High resolution crystal structure of the human PDK1 catalytic domain defines the regulatory phosphopeptide docking site

doi:10.1093/emboj/cdf437

.2002年8月15日；21(16):4219-28.

doi:10.1093/emboj/cdf437。

人PDK1催化结构域的高分辨率晶体结构确定了调节磷酸肽对接位点

里卡多·M·比昂迪¹, 大卫·科曼德, 克里斯汀·托马斯, 何塞·利兹卡诺, 玛丽亚·迪克, 达里奥·阿莱西, Daan M F van Aalten公司

附属公司

PMID： 12169624
预防性维修识别码： PMC126174号
内政部： 10.1093/emboj/cdf437

人PDK1催化域的高分辨率晶体结构确定了调节性磷酸肽对接位点

里卡多·M·比昂迪等。欧洲工商管理硕士J. 2002.

.2002年8月15日；21(16):4219-28.

doi:10.1093/emboj/cdf437。

作者

里卡多·M·比昂迪¹, 大卫·科曼德, 克里斯汀·托马斯, 何塞·M·利兹卡诺, 玛丽亚·迪克, 达里奥·阿莱西, Daan M F van Aalten公司

附属

¹英国苏格兰邓迪DD1 5EH邓迪大学生命科学学院信号转导治疗部。

PMID： 12169624
预防性维修识别码： PMC126174号
内政部： 10.1093/emboj/cdf437

摘要

3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1（PDK1）通过激活PKB/Akt和S6K等AGC激酶在调节信号通路中发挥关键作用。在这里，我们描述了PDK1激酶结构域与ATP复合物的2.0A晶体结构。该结构定义了疏水囊，称为“PIF-囊”，在介导某些底物（如S6K1）的相互作用和磷酸化中起着关键作用。S6K1 C端PIF-口袋相互作用基序的磷酸化促进S6K1与PDK1的结合。在PDK1结构中，该口袋被与PDK1另一分子的晶体接触占据。有趣的是，靠近PDK1中的PIF口袋，有一个有序的硫酸根离子，与周围的四个侧链紧密相互作用。通过定点突变和动力学研究相结合的方法研究了这些残基的作用，结果证实PDK1的这一区域代表一个磷酸依赖性对接位点。我们讨论了类似的磷酸结合调控基序可能参与其他AGC激酶激活的可能性。此外，PDK1的结构为设计特异性PDK1抑制剂提供了支架。

PubMed免责声明

数字

**图1。**PDK1结构概述。PDK1激酶结构域骨架以带状表示，残基74-163的二级结构元件为绿色，残基164-358的二级结构元件为蓝色。螺旋αG含有287–295个残基（与对称相关的PDK1分子进行晶体接触，如图2所示），呈紫色。本文中讨论的关键残留物显示为带有橙色碳的棒状模型。ATP显示为带有紫色碳原子的棒状模型。ATP分子的模拟退火省略图以黑色显示，轮廓为3σ。还显示了本文中讨论的磷丝氨酸（pS241）和硫酸盐。

**图2。**PIF口袋。(A类)显示了假定的PIF结合囊的表面表示，并与PKA中与C末端FXXF基序相互作用的囊进行了比较。对于PDK1，对称性相关分子的αG螺旋显示为紫色线圈，在PKA中，C末端显示为紫色圈。口袋中埋藏的芳香氨基酸显示为带有绿色碳的棒状物，与口袋相互作用的进一步侧链显示为橙色碳。螺旋αC在PDK1和PKA中均显示为绿色带状。在PDK1中，还显示了有序硫酸根离子和与之相互作用的碱基残基。星号表示对称相关分子的残基。(B类)显示了PIF/磷酸盐容器内衬残留物的立体图像。PDK1主干显示为灰色带状。侧链显示为橙色碳原子。硫酸根离子上的氢键显示为黑色虚线。

**图3。**基于结构的序列对齐。PKA和PDK1序列根据WHAT IF（Vriend，1990）中执行的结构叠加进行对齐。序列号根据PDK1。根据DSSP（Kabsch和Sander，1983）二级结构赋值，PDK1结构的β链（箭头）和α螺旋（条形）显示出来，并按照PKA的二级结构元素名称进行标记（Taylor和Radzioandzelm，1994）。PIF袋中的残留物用黑点表示。与硫酸根离子形成氢键的残留物用箭头表示。PKA中相当于Ser53和Gly186的PDK1残基用星号标记。

**图4。**PDK1结合和活化研究。野生型和突变型PDK1与衍生自S6K1疏水基序的磷酸肽的结合和活化。如材料和方法中所述，通过表面等离子共振分析野生型（wt）PDK1和所示突变体与包含S6K1疏水基序的磷酸肽的结合（S6K-pHM:SESANQVFLGFT*YVAPSV，其中T*表示磷酸三氢嘌呤）。(A类)传感器芯片SA涂有生物素化S6K-pHM肽的12 RU，并在注射270 nM野生型PDK1、PDK1[T148A]和PDK1[K76A]后分析其结合。使用PDK1[R131A]或PDK1[Q150]未观察到与S6K-pHM的可检测结合（数据未显示）。(B类)如（A）所示，但对PDK1浓度范围（2–2150 nM）的结合进行了分析。绘制稳态结合时的响应水平与PDK1浓度的对数。估计*K（K）*_天通过使用Kaleidrograph软件将数据拟合到公式[m1×m0/（m0+m2）]获得。*K（K）*_天对于野生型PDK1等于642±131 nM，PDK1[T148A]*K（K）*_天=64±7 nM和PDK1[K76A]*K（K）*_天=1744±167毫微米。野生型PDK1或任何突变株均未检测到PDK1与非磷酸化S6K-HM肽（SESANQVFLGFTYVAPSV）的结合（数据未显示）。(C类)S6K-pHM和S6K-HM激活指定形式的PDK1。如材料和方法中所述，在存在指定浓度的S6K-pHM（闭合圈）和S6K-HM（开放圈）的情况下，使用肽底物（T308tide）测量PDK1活性。试验分为三次进行，两次单独的试验获得了类似的结果。结果为单个实验的平均±SD。

**图5。**调节性磷酸盐与αC-螺旋的相互作用。(A类)PDK1主干显示为带状，螺旋αC位于视图中心。关键残留物显示为带有橙色碳的木棍。还显示了活化回路上的硫酸根离子和磷酸盐。ATP的棒状模型显示为紫色的碳纤维。氢键显示为黑色虚线。(B类)将构成PDK1上磷酸囊的一部分的氨基酸序列与所示AGC激酶的等效区域对齐。PDK1的Lys76、Arg131、Thr148和Gln150对应的残基用粗体表示。

**图6。**基本动力学。(A类)将所有可用的PKA晶体结构（标记点）和PDK1结构（钻石）投影到根据PKA结构计算的前两个特征向量（具有两个最大特征值的特征向量）上。(B类)通过投影–4 nm（黑色）和+4 nm（橙色）处的两个结构生成的沿第一个特征向量的运动的图形表示。

**图6。**基本动力学。(A类)将所有可用的PKA晶体结构（标记点）和PDK1结构（钻石）投影到根据PKA结构计算的前两个特征向量（具有两个最大特征值的特征向量）上。(B类)沿着第一个特征向量的运动的图形表示，通过在–4 nm（黑色）和+4 nm（橙色）处投影两个结构生成。

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1. Alessi D.R.等人（1997）3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1（PDK1）：与果蝇DSTPK61激酶的结构和功能同源性。货币。生物学，776–789。-公共医学
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