Loss of keratin 6 (K6) proteins reveals a function for intermediate filaments during wound repair

doi:10.1083/jcb.200305032

.2003年10月27日；163(2):327-37.

doi:10.1083/jcb.200305032。 Epub 2003年10月20日。

角蛋白6（K6）蛋白的丢失揭示了中间丝在伤口修复过程中的功能

王小凤¹, 皮埃尔·A·库仑

附属公司

PMID： 14568992
预防性维修识别码： PMC2173512型
内政部： 10.1083/jcb.200305032

角蛋白6（K6）蛋白的丢失揭示了中间丝在伤口修复过程中的功能

王小凤等。 J细胞生物学. 2003.

.2003年10月27日；163(2):327-37.

doi:10.1083/jcb.200305032。 Epub 2003年10月20日。

作者

王小凤¹, 皮埃尔·A·库仑

附属

¹美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院生物化学系，邮编21205。

PMID： 14568992
预防性维修识别码： PMC2173512型
内政部： 10.1083/jcb.200305032

摘要

愈合伤口的能力对所有生物体都至关重要。在哺乳动物组织中，中间丝（IF）基因表达的改变代表了细胞在损伤后存活的早期反应。我们使用角蛋白6alpha和6beta（K6alpha/K6beta）缺失小鼠模型研究了角蛋白IFs在皮肤伤口上皮化过程中的作用。在皮肤外植体培养中，由于迁移增加，空白角质形成细胞显示出增强的上皮化潜能。表型的程度依赖于菌株，并伴有角蛋白IF和F-actin组织的改变。然而，在体内受伤的皮肤中，当角质形成细胞试图在血块下迁移时，它们会破裂。当对化学处理的皮肤施加创伤时，K6alpha/K6beta-null表皮的脆弱性得到证实。我们认为，组织损伤后IF基因表达的改变促成了及时迁移所需的细胞柔韧性显示需求与足以承受创伤部位严酷的韧性需求之间的折衷。

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数字

**图1。**
**K6公司**α**/K6公司**β**-在皮肤外植体培养中，空白角质形成细胞表现出更强的上皮化潜能。**（A）定量外植体角质形成细胞的生长。皮肤穿孔培养8d，通过K17免疫染色鉴定角质形成细胞。分析了每只小鼠8个皮肤穿孔，每个基因型至少13只小鼠。显示了平均值±SEM值。星号表示与野生型的差异具有统计学意义（P<0.0001）。（B）在培养8天后处理野生型和K6α/K6β缺失皮肤外植体进行K17免疫染色的示例。箭头表示角质形成细胞突起的前缘，双箭头表示外植体活检的边缘。（C）通过评估位于生长物远端边缘的角质形成细胞与外植体边缘之间的距离，比较K6α/K6β-和K14空皮肤外植体的性能。误差条代表SD。（D和E）细胞蛋白是从培养6 D的混合外植体中制备的(n个>每个基因型60个外植体；参见材料和方法），使用SDS-PAGE进行解析，并用考马斯蓝或Western blotting染色以确定角蛋白含量。在D中，星号表示在制剂之间以不同数量存在的条带，可能代表较大蛋白质的降解产物。（F）对收集自6-d龄外生长物的RNA进行半定量RT-PCR。K16特异性引物用于量化K16 mRNA转录物的数量。β-管蛋白引物被用作内部对照。在22、27、32和37个PCR周期后收集样本。

**图2。**
**增强K6**α**/K6公司**β**-无上皮化可能是角质形成细胞迁移增加的结果。**（A） 6天龄皮肤移植体细胞外生长中BrdU的免疫荧光染色。所示区域位于外植体边缘（Ex）旁边。箭头表示生长方向。棒材，50μm。（B）野生型和K6α/K6β阴性样品中BrdU阳性角质形成细胞的密度（以每毫米外植体组织周长表示）。误差条表示用6天龄外植体制备的蛋白提取物中myc和增殖细胞核抗原的SD.（C）Western blot分析。Actin是加载控件。（D和E）丝裂霉素C处理后皮肤外植体中的角质形成细胞迁移。（D）相对于野生型，半合子和纯合子K6α/K6β缺失外植体在治疗后8天、治疗后24小时或未治疗后的角质形成细胞生长总面积(n个=62重量；132个半合子；35个空白外植体）。（E）接种后48小时处理后，活皮肤外植体培养物中野生型、半合子和纯合子K6α/K6β缺失外植体中的角质形成细胞随着时间的变化而生长。在培养第2、4、6和8天进行距离测量(n个=6重量；13个半合子；12个空白外植体）。误差条代表SEM。（F）培养6天的皮肤外植体的细胞生长池(n个>每种基因型60个）用裂解缓冲液溶解，不溶性蛋白质在用α-p120进行Western blot分析之前被制成颗粒、溶解并电泳（2μg蛋白质）^ctn公司、α-磷酸酪氨酸和α-肌动蛋白抗体。与对照组相比，K6α/K6β阴性样品中增加的磷酸酪氨酸表位用星号标识，而含量较低的表位用星号标识。p120中的两个带^ctn公司blot可能代表p120的不同亚型^ctn公司（Anastasiadis和Reynolds，2001年）。

**图3。**
**角质形成细胞外生长的免疫荧光染色显示角蛋白和肌动蛋白细胞骨架的改变。**对野生型和K6α/K6β缺失的外植体进行（A）K16、K17和（B）肌动蛋白的免疫染色。（A）单箭头表示野生型样本中的泛细胞质角蛋白丝，而箭头表示外植体边缘K6α/K6β-缺失的角质形成细胞中含有部分塌陷的K16-和K17-纤维网络。（B）双箭头表示K6α/K6β阴性角质形成细胞中肌动蛋白丝的强度和数量增加。棒材，50μm。

**图4。**
**皮肤外植体培养中上皮化潜能的增强受遗传菌株背景的影响。**将混合K6α/K6β-缺失小鼠（129/Sv×C57Bl/6×DBA2）回交到两个不同的近交系129/SvJ和C57Bl/6，至少回交7代。定量皮肤外植体培养8d后角质形成细胞的生长程度，并与混合遗传背景进行比较。显示平均值±SEM值。在统计学上与野生型外植体不同的基因型用星号标识（P≤0.0002）。

**图5。**
**接枝K6**α**/K6公司**β**-切口损伤后，空白皮肤组织呈现上皮脆性。**（A和B）移植到免疫低下小鼠上的野生型和K6α/K6β阴性背皮的背侧视图。（C和E）野生型和K6α/K6β-缺失动物未损伤移植背皮的H&E染色切片的显微照片。（D和F）移植组织全皮厚切口损伤后第3天的类似切片的显微照片。箭头所示为伤口边缘迁移的角质形成细胞。（G和H）损伤后第3天，（G）野生型和（H）K6α/K6β缺失皮肤移植物中活化上皮的放大率较高。箭头指示伤口边缘活化上皮发生退行性变化，以及迁移角质形成细胞的细胞内溶解。开放箭头指向基底上层内的浮动核。（一）对K6α/K6β缺失皮肤移植物伤口边缘组织中的K17进行免疫染色，证实如箭头所示，细胞质内发生了分裂。表皮；HF，毛囊；AK，伤口边缘角朊细胞活化；Sc，结痂。棒材：（C–F）100μm；（G-I）50μm。

**图6。**
**创伤诱导K6溶解**α**/K6公司**β**-化学诱导后，移植的背部皮肤中的角质形成细胞为空。**在第1天、第3天和第5天施用PMA，第7天收获嫁接的背部皮。（A和D）野生型和K6α/K6β-无PMA处理的移植物的H&E染色切片的显微图，无机械损伤。（B和E）在收获前立即对处理过的移植物进行轻微摩擦。箭头显示K6α/K6β缺失表皮基底上层的细胞内溶解。（C和F）野生型和K6α/K6β缺失的移植组织进行塑料包埋，切片（0.5μm厚），并用甲苯胺蓝染色。表皮；真皮，真皮；分泌物、渗出物；hr，头发；和hf，毛囊。棒材，50μm。

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1. Andra，K.、B.Nikolic、M.Stocher、D.Drenckhahn和G.Wiche。1998.不仅仅是支架：plectin调节培养细胞中的肌动蛋白动力学。基因发育12:3442–3451。-项目管理咨询公司-公共医学
1. Baribault，H.、J.Price、K.Miyai和R.G.Oshima。1993年。缺乏角蛋白8的小鼠的中期致死率。基因发育7:1191-1202。-公共医学
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