食管癌是世界上最常见的癌症之一，死亡率居所有癌症的第六位[1]. 食管癌的病理类型包括鳞癌、腺癌和未分化小细胞癌，其中食管鳞癌（ESCC）占大多数[2]. 食管鳞癌以手术为主，辅以化疗和放疗，而晚期食管癌的治疗效果并不理想[三]. 目前，食管癌的辅助诊断方法有五种，包括食管钡剂造影、内镜检查、放射性核素检查、气管镜检查和胸腹部CT检查[4]. 然而，目前主流的诊断手段不能广泛用于筛查早期食管癌患者，导致大多数患者在确诊时已发展到中晚期。以往的研究表明，早期诊断的食管癌患者的预后明显好于中晚期患者[5]. 因此，早期干预食管癌的发展对改善其预后具有重要意义。

包括肿瘤细胞在内的几乎所有细胞都能分泌一种称为外泌体的双脂膜结构，该外泌体内含有来自母细胞的多种核酸分子，包括长非编码RNA（lncRNA）、mRNA和miRNA[6]. 最近的研究表明，外泌体参与细胞迁移[7]，细胞外信息交换[8]肿瘤微环境中的细胞分化和侵袭[9]. 此外，在食管癌、前列腺癌、乳腺癌和其他肿瘤患者的外周血中发现了肿瘤细胞释放的外泌体[10]. LncRNAs是一种长度超过200个核苷酸的RNA分子，没有蛋白质编码功能[11]. 根据以前的研究，lncRNA MALAT-1[12]，PCAT-1[13]和TUG1[14]已证明与ESCC的发生和发展密切相关。类lncRNA XIST的LncRNAs可促进侵袭性肿瘤表型，并与ESCC预后不良相关[15]. 到目前为止，一种多lncRNA已被认可用于ESCC患者的生存预测[16]. 最近，发现一种新的lncRNA，lnc-ABCA12-3，在食管鳞癌组织中过度表达，并可能干扰细胞增殖、侵袭和分化[17]. 然而，ESCC和lnc-ABCA12-3之间的具体关系以及其中的独特机制仍不清楚。

Toll-like receptor 4（TLR4）是先天性免疫应答中的关键分子，在激活促炎性核因子κB（NF-κB）之前识别了病原体相关分子模式和危险相关分子模式[18]. LncRNA在骨关节炎和ESCC中TLR4/NF-κB信号通路的影响下有利于炎症的发展[19，20]. 在某些情况下，ESCC的凋亡是由于线粒体途径的失衡所致[21]. 有趣的是，TLR4激活可以在一定程度上促进线粒体动态失衡和损伤[22]. 此外，糖酵解过度激活可通过线粒体功能和NF-κB/COX-2/VEGF轴介导ESCC的进展和转移[23].

在本研究中，通过基因芯片分析，发现lnc-ABCA12-3在ESCC组织中过度表达。进一步研究表明，lnc-ABCA12-3在食管鳞癌患者血清和血清外泌体中上调。重要的是，外泌体衍生的lnc-ABCA12-3通过调节ESCC中的TLR4/NF-κB信号通路增强了细胞活力和糖酵解，并抑制了细胞凋亡。Lnc-ABCA12-3可能被认为是有利于ESCC早期诊断和治疗的候选靶点。

细胞培养

ESCC细胞系TE-1（affandi-e，X120245）、EC9706（affanda-e，X120243）、HEEC（affaindi-e，X120567）使用提供10%FBS的RPMI-1640培养基（Gibco，Grand Island，NY，USA，11875119）进行常规培养。在培养条件下，细胞在37°C、5%CO的恒温培养箱（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科学公司）中孵化₂。使用总外显子分离试剂分离外显子（Thermo Fisher Scientific，4478359）。然后收集专门的非小体培养基用于其他用途。

患者和样本

收集湖南省肿瘤医院胸二科30例接受姑息性手术切除的食管鳞癌患者的临床资料。从同一患者的癌旁组织（距离肿瘤组织边缘>2.0cm）采集正常组织，术后病理诊断在切除边缘未发现残留癌细胞。血清样本来自ESCC患者和健康志愿者。采集后，将所有样品在液氮罐中冷冻24小时，然后放置在-80°C的冰箱中进行后续实验。根据2009年国际抗癌联盟发布的第7版分期系统标准确定肿瘤分化程度和分期。所有入选患者均签署了知情同意书。所有相关手术均经湖南省肿瘤医院机构伦理委员会批准（批准号：KLL-2020-131），并符合相关规定。

芯片和生物信息学分析

用RNA酶抑制剂RNAiso Plus提取食管鳞癌组织和邻近正常组织的总RNA，并送往上海康诚生物有限公司进行芯片服务。首先从1μg总RNA中去除rRNA和DNA，然后扩增模板并用随机引物反转录成荧光cDNA。将标记的cDNA与Human LncRNA Array v3.0（8×60K；Arraystar，Rockville，MD，USA）杂交，清洗芯片，并使用GenePix4000B芯片扫描仪（Molecular Devices，San Jose，CA，USA，美国）扫描芯片的荧光信号强度。最后，使用GenePix Pro V6.0（分子器件）对原始数据进行分层聚类分析。差异表达基因的筛选条件为：|Fold|≥2，p<0.05，假发现率（FDR）<0.05。

定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）

使用TRIzol试剂（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德生命科技公司）提取总RNA。然后使用HiScript 1st Strand cDNA合成试剂盒（R111-01；Vazyme，中国南京）逆转录RNA。qRT-PCR使用AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Q511-02；Vazyme）执行。引物序列如下：GAPDH正义引物5’-ACAGCCTCAAGATCATCAGC-3’和反义引物5‘-GGTCATGAGTCCTTCCACGAT-3’，lnc-ABCA12-3正义引物5'-TGTGTCCCCCATCCAGT-3’和反义引物5’-GCACCACTTGCCACTCTCTC-3’。GAPDH用作内部参数。2^-ΔΔCt计算相对mRNA表达水平。

慢病毒与细胞转染

将lnc-ABCA12-3的短发夹RNA（shRNAs）构建到慢病毒载体（GeneChem，Shanghai，China）中，并定位空白转染作为阴性对照。针对lnc-ABCA12-3的序列如下：5'-CAAGATGCAAAGAAACAT‐3'。根据制造商的方案，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）将慢病毒载体中的shRNA转染到细胞中。用qRT-PCR评价转染效率。

细胞增殖试验

使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8，Beyotime Biotechnology，中国上海）和EdU试剂盒（C10310-1，RiboBio，中国广州）评估细胞增殖。对于CCK-8分析：1×10⁴/将ml单细胞悬液接种于96孔培养板中，每孔100μl，分别培养0、24、48和72h。丢弃原始培养基，向每个孔中添加100μl 10%CCK-8溶液2 h。然后使用微孔板阅读器（Thermo Fisher Scientific）在450 nm处测量吸光度。每组重复实验3次。

糖酵解途径分析

葡萄糖氧化酶法[24]用于测量葡萄糖浓度并计算其消耗量。每组重复实验3次，取平均值。ATP检测试剂盒（S0026；Beyotime Biotechnology）用于测量细胞内ATP生成量。丢弃细胞培养基，裂解细胞以获得细胞悬浮液，然后添加反应底物并测量荧光值。用高效阴离子交换色谱法检测合成的乳糖[25，26].

细胞凋亡检测

转染48h后，各组细胞在4℃、1000r/min离心5min后，用PBS洗涤两次，细胞浓度调节为1×10⁶/毫升。按Annexin V/PI试剂盒说明书进行染色，流式细胞仪检测细胞凋亡。每组中的细胞进行三重测试。

蛋白质印迹

在进行等量SDS-PAGE之前，使用RIPA试剂（Beyotime Biotechnology）提取总蛋白含量。转移后，在室温下用5%脱脂奶粉在PBST中封闭膜1小时。然后，分别在4°C下用1:1000稀释的抗Bcl-2（Abcam，Cambridge，MA，USA，ab182858）、抗Bax（Abcam，ab32503）、抗Caspase-3（Abcan，ab32351）、抗裂解Caspase-2（Abca姆，ab32042）和抗GAPDH（Abcam-ab8245）对细胞膜进行过夜免疫染色。用PBST清洗膜，并与相应的辣根过氧化物酶结合1:5000山羊抗小鼠二级抗体孵育。使用MiniChemi成像系统（中国广州SINSAGE）和ImageJ软件（美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院）测量和分析谱带。

统计分析

对于本研究中的三个或更多独立试验，数据以平均值±标准偏差（SD）表示。使用Student t检验的因子分析（两组）和方差分析（多组）确定显著差异。采用SPSS 22.0软件（IBM Co.，Armonk，NY，USA）进行统计分析。p<0.05被视为显著，并在条形图中以星号表示。

Lnc-ABCA12-3在ESCC组织和细胞中高表达

初步检测食管鳞癌组织和邻近正常食管组织lncRNA表达谱。火山图描述了lncRNAs表达变化在食管鳞癌组织和正常邻近组织中的差异分布。图中红色和蓝色区域点代表表达变化大于2且p值小于0.05的lncRNA(图1A). 热图显示了上调或下调的前10个差异表达lncRNA(图1B). 如qRT-PCR结果所示，与邻近正常食管组织相比，lnc‐ABCA12‐3在食管鳞癌组织中显著过度表达(图1C). 此外，与正常对照组相比，患者血清和血清外泌体中lnc‐ABCA12‐3的表达均明显升高(图1D、E). ESCC细胞系TE-1和EC9706用于以下目的在体外根据其高于HEEC细胞系的lnc‐ABCA12‐3表达水平进行测试(图1F).

图1。 Lnc-ABCA12-3在食管鳞癌组织、血清（外泌体）和细胞中过度表达。（A） ESCC和邻近正常组织微阵列中lncRNA表达差异分布的火山图。（B） 差异表达lncRNAs的前10个上调和下调显示在热图中。（C） 用RT-PCR检测正常组织和肿瘤组织中Lnc-ABCA12-3的水平**p<0.01与正常组织组。（D） 采用RT-PCR法测定健康人和食管鳞癌患者血清中Lnc-ABCA12-3水平。^##p<0.01与。对照组。（E） 采用RT-PCR检测健康人和食管鳞癌患者血清外泌体Lnc-ABCA12-3水平。^&&p<0.01与。对照组。（F） 通过RT-PCR评估HEEC、TE-1和EC9706细胞中Lnc-ABCA12-3的水平。^{^^}p<0.01与HEEC组。数据表示为平均值±标准偏差。

lnc-ABCA12-3下调抑制ESCC细胞的增殖和糖酵解，同时促进细胞凋亡

为了研究lnc‐ABCA12‐3在ESCC中的功能，使用shRNA下调TE-1和EC9706细胞中的lnc∙ABCA12-3。结果表明，与sh-NC组和空白对照组相比，sh-ABCA12‐3组中lnc鄄ABCA12-3的表达显著降低(图2A). 值得注意的是，下调lnc-ABCA12-3后，sh-ABCA12-3组在TE-1或EC9706细胞中的增殖和糖酵解均受到明显抑制(图2B–G)而细胞凋亡则达到显著水平(图3A、B). 为了揭示lnc-ABCA12-3与ESCC之间的可能相关性及其潜在机制，检测了线粒体凋亡相关蛋白和TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白。结果表明，在TE-1和EC9706细胞中，Bcl-2的表达受到抑制，而Bax和裂解caspase-3的表达水平增强(图3C、D). TLR4/NF-κB信号通路中，TLR4、P-IκBa和P-NF-kb B均下调(图4).

图2。 敲除lnc-ABCA12-3抑制食管鳞癌（ESCC）细胞的增殖和糖酵解。（A） sh-ABCA12-3转染后，通过RT-PCR检测lnc-ABCA12-3的表达。（B） 采用CCK-8法检测ESCC细胞的活性。（C，D）用EdU法检测细胞增殖。比例尺，20μm。（E–G）用相应的商业试剂盒测试ATP含量、葡萄糖摄取量和乳酸生成量。数据以平均值±标准偏差表示。**p<0.01与.sh-NC组。

图3。 敲除lnc-ABCA12-3可促进食管鳞癌细胞的凋亡。流式细胞术检测（A，B）ESCC细胞凋亡。（C，D）Western blot检测Bax、Bcl-2、caspase-3、裂解caspase-2的表达。数据以平均值±标准偏差表示。**p<0.01与.sh-NC组。

图4。 lnc-ABCA12-3失活的toll样受体4（TLR4）/核因子κB（NF-κB）信号通路的敲除。（A，B）Western blot检测TLR4、IκBα、p-IκBα、NF-κB、p-NF-κ的表达。数据以平均值±标准偏差表示。**p<0.01与.sh-NC组。

Lnc ABCA123通过调节TLR4/NF-κB信号通路促进ESCC细胞增殖和糖酵解，抑制细胞凋亡

为了探讨lnc-ABCA12-3对ESCC的影响机制，将TE-1细胞的sh-NC和sh-ABCA12-3分别用TLR4的特异性激活剂脂多糖（LPS）（S1732；Beyotime Biotechnology）处理[27]. 结果表明，在TLR4激活剂的作用下，TE-1可以在一定程度上促进细胞增殖，并且可以消除sh-lnc-ABCA12-3诱导的细胞增殖抑制(图5A-C). TLR4激活剂能促进细胞糖化，但对细胞凋亡影响不显著。此外，与对照组相比，TLR4激活剂能明显减轻糖抑制和细胞凋亡加速(图5D–H). 在线粒体凋亡相关蛋白中，与sh-ABCA12-3组相比，sh-ABCA2-3+TLR4激活剂组中Bcl-2的表达增强，Bax和裂解caspase-3的表达显著降低。与sh-NC组相比，TLR4激活剂组的Bcl-2表达部分升高(图6A). 对于TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白，与sh-NC组相比，TLR4激活剂组的TLR4、p-IκBa和p-NF-κB的表达水平明显上调。然而，与sh-ABCA12-3组相比，sh-ABCA12-3+TLR4激活剂组的表达水平显著提高(图6B).

图5。 Lnc-ABCA12-3调节增殖、糖酵解和凋亡通过激活TLR4。（A） 采用CCK-8法检测食管鳞癌（ESCC）细胞的活性。（B，C）用EdU法检测细胞增殖。比例尺，20μm。（D–F）用相应的商业试剂盒测试ATP含量、葡萄糖摄取量和乳酸生成量。流式细胞术检测（G，H）ESCC细胞凋亡。数据以平均值±标准差表示。TLR4，toll样受体4；脂多糖**p<0.01与.sh-NC组，^##p<0.01与.sh-ABCA12-3组。

图6。 lnc-ABCA12-3对LPS处理的食管鳞癌（ESCC）细胞线粒体凋亡途径和toll-like receptor 4（TLR4）/nuclear factor kappa-B（NF-κB）途径的影响。（A） Western blot检测Bax、Bcl-2、caspase-3、裂解caspase-2的表达。（B） Western blot检测TLR4、IκBα、p-IκB-α、NF-κB、p-NF-κ的表达。数据表示为平均值±标准偏差。LPS、脂多糖**p<0.01与.sh-NC组，^##p<0.01与.sh-ABCA12-3组。

外体介导lncABCA12-3在ESCC细胞中的作用

为了进一步研究lncABCA12-3对ESCC的作用方式，TE-1细胞仍被使用，并与自身分离的外泌体一起处理，有或没有sh-lncABCA12-2。结果显示，lncABCA12-3的表达水平在对照组（TE-1细胞经PBS处理）、TE-1-exo组（TE-1cells经TE-1细胞的exosomes处理）、CM组（TE-1-cells经无exosome的条件培养基处理）、，sh-NC-TE-1-exo组（TE-1细胞由sh-NC转录的TE-1细胞的exosomes处理）和sh-ABCA12-3-TE-1-exa组（TE-1cells由sh-ABCA2-3转录的TE-1cell的exosumes处理）。与对照组相比，TE-1-exo组lncABCA12-3表达增加，而exosome的消除或sh-ABCA12-3的沉默减弱了这种影响(图7A). 与对照组相比，TE-1-exo组的细胞增殖和糖酵解显著增强，而exosomes的消除逆转了这种作用。此外，与sh-NC-TE-1-exo组相比，sh-ABCA12-3-TE-1-exo-组的细胞增殖和糖酵解均受到抑制(图7B–G). 对于线粒体凋亡相关蛋白，在外体发生的情况下，Bcl-2的表达得到改善，而Bax和裂解caspase-3的表达同时受到抑制。然而，一旦lncABCA12-3被击倒，效果就恢复了(图8A). 在TLR4/NF-κB信号通路中，与对照组相比，在外显体（TE-1-exo组）的作用下，TLR4、p-IκBa和p-NF-kb B的表达水平均被促进。当lncABCA12-3下调后，这种状态可以逆转(图8B).

图7。 Lnc-ABCA12-3在外泌体介导下与食管鳞癌（ESCC）细胞发挥作用。（A） 用转染或不转染sh-ABCA12-3的TE-1细胞的外泌体处理后。通过RT-PCR检测Lnc-ABCA12-3的表达。（B） 采用CCK-8法检测ESCC细胞的活性。（C，D）通过EdU测定法检测增殖。比例尺，20μm。（E–G）通过相应的商业试剂盒测试ATP含量、葡萄糖摄取和乳酸生产。数据以平均值±标准偏差表示。**p<0.01与.对照组，^##p<0.01与.TE-1-exo组，^&&p<0.01与.sh-NC-TE-1-exo组。

图8。 Lnc-ABCA12-3在外泌体介导下调节线粒体凋亡途径和toll样受体4（TLR4）/核因子κB（NF-κB）途径。（A） Western blot检测Bax、Bcl-2、caspase-3、裂解caspase-2的表达。（B） Western blot检测TLR4、IκBα、p-IκB-α、NF-κB、p-NF-κ的表达。数据以平均值±标准偏差表示。**p<0.01与.对照组，^##p<0.01与.TE-1-exo组，^&&p<0.01与.sh-NC-TE-1-exo组。

食管鳞癌是国内流行的恶性肿瘤，临床检查以食管镜和胃镜为主。然而，由于这些方法的特殊性，大多数早期无症状患者很少需要进行这种检查。其他检测方法，如p53血清学标记物检测和癌胚抗原筛查，敏感性和特异性较低，使ESCC的早期诊断更加困难[28]. 以往的研究较好地揭示了食管鳞癌的病理生理机制，从而进一步阐明了食管鳞状细胞癌的发病机制，发现了一种无创、有效、敏感、高度特异的临床检测方法，对食管鳞癌早期筛查、预后判断和靶向治疗具有重要意义。

LncRNAs在多种肿瘤中异常表达，并与其发生发展密切相关，因此一直是一种潜在的生物标志物。利用肝细胞癌特异性cDNA芯片技术，发现lncRNA HULC在肝细胞癌组织和血清中高表达，并且HULC的表达受到干扰后，一些肝细胞癌相关基因的表达发生了变化[29]. 此外，lncRNA PCGEM1的增加表达也可以促进前列腺癌细胞的增殖[30]. 近年来，lncRNAs在食管鳞癌中的表达谱也备受关注，这为阐明食管鳞癌发生发展的分子机制提供了一定的依据。例如，CASC9和LINC01980可以作为ESCC进展的促进者[31，32]. LncRNA PART1在食管鳞癌的吉非替尼耐药性的其他方面发挥作用[33]. Lnc-ABCA12-3是一种新发现的lncRNA，曾被证实在纤维连接蛋白1的影响下促进ESCC细胞的侵袭、迁移和增殖[34]. 然而，lnc-ABCA12-3在ESCC中的其他独特作用有待进一步探讨。本研究检测了食管鳞癌组织和邻近正常食管组织的lncRNA表达谱，lnc-ABCA12-3在食管鳞癌肿瘤组织、患者血清和血清外泌体中表达较高。LncRNA PEG10在43例食管鳞癌组织中高表达，与淋巴结转移和组织分化呈正相关，下调后肿瘤增殖和浸润受到抑制[35]. 为了揭示lnc-ABCA12-3在ESCC中的作用，在TE-1和EC9706细胞中沉默lnc-ABCA 12-3。抑制细胞增殖和糖酵解，促进细胞凋亡。多个lncRNA，如GAS5[36]，MEG3[37]和SNHG20[38]可以通过干扰线粒体凋亡途径来加速肿瘤细胞凋亡。本研究还检测了线粒体凋亡相关蛋白，Bcl-2的下调和Claved caspase-3的高表达表明lnc-ABCA12-3敲除后TE-1和EC9706细胞的凋亡可能与线粒体凋亡有关。

先前的研究表明，lncRNA FTH1P3可以通过NF-κB途径调节ESCC的转移和侵袭，TGF-β诱导的NKILA也可以以同样的方式抑制ESCC细胞的迁移和侵袭[39，40]. 为了研究lnc-ABCA12-3对ESCC影响的可能机制，检测了TLR4/NF-κB信号通路中的关键蛋白，其中TLR4、P-IκBa和P-NF-κB的表达增强。这通过调节TLR4/NF-κB信号通路支持lnc-ABCA12-3对ESCC的功能。为了进一步证实这一假设，如之前执行的一样，进行了TLR4激活模型[41]. TLR4激活剂可以促进细胞增殖，并补偿lnc-ABCA12-3敲低导致的线粒体凋亡途径和TLR4/NF-κB信号通路中糖酵解和蛋白表达的抑制。LncRNAs一直以来都是基于其在外显子中的特征而作为一种生物标记物[42]. 已证明LncRNA PART1在外泌体介导下可诱导ESCC对吉非替尼耐药通过作为竞争性内源性RNA发挥作用[33]. 为了弄清楚lnc-ABCA12-3对ESCC的作用方式，提取具有较高lnc-ABCA12-3水平的外泌体，并用ESCC细胞处理。如结果所示，ESCC的增殖和糖酵解显著增加，细胞凋亡受到抑制，逆转为lnc-ABCA12-3敲除状态。此外，在lnc-ABCA12-3沉默后，这些良好的表现可能会再次被消除。在心脏成纤维细胞中，来自缺氧心肌细胞的外体lncRNA AK139128可促进细胞凋亡并抑制细胞增殖[43]. 这与我们对lnc-ABCA12-3的研究结果一致。在本研究中，lnc-ABCA12-3在ESCC中的功能主要集中在TLR4/NF-κB信号通路上，因为它与肿瘤的发生发展具有相关性[44]. 然而，ESCC中的lnc-ABCA12-3方面是否采用这种单一的方式还有待讨论，我们的结果需要更多的验证体内作为支持。这些将是我们今后工作的重点。

综上所述，从众多异常表达的lncRNAs中筛选出lnc-ABCA12-3，并证明其通过调节TLR4/NF-κB信号通路促进ESCC的增殖和糖酵解，同时抑制细胞凋亡。lnc-ABCA12-3对ESCC的影响是在外泌体的介导下进行的。

没有。

本研究得到贵州省科学技术基金（黔科合J-ZK[2021]通465）、遵义医科大学博士创业基金（元字[2020]08号）、贵州省卫生委员会（gzwjkj2020-108）的资助。

作者声明没有利益冲突。