本文在以下内容中提到：

介绍

视网膜母细胞瘤是最常见的眼内疾病威胁儿童健康的恶性肿瘤，影响1:15000-1:20000活产(1).目前视网膜母细胞瘤的治疗包括化疗、斑块放射治疗、外照射放射治疗、冷冻治疗和手术(2). 然而，尽管临床上应对这些综合策略、肿瘤转移和晚期眼外侵犯仍会导致儿童(三,4). 因此，调查视网膜母细胞瘤发生的潜在机制发展是提高疗效的必要条件。

越来越多的文献报道微环境调节肿瘤进展和转移(5,6). 巨噬细胞是可塑细胞响应环境信号的多种生物活性。干扰素和TLR配体可使巨噬细胞功能朝向M1表型（高水平的促炎因子），而IL-4和IL-13激活M2表型（组织重塑和促进肿瘤进展）(7). 这个肿瘤微环境可诱导巨噬细胞采用a致瘤状态(7). IL-6，TNF-α和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）在常驻肿瘤相关巨噬细胞（TAM）或来自外部贮存器的巨噬细胞，如骨骼骨髓（BM）和脾脏(8,9). TAM有助于矩阵分解和肿瘤细胞运动(10).然而，肿瘤细胞激活这些细胞的机制定义不明确。

外泌体（EXOs）是由内吞作用衍生的小由蛋白质组成的膜泡（40–150 nm），脂质、微RNA（miRNA/miR）和被磷脂包围的mRNA双层，分泌到细胞外空间(11). 越来越多的研究已经证明EXO和其他细胞外囊泡由肿瘤细胞在细胞间通讯中起着重要作用(12–16). EXO可以绑定到目标细胞，融合并将其内容物转移到介导细胞间通讯。此外，肿瘤衍生EXO可以促进肿瘤恶性化(17).此外，以前的报告已经证实肿瘤衍生的EXO有助于建立转移前生态位和通过以下方式在远处转移部位生成致癌微环境调节基质细胞和重塑细胞外基质(18,19).

然而，关于视网膜母细胞瘤细胞EXO在肿瘤中的可能功能进展。根据上述证据本研究旨在确定视网膜母细胞瘤细胞的作用EXO以阐明视网膜母细胞瘤恶化。

材料和方法

细胞培养

WERI-Rb1人视网膜母细胞瘤细胞（美国型培养物收集）在RPMI-1640（Gibco；ThermoFisher Scientific，Inc.），含10%胎牛血清（FBS；Gibco；赛默飞世尔科技公司）。小鼠巨噬细胞RAW264.7（中国科学院类型培养细胞库科学）在DMEM（Gibco；Thermo Fisher Scientific，含10%FBS的骨髓间充质干细胞（BMSCs）从C57小鼠获得，从第4-6代获得的骨髓间充质干细胞培养于使用含10%FBS的DMEM（8×104/ml）。这些细胞在含1%混合物的增湿空气中培养O（运行）2，5%一氧化碳2和94%N237°C时。

初级BMSC隔离

从C57 BL/6的骨髓中分离出骨髓间充质干细胞使用上述方法的小鼠(20). 简单来说，4-6周龄C57 BL/6小鼠通过腹腔注射戊巴比妥（30毫克/千克；猫。编号P3761，Sigma-Aldrich；默克（Merck KGaA），然后因颈椎脱位、胫骨和股骨而死无菌分离。DMEM用于冲洗骨髓用无菌的25号针头和挤压出来的骨髓细胞通过70µm细胞过滤器（BD Biosciences）过滤在37°C下以1000×g离心5分钟。骨髓细胞是用含有10%FBS的DMEM重新悬浮，并镀入烧瓶。用0.25%胰蛋白酶/1 mM EDTA处理细胞2分钟，直到细胞达到90%的融合。培养基已更换每3天。经过3-4代后，将分离的细胞用于实验。

EXO的分离、表征和治疗

EXO从WERI-Rb1衍生的条件培养基（从含有RPMI-1640和10%的48小时细胞培养物中收集如前所述，通过超速离心去除外泌体FBS）(21). FBS已耗尽EXO在4°C条件下，在110000×g下过夜进行超速离心。之后48h，条件培养基以1000×g离心5次min，然后10000×g持续30 min，然后上清液以100000×g，持续90分钟。所有离心操作均在4°C下进行。执行官用磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗，然后以100000×g进行超速离心90分钟4°C，然后EXO在PBS中重新悬浮根据以前的方法(22)，这是单个荧光标记EXO通过的成像压力驱动流动中的纳米通道(23). 最后，蛋白质浓度为使用双茚二酸蛋白检测试剂盒（Beyotime生物技术研究所）。

通过透射电子显微镜观察EXO（FEI Tecnai Spirit G2；赛默飞世尔科技公司），根据到以前的方法(21).简单地说，将新分离的EXO颗粒转移到铜中在30µl滴1%戊二醛中涂上碳5次的格栅min，然后用蒸馏水清洗格栅。网格用4%醋酸铀溶液在37°C下染色10分钟，然后用50µl滴甲基纤维素处理5分钟冰。然后，用蒸馏水清洗格栅并进行观察在80 Kv的透射电子显微镜下。

对于EXO标记，EXO被荧光标记使用PKH26膜染料（Sigma-Aldrich；Merck KGaA），根据到以前的方法(24).简单地说，将EXO重新悬浮到1 ml稀释剂C和6µl PKH26中在室温下添加染料5min。然后，反应是通过添加2 ml 10%BSA（目录号0332；Amresco，LLC）进行淬火然后在100000×g下超速离心2小时以去除过量染料。

BMSC和WERI-Rb1共同培养

对于共培养实验，BMSCs(4×104)用PBS或EXO处理后，在24孔中电镀盘子。WERI-Rb1细胞（4×104)被暂停不含EXO-的培养基，接种到具有0.4-µm孔的Transwell培养箱中尺寸插入物（BD Biosciences）。BMSCs和WERI-Rb1的活性24小时后使用CCK-8分析评估细胞。BMSC RNA为提取用于RT-qPCR分析。

细胞活力测定

WERI-Rb1细胞和RAW264.7的活性使用细胞检测用EXO或PBS处理的巨噬细胞计数试剂盒-8（CCK-8）分析（Dojindo Molecular Technologies，股份有限公司）。每组细胞用CCK-8试剂孵育3h37°C时。最后，在450 nm处评估吸光度记录。

逆转录-定量（RT-q）PCR分析

WERI-Rb1细胞、RAW264.7细胞和用三唑提取骨髓间充质干细胞®试剂（Invitrogen；赛默飞世尔科技公司）。总RNA（1µg）使用PrimeScript™RT试剂盒（Takara生物技术有限公司），遵循制造商的协议。用三唑提取外泌体总RNA®试剂（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）和Dr GenTLE™沉淀载体（Takara Biotechnology Co.，Ltd.）。总RNA（1µg）使用Mir-X™miRNA进行逆转录第一股合成试剂盒（Takara生物技术有限公司），遵循制造商的协议。RT-qPCR是用罗氏480系统上的SYBR Prime Script RT-PCR试剂盒（罗氏诊断）。PCR条件如下所示：94°C持续5分钟，然后进行40次94°C循环30秒，62℃30秒，72℃30秒。相对目标基因表达使用2-ΔΔCq方法(25)并标准化为b-actin、GAPDH或miR-16的内源性表达。的引物mRNA和miRNA检测列于表SI和SII公司分别是。

免疫荧光分析

细胞或组织切片（肿瘤、脾脏和肝脏）用4%多聚甲醛固定（37°C下10分钟），然后在37°C下用1%BSA和0.2%Triton X-100封堵30分钟。将样品与初级抗体在4°C下孵育过夜，包括针对自然杀伤（NK）细胞的抗CD49b抗体（1:100；分类号。14-5971-85; Invitrogen；赛默飞世尔科技公司），抗CD45白细胞（1:100；分类号sc-1178；圣克鲁斯生物技术，Inc.），针对巨噬细胞的抗CD68（1:100；目录号BA3638；武汉博斯特生物科技有限公司），抗Ki-67增殖细胞（1:500；目录号MA5-14520；Thermo FisherScientific，Inc.），用于侵袭性肿瘤细胞的抗波形蛋白（1:100；猫。编号：sc-6260；圣克鲁斯生物技术公司）。清洗后用PBS对样品进行适当的Alexa染色37°C下氟结合二级抗体1小时（Alexa Fluor555抗兔lgG，1:500，猫。编号4413；Alexa Fluor 488公司抗兔lgG，1:500，猫。编号4412；Alexa Fluor 488抗鼠lgG，1:500，猫。编号4408；全部从Cell Signaling购买科技公司）。使用荧光捕捉图像显微镜（Axio Imager Z1；卡尔蔡司公司；放大倍率，×100).

细胞免疫荧光染色定量通过分析阳性像素的分数或数量使用ImageJ软件（1.51版；国家卫生研究院）。在之前的研究中使用了该方案(26). 简而言之，这些图像二值化为黑色和白色，具有共同的阈值级别，例如白色像素代表阳性细胞，并通过以下公式进行量化使用GraphPad Prism系统7进行直方图分析软件公司）。每只小鼠至少使用五个随机切片用于量化。

蛋白质印迹

提取细胞和EXO的全蛋白使用RIPA裂解试剂盒（Beyotime生物技术研究所）。这个蛋白质浓度通过BCA分析测定（Beyotime生物技术研究所）。每个样品的总蛋白质（30µg）通过10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶分离电泳，然后转移到聚亚乙烯二氟膜。用5%的BSA封闭膜2小时37°C，然后与一级抗体在4°C孵育过夜。使用以下主要抗体：抗-GAPDH（1:10000；猫。编号10494-1-AP；ProteinTech Group，Inc.），抗Tubulin（1:1000；目录号sc-5274；圣克鲁斯生物技术公司），抗CD63（1:1000；分类号EXOAB-CD63A-1；Systems Biosciences，LLC），抗肿瘤易感基因101蛋白（1:1000；cat。编号ab125011；Abcam），抗CD9（1:1000；目录号13403；细胞Signaling Technology，Inc.），抗热休克70 kDa蛋白1A（1:1000；目录号4873；Cell Signaling Technology，Inc.），抗增殖细胞核抗原（PCNA；1:1000；分类号。13110; Cell Signalling Technology，Inc.），抗Bax（1:1000；cat。编号2772；Cell Signaling Technology，Inc.），抗Bcl-2（1:1000；猫。编号A00040-1；武汉博斯特生物科技有限公司），抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（1:1000；分类号9662；细胞信号技术，公司），抗C-X-C趋化因子受体4型（CXCR4；1:1000；cat。编号：ab124824；Abcam），抗MMP2（1:1000；目录号10373-2-AP；ProteinTech Group，Inc.）和抗血栓反应蛋白-1（TSP-1；1:1000；猫。编号：ab1823；Abcam）。然后将膜与HRP-结合抗鼠IgG（1:3000；目录号7076s；细胞Signaling Technology，Inc.）或抗兔IgG（1:10000；目录号。7074秒；Cell Signaling Technology，Inc.）在37°C下持续1小时用增强化学发光法观察到了斑点系统（赛默飞世尔科技公司）。使用GAPDH或Tubulin作为加载控件。带强度半定量为ImageJ软件（1.51版；美国国立卫生研究院）。

小鼠异种移植模型视网膜母细胞瘤

总共20只雌性裸鼠（4-6周old）在左侧颌下腺区域皮下注射使用300µl WERI-Rb1电池（1×107)与Matrigel混合（18 mg/ml，体积/体积，1:1）。皮下注射WERI-Rb1细胞后一周注射，成功移植小鼠（肿瘤体积>200毫米三)随机分为两组（n=10）皮下注射等量的PBS或EXO（75µg）每3天进入原发肿瘤部位，持续15天。这个测量小鼠的肿瘤大小，肿瘤体积为按长度×宽度计算2/每5天2次。老鼠通过腹腔注射戊巴比妥（30mg/kg），15天后死于颈椎脱位PBS或EXO注入。采集肿瘤、脾脏和肝脏并储存在−80°C。假冒手术，不包括将肿瘤细胞、PBS和EXO注射到三个雌性裸鼠（4-6周龄）。

道德声明

共23只雌性裸鼠（年龄4-6周；体重，16-18 g）和四只C57 BL/6小鼠（年龄，4-6周；体重，16–20 g）从眼科动物实验室获得，中山大学中山眼科中心（广州，中国）。所有动物实验均遵守ARVO声明动物在眼科和视觉研究中的应用(27)并由中山市眼科机构动物护理与使用委员会中心【批准号SYXK（YUE）2018-101、2018-168、2019-009】。这个老鼠可以自由获取食物和水，并在空调房间（16-26°C和40–70%).

统计分析

数据表示为平均值±标准偏差，平均值之间的差异使用学生的双尾t检验（针对两组）或方差后跟Tukey的post-hoc（适用于多组比较）。P<0.05被认为是统计学上的差异显著。

结果

WERI-Rb1细胞产生的EXO提高细胞活力

WERI-Rb1细胞生长在松散的葡萄状簇和在无EXO培养基中培养(图。第1页). EXO是从细胞中分离出来的，如材料和方法部分，并在传输下观察电子显微镜。囊泡直径约为30–100 nm(图1B). NanoFCM跟踪分析还表明来自WERI-Rb1细胞的外泌体，范围从50到150 nm平均尺寸约为77nm(图1C).此外，已知的外源性推测标记，包括HSP70，通过western blotting鉴定TSG101、CD9和CD63(图1D). 确定EXO是否可以影响视网膜母细胞瘤细胞的生长，WERI-Rb1细胞与用PKH26（红色）标记的EXO一起孵育。如所示图1E，EXO被培养24小时后的WERI-Rb1细胞。CCK-8分析显示用来源于与对照组（PBS，0.122±0.002；EXO，0.145±0.005；*P<0.05；图1F). 然而，mRNAVEGF、PCNA和CXCR4的表达水平，可用于预测癌细胞恶性程度(28–30),未受EXO影响[无显著性（ns）；图1G]。这些数据表明EXO来源于WERI-Rb1细胞对恶性肿瘤在体外.

图1。 WERI-Rb1细胞产生的EXO略微提高细胞活力。（A） 松散的葡萄状簇WERI-Rb1细胞。比例尺，100µm。（B） 代表性传输WERI-Rb1 EXO的电子显微镜图像。的直径囊泡在30～100nm之间。比例尺，100 nm。（C）纳米流式细胞术追踪分析表明WERI-Rb1细胞产生的EXO的分布和数量范围50至150nm，平均尺寸约77nm。（D） 蛋白质印迹不同蛋白标记物（HSP70、CD9、TSG101和CD63）的分析从WERI-Rb1细胞中收集的EXO。（E） 标有PKH26的EXO被WERI-Rb1细胞吞噬。比例尺，20µm。（F） PBS或EXO添加到WERI-Rb1细胞中，WERI-Rb1细胞活力为使用细胞计数试剂盒-8测定（红色，PKH26；蓝色，DAPI）。（G） 逆转录定量PCR显示VEGF、PCNA的mRNA水平无显著差异PBS和EXO组中的CXCR4。数据来自三个独立实验*P<0.05。EXO，外显体；ns，否显著性；HSP70、热休克70kDa蛋白1A；增殖细胞核抗原，增殖细胞核抗原；CXCR4，C-X-C趋化因子受体类型4；RB，视网膜母细胞瘤。

来源于WERI-Rb1细胞的EXO影响巨噬细胞和骨髓间充质干细胞的抗肿瘤活性体外

为了揭示EXO对免疫细胞的影响，RAW264.7细胞巨噬细胞特异性免疫功能(31)，与来自WERI-Rb1细胞标记PKH26（红色）。孵育6小时后，EXO可被RAW264.7细胞吸收。PKH26部分与CD68（绿色，巨噬细胞的特异标记；图2A). 此外，细胞由圆形变为纺锤形，具有分枝形态(图2B)，这表明巨噬细胞被激活。然而，EXO显著增加IL-6和MCP-1水平（相对折叠变化：IL-6，2.30±1.11倍；MCP-1为1.43±0.43倍*P<0.05）。增加IL-6和MCP-1的表达表明巨噬细胞被EXO抑制，这与以前的研究(6). 没有PBS和EXO之间TNF-α表达的显著差异组（相对折迭变化：1.16±0.28倍；ns；图2C). 据推测，TNF-αRAW 264.7细胞早期反应中的表达没有改变至EXO（24小时）。因此，EXO治疗也导致RAW264.7细胞增殖减少（PBS，0.949±0.271；EXO，0.303±0.124; *P<0.05；图。二维).

图2。 WERI-Rb1细胞产生的EXO影响巨噬细胞和骨髓间充质干细胞的抗肿瘤活性体外试验。（A） 标有PKH26的EXO被RAW264.7吞没细胞。（绿色，CD68；红色，PKH26）。比例尺，20µm。（B） 形态学EXO处理后RAW264.7细胞的变化。比例尺，50微米。（C） 白细胞介素-6、单核细胞趋化因子-1和肿瘤坏死因子-α表达的RT-qPCR分析RAW264.7细胞与来自WERI-Rb1细胞的EXO孵育24 h（D）Cell Counting Kit-8分析显示RAW264.7细胞EXO显著降低了存活率。（E） WERI-Rb1细胞和BMSCs共培养系统中，用PBS或EXO处理的BMSCs与WERI-Rb1细胞共培养24小时（F）RT-qPCR分析共培养BMSCs中IL-6、MCP-1和TNF-α的表达系统。（G） WERI-Rb1细胞和来自共培养体系。数据来自三个独立的实验。*与PBS组相比，P<0.05。EXO，外显体；ns，无显著性；RT-qPCR、逆转录定量PCR；BMSC，骨髓间充质干细胞；MCP-1，单核细胞趋化蛋白-1；RB、，视网膜母细胞瘤。

评估EXO对BMSCs和WERI-Rb1细胞，一个共同培养系统用于模拟视网膜母细胞瘤的生理条件。主要骨髓基质干细胞为用PBS或EXO孵育，并与WERI-Rb1细胞共培养24小时(图2E). 如所示图2F，EXO可以显著增加BMSCs中IL-6和MCP-1的表达水平（相对折叠变化：IL-6，7.54±1.50倍；MCP-1，7.62±1.39倍；*P<0.05），可促进肿瘤生长和转移(32,33). 同样，没有显著的PBS组和EXO组TNF-α表达的差异骨髓间充质干细胞（相对折叠变化：0.66±0.26倍；ns）。此外WERI-Rb1细胞的活性显著提高（PBS，0.14±0.03; EXO，0.21±0.02*在共培养体系中，而BMSC的生存能力不受EXO的影响（PBS，0.42±0.05; EXO，0.46±0.02；纳秒）(图。2G（2G）).

综合来看，这些发现表明来自WERI-Rb1细胞的EXO可以抑制抗肿瘤巨噬细胞活性和诱导BMSCs促进视网膜母细胞瘤细胞生长在体外.

WERI-Rb1细胞产生的EXO增加视网膜母细胞瘤的生长

要确认在体外结果，a建立异种移植模型，然后将小鼠定期在肿瘤周围注射EXO或PBS。EXO进入2天后观察到肿瘤组织第10天松散肿瘤组织增加。我们观察到了EXO主要位于肿瘤外的松散组织中，在肿瘤内的致密组织中很少检测到(图3A). 然而，量化肿瘤体积的增长表明EXO治疗显著10天后视网膜母细胞瘤肿瘤体积增加移植（PBS，66±172毫米三; EXO，259±224毫米三; *P<0.05；图3B和C类). 此外，PCNA的蛋白水平显著高于肿瘤中EXO升高（PBS，0.77±0.18；EXO，1.08±0.31；*P<0.05；图3D). 此外，凋亡相关Bcl-2、Bax和caspase-3的蛋白水平检测到。如所示图。第三方，Bcl-2与Bax的比值显著增加（PBS，0.58±0.23; EXO，1.44±0.87*P<0.05），而相对裂解caspase-3的表达降低（PBS，0.28±0.18；EXO，0.17±0.14*EXO组P<0.05）。总之，导出的EXO来自WERI-Rb1细胞可抑制肿瘤凋亡并促进肿瘤生长体内.

图3。 来自WERI-Rb1细胞的EXO是被肿瘤细胞吞噬，促进视网膜母细胞瘤的生长。（A） PKH26标记的EXO（红色）被来自EXO注射后2或10天的肿瘤组织。使用了DAPI染色细胞核。比例尺，50或20µm。（B） 代表异种移植模型15天的宏观外观注射WERI-Rb1细胞后。肿瘤在EXO注射小鼠比PBS注射小鼠。比例尺，1厘米（C）异种移植模型中的肿瘤体积变化。肿瘤与对照组相比，EXO注射组的容量显著增加注射PBS组在注射后10天，而治疗后第15天无显著性差异（n=10）。（D）PCNA蛋白和半定量数据显示，PCNA在肿瘤中的表达增加EXO（n=7）。（E） 代表性的western blot图像Bcl-2、Bax、总半胱氨酸蛋白酶-3和裂解半胱氨酸酶-3蛋白以及半定量数据表明EXO增加了肿瘤，并且Caspase-3裂解为EXO降低了总Caspase-3比率（n=8）*P<0.05与。PBS组。EXO，外显体；增殖细胞核抗原。

来自WERI-Rb1细胞的EXO可以促进视网膜母细胞瘤的恶性化

Ki-67广泛用于测量肿瘤增殖评估癌症患者的预后(34). 波形蛋白，一种中间丝蛋白质，通常被用作侵袭性肿瘤细胞的标记物，因为其在上皮-间充质细胞激活过程中的表达过渡(35). 因此，组织切片用Ki-67抗体和波形蛋白。如所示图4A和B类，相对波形蛋白阳性面积（PBS，11.35±2.43%；EXO，21.04±3.58%; *细胞中Ki-67阳性率为显著增加（PBS，45.41±9.39；EXO，69.20±2.62；*P＜0.05）。此外CXCR4和MMP2的蛋白水平在肿瘤进展中的恶性肿瘤和转移(36,37),显著增加（CXCR4:PBS，0.225±0.088；EXO，0.567±0.238; MMP2:PBS，0.330±0.189；EXO，0.802±0.433*P<0.05；图4C和D).

图4。 WERI-Rb1细胞产生的EXO可促进视网膜母细胞瘤的恶性化。（A） 波形蛋白（绿色）和Ki-67（红色）通过免疫荧光标记。比例150µm。（B） 显示相对阳性的定量数据肿瘤中波形蛋白和Ki-67的面积（n=5）。（C） 蛋白质印迹显示CXCR4和MMP2蛋白在来自PBS注射组和EXO注射组。（D） 半量化肿瘤中CXCR4和MMP2的表达（n=5）。（E） CD68染色（绿色）在PBS注射和EXO注射肿瘤中。比例尺，2 mm或100µm。（F） 定量数据显示CD68阳性细胞EXO注射增加（n=6）。（G） CD49b染色（红色）在PBS注射和EXO注射肿瘤中。比例尺，50µm。（H）定量数据显示CD49b阳性细胞减少（n＝5）*P<0.05和***P<0.001。EXO，外显体；CXCR4，C-X-C趋化因子受体4型。

此外，TAM是肿瘤过滤免疫细胞，在肿瘤中发挥重要作用生长和转移(38,39). 因此，TAM在使用抗CD68抗体染色的整个肿瘤切片(图4E). 因此肿瘤组织中CD68阳性区域显著增加与对照组织（PBS，1.18±0.41%; EXO，4.50±3.53%*P<0.05；图4F). CD49b标记的NK细胞（红色）包围肿瘤细胞，并且在EXO治疗组中减少组（PBS，14.94±3.77；EXO，3.66±2.29；***P<0.001；图4G和H). 因此，这些结果也部分支持上述结果证明来自WERI-Rb1细胞的外泌体促进肿瘤生长和恶性肿瘤。

WERI-Rb1细胞产生的EXO抑制体内固有免疫

尽管裸鼠免疫缺陷在本研究中使用，小鼠仍表现出完整先天免疫和适应性免疫。因此，对脾脏进行分析确定EXO是否影响免疫过程。值得注意的是，它是发现EXO在2天后可以扩散到脾脏在第10天继续累积(图。5A和B). 在CD68阳性的巨噬细胞中也观察到EXO在脾组织中(图5C).

图5。 WERI-Rb1细胞产生的EXO抑制体内固有免疫。PKH26 EXO（红色）由脾组织细胞内化（A）2或（B）10天EXO注入后。比例尺，50或20µm。（C） EXO标记PKH26被脾脏中CD68阳性巨噬细胞吞噬（绿色，CD68；红色，PKH26；蓝色，DAPI）。比例尺，5µm。（D） Ki-67基因（红色）和CD45（绿色）通过免疫荧光标记PBS注射组或EXO注射组的脾脏。比例尺，200或50µm。（E） 量化数据显示CD45阳性细胞PBS注射组和EXO注射组的脾脏（n=5）。（F）脾脏CD45和Ki-67双阳性细胞的定量来自PBS-注射组和EXO-注射组（n=5）。（G） 着色Sham（正常小鼠）脾脏中CD49b（红色），注射PBSEXO注射组。比例尺，50µm。（H） 量化注射PBS的Sham（n=3）脾脏CD49b阳性细胞（n=5）和EXO注射组（n=6）*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001。EXO，外显子。

此外，NK细胞可以限制肿瘤发生缺乏功能性T淋巴细胞(40,41).因此，脾脏组织用抗体双重染色以确定Ki-67和CD45的数量和增殖白细胞活性(图5D).CD45阳性白细胞，包括粒细胞、单核细胞和淋巴细胞，控制先天免疫反应(42). 目前的数据表明，EXO显著降低脾脏中的白细胞数量（PBS，109.30±52.11；EXO，37.54±21.42；*P<0.05；图5E). 更具体地说，EXO还显著降低共同表达Ki-67和CD45（白色三角形），这表明与对照组，EXO抑制脾脏中的白细胞增殖（PBS，28.87±10.85; EXO，8.47±5.39**P<0.01；图5F). 同样，免疫荧光NK细胞泛标志物CD49b的染色(43)，表明NK细胞EXO注射组的脾脏显著减少与假手术组和PBS注射组（假手术组、，41.28±6.24; PBS为37.81±18.08；EXO，14.84±5.84*P<0.05，***P<0.001；图5G和H).总的来说，这些数据表明EXO抑制了固有免疫应答体内.

WERI-Rb1细胞产生的EXO加速视网膜母细胞瘤转移

探讨EXO对视网膜母细胞瘤的影响转移，肝脏，这是最接近对皮下肿瘤进行分析。如所示图6A，在细胞中观察到EXO注射EXO后2天，在肝窦周围仅见于肝窦附近的细胞。在第10天，EXO（红色）出现在远处的肝组织中，主要是被库普弗细胞吞噬（CD68阳性），表明EXO可以扩散到肝组织并在巨噬细胞中积聚（白色箭头；图6B).此外，肝脏转移结节的宏观图像显示在里面图6C表示EXO注射导致更多转移病灶（白色箭头，转移性肝结节）。EXO注射的三个肝脏组为肝硬化，表明肝脏恶化（绿色箭头、肝硬化）。然后，切除的肝脏被染色使用Ki-67。发现EXO注射组的肝脏Ki-67阳性区域增加，这与肝组织中的转移性结节（白色箭头；PBS，0.405±0.353%; EXO，3.926±1.533%**P<0.01；图6D和E). 因此，EXO来源于WERI-Rb1细胞可能对肿瘤有促进作用转移。

图6。 WERI-Rb1细胞产生的EXO加速视网膜母细胞瘤的转移。PKH26标签EXO（红色）被来自肝脏的CD68阳性Kupffer细胞（绿色）内化组织（A）注射EXO后2或（B）10天。使用了DAPI染色细胞核，用CD68（绿色）标记巨噬细胞。比例尺，50或10µm。（C） 肝脏的宏观外观PBS注射组和EXO注射组（白色箭头，转移性肝结节；绿色箭头，肝硬化）。（D）注射PBS后肝脏中Ki-67（红色）染色EXO注射组。比例尺，200µm。（E） 定量数据表明，EXO增加了Ki-67阳性面积（%）注入（n=5）**P<0.01。EXO，外显子。

EXO的构成来源于WERI-Rb1细胞

由于EXO主要来源于WERI-Rb1细胞影响肿瘤恶性程度、先天免疫和转移上述miRNAs和EXO中参与肿瘤恶化的蛋白质通过RT-qPCR和western印迹。如所示图7A、miR-92a、miR-20a、miR-129和检测到miR-17。此外，趋化因子受体CXCR4是不仅在WERI-Rb1细胞中表达，而且在EXO中也检测到(图7B). TSP-1，一种基质细胞蛋白质在肿瘤发展中起着多重作用，而不是在WERI-Rb1细胞中观察到，这与我们之前的研究一致研究(44). 然而，值得注意的是，在EXO中检测到TSP-1。CXCR4和TSP-1参与扩散和TAM招募(45–51).因此，EXO的内容可能在EXO介导的肿瘤进展。

图7。 EXO的构成来源于WERI-Rb1细胞。（A） 逆转录定量PCR分析选择与肿瘤恶化相关的miRNAEXO来源于WERI-Rb1细胞。（B） Western blot图像显示WERI-Rb1细胞和EXO中CXCR4和TSP-1蛋白的表达来源于WERI-Rb1细胞。EXO，外显体；CXCR4、C-X-C趋化因子受体4型；TSP-1、血小板反应蛋白-1；miR/miRNA，microRNA；+，阳性表达；-，负面表达。

讨论

越来越多的证据表明，EXO在肿瘤侵袭转移中发挥重要作用(13,14,52).来自视网膜母细胞瘤细胞的EXO可能对视网膜母细胞瘤的发展。在本研究中，我们发现EXO可抑制巨噬细胞的抗肿瘤作用并诱导骨髓间充质干细胞促进肿瘤生长。体内，通过裸鼠异种移植模型，数据显示EXO显著增加肿瘤生长。值得注意的是，EXO注入肿瘤周围浸润了肿瘤组织、脾脏和肝脏。TAM、白细胞和NK细胞在抗肿瘤中的变化这些组织的EXO渗透抑制了活性。对EXO含量的分析表明，EXO富含参与肿瘤恶化的miRNA和蛋白质。因此，这些数据提供了直接证据在体外和在里面活泼地支持EXO来源于视网膜母细胞瘤通过浸润微环境。

值得注意的是，本研究表明EXO衍生来自WERI-Rb1细胞的细胞的生长略有增加在体外(图1F)，但有更显著的影响体内(图3C). 与EXO孵育后，WERI-Rb1细胞活力略有增加。表达式PCNA是一种特殊的细胞增殖标记物，其水平是相同的与对照组相比，用EXO处理的细胞中(图1G). 然而，从WERI-Rb1细胞显著提高PCNA蛋白水平和抑制肿瘤细胞凋亡体内(图3E和F). Ki-67-阳性比率EXO处理后的细胞显著高于对照处理后(图4B).EXO注射组的肿瘤生长增加了约4.0倍10治疗后天数(图3B和C类). 因此，肿瘤增殖的不一致性活动在体外和体内表示EXO通过影响周围组织促进肿瘤生长微环境。

事实上，研究发现EXO显著抑制巨噬细胞在体外.炎症细胞因子IL-6和MCP-1在与EXO孵育的巨噬细胞(图。2). IL-6和MCP-1都可能进一步促进肿瘤的发生生长和转移(6).同样，BMSCs中IL-6和MCP-1水平也增加，导致WERI-Rb1细胞活性升高。此外，EXO可以恶化异种移植瘤的微环境。EXO（执行官）在肿瘤、脾脏和肝脏中浸润和积聚。TAM公司注射外泌体(图4). 同样，PKH26标记的EXO被巨噬细胞直接摄取脾脏。CD45阳性白细胞和NK细胞，一种淋巴细胞主要介导先天性抗肿瘤免疫的是EXO治疗后脾脏显著减少(图5). 此外，EXO出现在遥远的地方肝组织，主要被库普弗细胞吞噬(图6B). 根据角色TAM、白细胞和NK细胞、来自WERI-Rb1细胞的EXO加速肿瘤的增殖、恶性和转移视网膜母细胞瘤体内因此，本研究结果表明EXO改变肿瘤微环境并促进肿瘤进展(图8).

图8。 WERI-Rb1衍生EXO的作用视网膜母细胞瘤细胞。体外，来自RB的EXO细胞可通过激活BMSCs促进细胞生长并抑制巨噬细胞的抗肿瘤作用。体内，EXO衍生RB细胞可以促进肿瘤生长，抑制体内的免疫细胞促进脾脏和肝脏转移。EXO，外显体；RB、，视网膜母细胞瘤；骨髓间充质干细胞；NK、，自然杀手；TAM，肿瘤相关巨噬细胞。

EXO的内容包括小的非编码RNA分子，如miRNAs、piwi相互作用RNA、tRNA-衍生小RNA和一系列蛋白质(53). 发现miRNAs（miR-92a，miR-20a、miR-129和miR-17）、CXCR4和TSP-1在来自视网膜母细胞瘤细胞的EXO。根据之前研究、miRNAs（miR-92a、miR-20a、miR-129和miR-17）、CXCR4和TSP-1参与TAM的招募和增殖(45–51).例如，miR-92a刺激TAM中的促炎细胞因子IL-6反过来促进肿瘤细胞相互作用的增殖、侵袭和转移与周围的微环境(46). CXCR4加速TAM招募(36,48). 然而，TSP-1表达的作用在肿瘤发生中是复杂和有争议的。一些研究已经据报道，TSP-1可以抑制肿瘤血管生成并抑制各种癌症中的肿瘤生长，如宫颈癌，肺癌与黑色素瘤(54,55).其他研究表明，TSP-1可以在多个癌症类型，包括前列腺癌、乳腺癌和皮肤黑色素瘤，与肿瘤增殖有关，迁移和转移导致预后不良(56–59).具体来说，肖等(49)报告EXO转移TSP-1可以激活TAM并促进口腔鳞状细胞的恶性迁移细胞癌，这与目前的结果一致。基于在前面的研究中TSP1在视网膜母细胞瘤中的表达EXOs可能促进视网膜母细胞瘤进展。然而，本研究的局限性在于只研究了少数几个miRNAs和蛋白质。这个EXO蛋白质和miRNA图谱的全面鉴定将在未来的研究中进行。

总的来说，本研究阐明了其作用和视网膜母细胞瘤细胞来源的EXO在视网膜母细胞瘤的生长和转移。本研究的发现提示视网膜母细胞瘤EXO可能是一个治疗靶点可以通过调节its来抑制视网膜母细胞瘤成分；或者，干扰EXO的抑制剂可以培养吸收能力。因此，本研究为未来提供了保证EXOs抑制视网膜母细胞瘤的临床探讨在儿科人群中。

补充材料

支持数据

致谢

不适用。

基金

本研究得到了来自国家自然科学基金（批准号81670848）广州市科技规划项目（批准号：201803010091）。

数据和材料的可用性

当前使用和/或分析的数据集可从相应作者处获得合理的研究请求。

作者的贡献

SC和XC设计并执行了研究，并进行了分析数据和起草手稿。JQ、PC、XH和YW协助进行实验并分析数据。杰兹、MY、CW、NWYY参与了数据收集和数据整理。JG参与了研究设计，并提供了专业的建议。SC和JinZ审阅了手稿并组织了数字。KY和JinZ设计了研究，分析了数据，管理项目并监督手稿。所有作者已阅读并批准了最终稿。

道德批准和同意参与

所有动物实验都严格遵守ARVO关于在眼科和视力研究中使用动物的声明并得到动物保护机构的批准和监督中山市眼科中心使用委员会[批准号：。SYXK（YUE）2018-101、2018-168、2019-009]。

患者发表同意书

不适用。

竞争性利益

作者声明他们没有竞争对手利益。

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