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.2008年2月5日；105(5):1516-21.
doi:10.1073/pnas.0707493105。 Epub 2008年1月28日。

MicroRNA-126调节血管细胞粘附分子1的内皮表达

塔米娅·哈里斯 1, 山口幕府, 马塞拉·费利托, 约书亚·T·门德尔, 查尔斯·洛文斯坦
附属公司

MicroRNA-126调节血管细胞粘附分子1的内皮表达

塔米娅·哈里斯等人。 美国国家科学院程序. .

摘要

活化内皮细胞表达的粘附分子在调节白细胞向炎症部位的转运中起着关键作用。静止的内皮细胞通常不表达粘附分子，但细胞因子激活内皮细胞表达粘附分子如血管细胞粘附分子1（VCAM-1），其介导白细胞粘附内皮细胞。我们现在发现内皮细胞表达microRNA 126（miR-126），抑制VCAM-1的表达。用减少miR-126的寡核苷酸转染内皮细胞可增加TNF-α刺激的VCAM-1表达。相反，miR-126前体的过度表达增加了miR-126的水平，并降低了VCAM-1的表达。此外，降低内源性miR-126水平会增加白细胞对内皮细胞的粘附。这些数据表明，microRNA可以调节粘附分子的表达，并可能提供额外的血管炎症控制。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
内皮细胞表达miR-126。(A类) (上部)从各种小鼠组织中获取总RNA，并通过Northern印迹分析miR-126 RNA(下部)总RNA的溴化乙锭染色(B类) (上部)从不同类型的细胞中获取总RNA，并通过Northern blotting分析miR-126 RNA(下部)总RNA的溴化乙锭染色(C类)从不同类型的细胞中获取总RNA，并通过定量RT-PCR分析miR-126 RNA(D类)用AS寡核苷酸或premiR-126寡核苷酸转染HUVEC，然后培养3天。将1 ng/ml的TNF-α添加16 h。收集总RNA并通过Northern印迹分析miR-126 RNA水平(上部)溴化乙锭染色(下部).
图2。
图2。
miR-126通过靶向miR-126-结合位点抑制基因表达。(A类)miR-126与VCAM-1 3′-UTR中的一个区域部分互补。(上部)VCAM-1 mRNA和miR-126的示意图。(下部)VCAM-1 3′-UTR中miR-126的序列及其潜在匹配位点。(B类)互补miR-126结合位点被插入pMIR-Report质粒上荧光素酶报告子的下游，并转染到HEK293细胞中，其中含有不同浓度的前体R-126(n个=3±SD；*，P（P）<0.01（0 nM vs.20 nM预混R-126）。(C类)将VCAM-1 3′-UTR中发现的部分互补miR-126结合位点（或突变结合位点）插入pMIR-Report质粒上荧光素酶报告子的下游，并转染到HEK293细胞中不同浓度的前体R-126(n个=3±SD；*，P（P）<0.001（0 nM vs.30 nM预混R-126）。
图3。
图3。
miR-126抑制VCAM-1的表达。(A类)TNF-α诱导HUVEC中VCAM-1的表达。用增加剂量的TNF-α刺激HUVEC 16小时，用VCAM-1抗体免疫印迹细胞裂解物。(B类)内源性miR-126降低VCAM-1蛋白水平，击倒miR-126。用对照寡核苷酸（AS-control）或miR-126反义寡核苷酸（AS-miR-126）转染HUVEC，敲低内源性miR-126.然后培养3天。采集总蛋白并通过VCAM-1免疫印迹分析。(C类)内源性miR-126降低VCAM-1蛋白水平，增加miR-126。用前体R-126寡核苷酸转染HUVEC以增加miR-126，然后培养3天。将1 ng/ml的TNF-α添加16 h。采集总蛋白并通过免疫印迹法分析VCAM-1。(D类)用30 nM AS-miR-126、premiR-126或对照寡核苷酸转染HUVEC，并用TNF-α刺激，免疫印迹如上所述进行。信号强度被量化，并与对照转染细胞进行比较(n个=6±SD；*，P（P）与对照组相比<0.03）。(E类)用对照寡核苷酸或premiR-126处理HUVEC，并用上述TNF-α刺激，用FACS测定VCAM-1的表达(n个=4±SD；*，P（P）< 0.01). (F类)miR-126不影响稳态VCAM-1 mRNA水平。用premiR-126转染HUVEC，用TNF-α处理3h，通过Northern blotting分析VCAM-1的总RNA。(G公司)miR-126不影响VCAM-1 mRNA的稳定性。用预处理R-126转染HUVEC，用TNF-α处理3h，然后暴露于放线菌素D。放线菌素D后不同时间分离RNA，并通过定量RT-PCR分析VCAM-1和GAPDH mRNA水平。
图4。
图4。
miR-126抑制白细胞粘附体外. (A类)用前体R-126或对照寡核苷酸转染HUVEC 2天，然后用TNF-α或对照处理6小时。将BCECF-AM标记的白细胞添加到HUVEC中，在37°C下培养45分钟，然后清洗。用荧光照相机拍摄粘附细胞。(B类)用前体R-126或对照寡核苷酸转染HUVEC 2天，然后用TNF-α或对照处理6小时。将HRP标记的白细胞添加到HUVEC中，在37°C下培养45分钟，然后清洗。裂解粘附细胞，并通过分光光度计在A类450，然后校准为标准曲线(n个=2±SD；P（P）=0.1（0 nM vs.30 nM预混R-126）。(C类)用前体R-126或对照寡核苷酸转染HUVEC 2天，然后用TNF-α或对照处理6小时。用VCAM-1抗体对细胞裂解物进行免疫印迹。(D类)用AS-miR-126或AS-对照寡核苷酸转染HUVEC 2天，然后用TNF-α或对照处理6小时。将HRP标记的白细胞添加到HUVEC中，在37°C培养45分钟，然后清洗。对粘附细胞进行裂解，并用分光光度计在A类450并校准为标准曲线(n个=3±SD；*，P（P）=0.02（0 vs.30 nM AS-miR-126）。(E类)用AS-miR-126或对照寡核苷酸转染HUVEC 2天，然后用TNF-α或对照处理6小时。用VCAM-1抗体对细胞裂解物进行免疫印迹。(F类)用TNF-α或对照处理HUVEC 6小时。将HUVEC与VCAM-1、ICAM-1或对照IgG的抗体在37°C下孵育30分钟。然后将HRP标记的白细胞加入HUVEC，在37°C下孵育45分钟，并洗涤。对粘附细胞进行裂解，并用分光光度计在A类450并校准为标准曲线(n个=3±SD；*，P（P）< 0.02).
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