月；19(2):745-53.
doi:10.1091/mbc.e07-08-0847。 Epub 2007年11月28日。

高尔基体蛋白GM130调节中心体形态和功能

安德鲁·科达尼 1, 克里斯汀·苏特林
附属公司

高尔基体蛋白GM130调节中心体形态和功能

安德鲁·科达尼等。 分子生物学细胞. 2008年2月.

摘要

哺乳动物细胞的高尔基体（GA）位于中心体附近，中心体是细胞的主要微管组织中心。这种物理邻近性对细胞器功能和细胞周期进展的重要性才刚刚开始被了解。我们已经确定了GA蛋白GM130在调控中心体形态、位置和间期功能中的新功能。RNA干扰介导的五种人类细胞株的GM130缺失显示了异常的间期中心体，这些中心体在微管组织和细胞迁移方面定位错误且有缺陷。当GM130缺失的细胞进入有丝分裂时，它们形成多极纺锤体，在中期停滞并死亡。我们还在ldlG细胞有丝分裂期间的间期和多极纺锤体中检测到异常中心体，其中不包含可检测的GM130。虽然GA蛋白被描述为调节有丝分裂中心体和纺锤体的形成，但这是GA蛋白在间期中心体调节中的首次报道。

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图1。
图1。
GM130调节GRASP65的GA关联，而不是其稳定性。（A） 显示了RNAi靶向序列（GM130-1和GM130-2）及其在人类GM130 cDNA中的位置。（B） 转染对照或敲除siRNA（GM130-1 siRNA）或短发夹表达质粒（GM130-1shRNA）的HeLa细胞在转染后的指定时间点收获。Western blot分析显示GM130、GRASP65和α-微管蛋白水平作为负荷控制。（C） 以GM130、Golgin 97、GRASP55和α-微管蛋白抗体作为负荷对照，通过Western blot分析检测对照和GM130缺失细胞的裂解物。（D） 敲除转染72小时后，用GRASP65、GRASP55和Giantin抗体通过免疫荧光分析对照或GM130缺失细胞。比例尺，10μm。
图2。
图2。
双极纺锤成型需要GM130。（A） 用对照质粒和敲除质粒转染HeLa、HeLa-GalNAc-T2和SaOS-2细胞，72小时后固定，并用Centrin2、α-微管蛋白抗体染色以监测微管组织，用染料Hoechst 33342染色以显示DNA。纺锤体组织和DNA比对被用作有丝分裂表型分为四类的标准。显示了每个表型的代表性细胞。比例尺，5μm。（B） 量化有丝分裂控制和GM130-depleted HeLa在这些纺锤体表型中的分布（n=3）。（C） 用Centrin2和Kendrin抗体对有丝分裂控制或GM130缺失的HeLa和SaOS-2细胞的纺锤体进行染色。合并的图像还显示了用染料Hoechst检测到的DNA组织。
图3。
图3。
通过表达全长GM130来纠正纺锤形成中的缺陷。（A） 用对照或GM130敲低质粒转染HeLa细胞，该质粒也表达胞质GFP（+GFP）或GFP标记的RNAi抗性GM130（+GFP-GM130）。制备裂解物，并用GM130、Golgin 97、GRASP65和α-微管蛋白的抗体通过蛋白质印迹进行分析。（B） 同时，将图3A中所述的细胞重新放置在盖玻片上，固定并用磷酸化-胆固醇H3和α-微管蛋白抗体进行免疫荧光处理，以分别显示有丝分裂指数和纺锤体组织。图中显示了有丝分裂和有丝分裂纺锤体异常的细胞百分比（n=3）。
图4。
图4。
GM130在纺锤形成中的作用独立于GRASP65。（A） 转染72天后固定对照组和表达GFP（+GFP）或GM130的C末端（+GFP-ΔN690）的GM130缺失（敲除）HeLa细胞，并用荧光显微镜检查GFP和GRASP65的定位。比例尺，5μm。（B） 表达GFP或GM130 C末端GFP-ΔN690的对照细胞和GM130缺失细胞分别用磷酸-胆固醇H3和α-微管蛋白抗体染色，以显示有丝分裂指数和有丝分裂纺锤体的组织。有丝分裂和纺锤体异常的细胞百分比由三个独立的实验测定。（C） ●●●●。微管组织和DNA比对被用作标准，将纺锤体组织分为图2B中定义的相同四类。
图5。
图5。
GM130缺失细胞含有异常和错位的中心体。（A） 用对照（对照shRNA）或敲除质粒（GM130 shRNA）转染HeLa细胞，72小时后固定，并进行免疫荧光处理。用对Centrin2（绿色）和GM130、Kendrin、Ninin或γ-微管蛋白（均为红色）的抗体对细胞进行染色，以显示中心体形态。（B） 用GM130（灰色）和Centrin2（红色）抗体对GalNAc-T2细胞进行染色。GFP-GalNAc-T2（绿色）显示为小插页，显示了GA的整体组织。（C）通过免疫荧光分析间期控制和GM130缺失的U2-OS细胞，如A.比例尺中HeLa细胞所述，（A–C）2μm。（D） 对表达抗RNAi的GM130（+GFP-GM130）或GM130的C末端（+GFP-ΔN690）的对照组和GM130缺失的U2-OS细胞进行分析，以确定是否存在异常中心体。我们还分析并量化了对照组和GRASP65缺失的U2-OS细胞中心体的组织。显示了具有四个以上中心蛋白2阳性病灶的细胞百分比（n=3）。（E） 对照组、GM130-和GRASP65-缺失的U2-OS细胞用GM130（红色）、Centrin2（绿色）和DNA染料Hoechst（灰色）的抗体染色。小插图对应于每张图中的方框区域。（F）对每种情况下中心体相对于细胞核定位错误的细胞百分比进行量化。比例尺，5μm。n=3。
图6。
图6。
纺锤体形成缺陷是间期中心体异常的结果。（A） 对照组和GM130缺失的HeLa细胞未经处理或与胸苷孵育18 h，然后用GM130和Centrin2抗体固定和处理免疫荧光。代表性细胞的中心体显示在对应于方框图像区域的插图中。（B） 用胸腺嘧啶核苷将细胞阻滞在S期或从胸腺嘧啶核苷类阻滞物中释放8小时，然后用磷酸化h istone H3和α-微管蛋白抗体进行免疫荧光处理，以分别显示有丝分裂指数和纺锤体组织。细胞也与半胱氨酸蛋白酶抑制剂ZVAD孵育，以防止凋亡细胞死亡。图中显示了有丝分裂和纺锤体异常的细胞百分比（n=3）。
图7。
图7。
GM130耗尽导致G2-M转变时细胞生长和细胞周期延迟的总体减少。（A） 在3天的时间内监测用对照或GM130特异性siRNA处理的细胞的生长。（B） 用对照或敲除质粒转染U2-OS细胞，72 h后用Hoechst 33342标记30 min，进行流式细胞术。细胞轮廓是三个实验的代表（每个轮廓>30000个细胞）。（C） 对照（对照shRNA）和敲除（GM130 shRNA）U2-OS细胞用BrdU脉冲标记30分钟，24小时后固定，并用BrdU-特异性抗体进行免疫荧光处理。显示了具有代表性的相控和免疫荧光图像。比例尺，10μm。（D） BrdU阳性对照细胞和敲除细胞的百分比显示为三个独立实验的平均值。
图8。
图8。
GM130的缺失导致中心体功能缺陷。（A） 用GM130、Centrin2和α-微管蛋白抗体通过免疫荧光分析对照和GM130缺失的U2-OS细胞，以分别揭示GM130缺失水平、中心体和微管组织。箭头指向中心体的位置。（B） 对照组和GM130缺失的U2-OS细胞用GM130和EB1抗体染色，观察微管的生长端。（C） 对表达抗RNAi GM130（+GFP-GM130）或GM130 C末端（+GFP-ΔN690）的对照组和GM130缺失的U2-OS细胞进行乙酰化微管分析。比例尺，10μm。
图9。
图9。
在伤口愈合分析中，GM130缺失的细胞不能迁移或重新定位其中心体。（A） 通过实时成像监测对照组和GM130缺失的A549细胞向划痕伤口的迁移。在最后一个时间点后，用GM130抗体固定细胞并染色，以观察GM130耗竭情况，并用Centrin2观察中心体的组织。底部面板中的单元格与相位对比图像中方框中显示的单元格相对应。比例尺，50μm。（B） 在引入划痕伤口30分钟、1小时和4小时后，对具有中心体朝向伤口边缘的对照细胞和击倒细胞的百分比进行量化。
图10。
图10。
ldlG细胞在间期有异常的中心体，在有丝分裂中有缺陷的纺锤体。分别在37℃或34℃下生长的野生型和GM130-defient（ldlG）CHO细胞被固定并进行免疫荧光处理。（A） 典型的间期细胞被Centrin2（绿色）和GM130、Kendrin、Ninin和γ-tubulin（均为红色）抗体染色。比例尺，2μm。（B） 为亲代CHO和ldlG细胞（n=3）测定的中心蛋白阳性病灶>4的细胞百分比。（C） 用α-微管蛋白和Kendrin抗体（如小插图所示）对有丝分裂中的野生型和ldlG细胞进行染色，以分别监测有丝分裂纺锤体和纺锤体极的组织。用Hoechst 33342染料染色细胞来监测DNA组织。图中显示了两种具有代表性的野生型和突变型细胞。比例尺，5μm。
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