The full-ORF clone resource of the German cDNA Consortium

doi:10.1186/1471-2164-8-399

。2007年10月31日：8:399。

doi:10.1186/1471-2164-8-399。

德国cDNA联盟的完整ORF克隆资源

附属机构

PMID： 17974005
预防性维修识别码：项目经理2213676
内政部： 10.1186/1471-2164-8-399

德国cDNA联盟的完整ORF克隆资源

斯蒂芬妮·贝克特尔等。 BMC基因组学。 2007。

。2007年10月31日：8:399。

doi:10.1186/1471-2164-8-399。

隶属关系

¹德国海德堡德国癌症研究中心分子基因组分析部。s.bechtel@dkfz-heidelberg.de邮箱

PMID： 17974005
预防性维修识别码：项目经理2213676
内政部： 10.1186/1471-2164-8-399

摘要

背景：随着人类基因组序列的完成，编码蛋白的功能分析和表征已成为后基因组时代下一个迫切的挑战。迄今为止，由于缺乏全面的ORFeome资源，阻碍了蛋白质功能获得分析的系统应用。因此，需要扩大全长ORF克隆的基因和ORF覆盖范围。结合独特和通用的克隆系统，这些将为全基因组系统功能分析提供工具，以更深入地了解复杂的生物过程。

结果：在这里，我们描述了应用网关克隆技术（Invitrogen）生成人类基因的完整ORF克隆资源。开发了高效克隆和测序的管道，并实施了样本跟踪数据库，以简化针对2200多个不同ORF的克隆生产过程。此外，还制定了一个稳健的克隆策略，通过在克隆过程中只执行一个额外的工作步骤，就可以同时生成两个克隆变体，其中包含一个特定的ORF（带有或不带有终止密码子）。高达92%的目标ORF被PCR成功扩增，93%以上的扩增子被成功克隆。

结论：德国cDNA联盟ORFeome资源目前由3800多个代表ORF的序列验证进入克隆组成，分别克隆了约1700个不同基因位点的终止密码子和非终止密码子。克隆了177个剪接变异体，代表其中121个基因。条目克隆已用于生成5000多个不同的表达式构造，为功能分析应用程序提供了基础。作为最近成立的国际ORFeome合作组织的成员，我们为在一个独特的克隆系统中生成和提供全基因组人类ORFeomes集合做出了巨大贡献，该克隆系统可在社区中免费使用。

PubMed免责声明

数字

图1
**基因结构建模**UCSC基因组浏览器的屏幕截图显示了一个基因，我们预测该基因将在三种变体转录物中表达，因此具有三种基因模型（hp1_2a-c）的特征。基因模型显示不同的转录起始位点，导致编码蛋白的N末端不同。所有三个模型都可以通过ORF扩增、克隆和结果进入克隆的序列验证进行验证。

图2
**反应条件优化前后PCR-成功**优化步骤对成功率（百分比）的影响取决于ORF大小。当在分析琼脂糖凝胶电泳中观察到预期大小的DNA产物时，PCR被定义为成功。

图3
**项目中克隆的ORF的平均大小**由于ORF扩增和克隆程序的综合改进，成功克隆的ORF的大小持续增加。

图4
**两种不同DNA聚合酶系统扩增PCR产物的比较**共扩增出100个ORF（每个酶混合物50个ORF），大小从300到4000 bp不等。使用供应商I（左侧面板）或Phusion™高纯度DNA聚合酶（Finnzymes）（右侧面板）扩增的10个代表性ORF的电泳分析。第一步和第二步ORF扩增的每一反应产物的十分之一彼此相邻地加载在分析琼脂糖凝胶上。根据车道数，第一步PCR模板的预期ORF大小和加入数如下：1:759bp，BC100921；2:1125 bp，BC093648；3:1554 bp，BC104948；4:3198 bp，BC117368；5:651 bp，BC105131；6:1653 bp，BC109061；7:2400 bp，BC113416；8:1737 bp，BC117320；9:1854 bp，BC101755；10:720 bp，BC113739。“M”表示分子量标记车道。

图5
**通过或不通过优化反应成分和条件成功进行入门级克隆生产**不同的ORF大小范围显示了不同协议修改对BP克隆成功的累积影响。当预期的ORF能够被克隆和序列验证时，BP反应被认为是成功的。

图6
**在开放和封闭配置中同时生成入口克隆的克隆策略**。一个：ORF的进入克隆序列3'包含或不包含终止密码子。这些序列与2步PCR的反向引物序列相对应。在退化位置存在A时，会产生一个终止密码子，并且巴姆HI站点（带下划线）已损坏。相反，包含G会生成巴姆HI站点，并导致翻译通读。B类：条目克隆映射的示意图。”for’和‘rev’表示菌落PCR引物的结合位点。退化的位置用箭头表示。C:巴姆使用退化反向引物扩增的四个不同ORF的BP克隆产生的八个独立集落的HI集落PCR限制性消化。箭头标记了出现在巴姆HI识别序列，表示ORF不包含终止密码子。ORF 4含有一个内部BamHI位点，其表现为约100bp的条带M’表示分子量标记车道。

图7
**克隆数据库“SCISSORS”的用户界面**.A：第二步ORF PCR数据输入表截图。B：用该软件组装96个菌落PCR板。输入的PCR结果由软件自动进行彩色编码，如下所示：红色和灰色：阳性或阴性菌落（琼脂糖凝胶上是否存在预期大小的条带），蓝色：已用于质粒制备的入口克隆菌落，黄色：选择用于生成新入口克隆96-well板的菌落。C：入口克隆板的用户界面。在对照消化物中得分为阳性的克隆自动用绿色进行彩色编码，阴性克隆保持白色。点击平板位置打开一个窗口，输入特定条目克隆的排序结果。D：工作步骤的结果也可以以表格格式输入，如条目克隆验证所示。

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