外显体转运的THBS1激活的M1类肿瘤相关巨噬细胞促进口腔鳞癌恶性转移

摘要

背景

针对肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的治疗策略已经在癌症领域提出。人类上皮性癌发生过程中微环境中巨噬细胞的功能变化尚不清楚。在这里，我们探讨了口腔鳞癌（OSCC）发生过程中巨噬细胞的表型变化。

方法

从正常口腔上皮、口腔白斑细胞和OSCC细胞中采集条件培养基（CM）和外泌体上清液。我们使用流式细胞术、鲁米克斯分析和定量实时PCR分析来测量巨噬细胞的表型改变。进行细胞内信号通路分析、质谱蛋白质组学、western blotting、酶联免疫吸附分析、免疫组织化学染色和生物信息学分析，以揭示潜在的机制。

结果

当用来自OSCC细胞的CM而不是来自正常上皮或白斑细胞的CM治疗时，THP-1衍生和PBMC衍生的巨噬细胞表现出M1样表型，而不是M2样表型。进一步的研究表明，巨噬细胞在早期通过p38、Akt和SAPK/JNK信号途径被OSCC细胞释放的外泌体激活。我们进一步提供了证据，证明来源于OSCC外泌体的THBS1参与了巨噬细胞向M1样表型的极化。反过来，来自外泌体的CM诱导M1样TAM，并显著促进OSCC细胞的迁移。

结论

我们基于OSCC的外泌体提出了一种新的癌细胞和巨噬细胞之间的旁分泌环。因此，外泌体极化的M1类TAM作为控制口腔鳞癌癌变的治疗靶点显示出巨大的潜力。

背景

免疫系统在癌细胞与肿瘤微环境之间的串扰中是不可或缺的调节器[1,2]. 在与肿瘤微环境相关的免疫效应细胞中，巨噬细胞被广泛认为参与肿瘤相关炎症、免疫逃逸、基质重塑和肿瘤转移[三,4,5]. 多年来，有报道称巨噬细胞占恶性实体瘤的5-40%[6,7]. 巨噬细胞对局部微环境刺激表现出相当大的功能可塑性[8]. 活化的巨噬细胞在体外功能上分为两类，M1和M2[9,10,11]. 肿瘤相关巨噬细胞（TAM）是肿瘤细胞招募和培养的巨噬细胞群，在肿瘤微环境中发挥重要作用[4,12,13]. 由于这些发现，在癌症治疗中提出了以巨噬细胞为靶点的策略[14].

典型地，TAM具有与M2巨噬细胞一致的分子特征[6,15,16]. 最近，越来越多的证据表明，TAM不是由均质群体组成的，而是由巨噬细胞混合组成的，这些巨噬细胞同时具有M1和M2表型，在几种恶性实体瘤中检测到[17,18,19]. 在肝细胞癌中，CD68（+）HLA-DR（+）M1样TAM通过表达B7-H1抑制抗肿瘤免疫并促进肿瘤转移[17]. 据报道，在胰腺导管腺癌中，TAM表现出M1和M2特性，这两种特性都促进了上皮-间质转化[20]. 此外，在几种类型的癌细胞中，体外检测到M1和M2表型的巨噬细胞混合群[12,18,19]. 然而，还没有研究阐明M1或M2类TAM的这些变化的潜在机制，特别是关于M1类极化。因此，考虑到各种组织源性癌症之间的异质性，迫切需要充分了解TAM的教育。

口腔鳞状细胞癌（OSCC）属于头颈部鳞癌（HNSCC），是世界上最致命的癌症之一，涉及口腔粘膜上皮细胞[21]. OSCC的发展是一个进化过程，其特征是从正常上皮到上皮癌前状态和癌变[22]. 在恶性实体瘤中，新的证据支持这样的观点，即癌细胞的许多分泌产物通过旁分泌环参与巨噬细胞的教育和极化[三,23]. 然而，在OSCC发生过程中巨噬细胞的功能改变尚不清楚。在此，我们旨在研究肿瘤微环境中巨噬细胞在OSCC发生过程中的表型变化。

方法

细胞系培养和癌调节培养基制备

人类永生口腔上皮细胞系（HIOEC）和口腔白斑细胞系（Leuk1）在无血清角质形成细胞培养基中培养[24,25]. OSCC细胞系SCC25和Cal27是从美国型培养物收集中获得的，并在37°C、5%二氧化碳存在下，在补充有10%FBS、青霉素（100 U/ml）和链霉素（100μM/ml）的DMEM中培养[26]. 为了获得各种细胞系的条件培养基（CM），用新鲜的RPMI 1640培养基清洗培养细胞，使其达到80%的融合率，并再培养24小时[19]. 收集无细胞上清液，并在3900 rpm（4°C）下离心15分钟。通过0.45μm和0.22μm过滤单元连续过滤后，最终采集CM。

通过转染THBS1特异性短发夹RNA（5'-TTC TCC GAA CGT GTC ACG T-3′用于Scrambled，5'-GTA GGT TAT GAG TTT AAT-3′用于sh1，5'-GGA CAA CTG TCC ATC CCA TTA-3′用于sh2）慢病毒，并用嘌呤霉素（10μg/mL，Calbiochem，USA）阳性选择，产生稳定的SCC25和Cal25的THBS1敲除细胞。

巨噬细胞分化和极化

THP-1细胞从ATCC中获得，并保存在添加10%FBS、青霉素（100 U/ml）、链霉素（100μM）和2-巯基乙醇（2-ME，50μM，Sigma-Aldrich，USA）的RPMI 1640培养基中。为了获得静息巨噬细胞（M0），THP-1细胞在佛波醇-12-氨基丁酸-13-醋酸盐（PMA，100 ng/ml，Sigma-Aldrich，USA）处理24小时后分化，然后再休息24小时[19,27]. 使用50 ng/ml IFN-γ（美国PeproTech）和1μg/ml LPS（美国Sigma-Aldrich）将M0细胞极化为M1细胞24小时，并使用IL-4和IL13（美国PeproTech，20 ng/ml）极化为M2细胞7天[28,29].

使用Ficoll-Hypaque（GE Healthcare，USA）密度梯度从健康对照组获得外周血单个核细胞（PBMC）[30]. 使用人CD14微珠（MiltenyiBiotec，USA）从PBMC中分离单核细胞，并根据制造商的方案通过磁激活细胞分选（MACS）分离技术进行阳性选择。纯化的单核细胞在添加10%FBS和100 ng/mL M-CSF的RPMI 1640培养基中培养7天，以获得M0[31,32].

外显子的分离和鉴定

收集的CM通过0.10μm过滤装置过滤，然后转移至Amicon®Ultra-15离心过滤装置（100 K，Merck Millipore，USA），并在4°C下以3900 rpm离心浓缩15分钟。然后用PBS仔细清洗外显体，并将其重新悬浮在PBS或RPMI 1640新鲜培养基中，以进行验证或后续实验[33]. 将新分离的外泌体按1:1000稀释，用于纳米颗粒追踪分析（NTA）测量（NanoSight NS500，NTA 3.2 Dev Build 3.2.16）。利用NanoSight-LM10系统（英国威尔特郡NanoSight）分析外显子样品的大小分布和定量。测定检测到的外泌体的大小分布，并用平均值表示 ± 标准偏差[34].

巨噬细胞形态和成像

在倒置显微镜下观察并拍摄处理过的巨噬细胞的形态（蔡司，德国）。为了进行荧光观察，巨噬细胞被固定在多聚甲醛中并预先渗透。细胞骨架用Acti stain™555荧光Phalloidin（Cytoskeley，USA）标记，细胞核用DAPI（YEASEN，China）标记。使用蔡司荧光成像显微镜（德国蔡司）检查荧光标记细胞。

外泌体的荧光标记和巨噬细胞对外泌物的摄取

用Exo-Red标记试剂（美国System Biosciences公司的Exo-Glow Exosome标记试剂盒）在37°C下培养分离的外显体30分钟。使用超滤装置用PBS清洗标记的外泌体，并将其悬浮在新鲜的RPMI 1640培养基中。用Exo-Red染料标记的外显子被添加到THP-1衍生或PBMC衍生的M0细胞中并培养过夜。随后，清洗细胞以去除游离外泌体，然后固定、渗透并用Acti-stain™488-磷灰石和DAPI染色，如上所述。使用尼康A1共焦激光显微镜（日本）检查巨噬细胞对外显子的摄取。

流式细胞术

用CM或外泌体处理24 h后，将巨噬细胞洗涤、胰蛋白酶化并重新悬浮在含有1%FBS的PBS中。然后，用表面标记物（FITC小鼠抗人CD14、Alexa Fluor小鼠抗人CD163、PE小鼠抗人CD 86；用于同位素控制的FITC小鼠IgG2ακ、Alexa Fluor小鼠IgG1κ和PE小鼠IgG1κ；均来自美国BD Biosciences）。为了进行细胞周期分析，收集细胞并将其固定在4°C的70%乙醇中，并用碘化丙啶染色（PI，BD Biosciences，USA）。染色后，用流式细胞仪（Beckman CytolFLEX FCM，美国）对细胞进行分析。

酶联免疫吸附试验

使用Luminex™xMAP技术，使用高灵敏度9-Plex人类ProcartaPlex™面板（美国赛默飞世尔科学公司）进行细胞因子分析。收集、过滤处理过的巨噬细胞培养上清液，并将其储存在 根据制造商提供的协议进行分析之前，温度为80°C。所有样品一式三份。根据制造商的说明（美国eBioscience），使用铂酶联免疫吸附测定法对细胞培养上清液和胞外体悬浮液中的THBS1水平进行定量。

定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）分析

根据制造商推荐的方案，使用PrimeScript RT试剂盒（日本TaKaRa）提取总RNA并反向转录。使用SYBR Green Premix Kit（日本TaKaRa）对cDNA进行qRT-PCR检测。使用2计算相对表达式^-ΔΔCT以下基因的检测方法：TNFα、IL1β、IL6、IL10、CCL18、MRC1、CD80、HLA-DRα、PAI1和THBS1。

细胞内信号通路分析

用外泌体处理24小时后，裂解THP-1衍生的巨噬细胞。根据制造商的协议（Cell Signaling Technology，USA），使用PathScan免疫细胞信号抗体阵列试剂盒对细胞裂解物进行分析。随后，用外泌体处理2 h和6 h后，对THP-1衍生的巨噬细胞进行裂解，并相应地使用PathScan细胞内信号抗体阵列试剂盒（美国细胞信号技术）对细胞裂解产物进行分析。

基于质谱的无标签定量蛋白质组学

北京邦飞生物科技有限公司采集并裂解外显子，用于基于质谱的无标签定量蛋白质组学分析[35]. 在Orbitrap Fusion质谱仪（美国Thermo Scientific）中对每个样品的洗脱肽进行数据采集。MS RAW数据文件通过Proteome Discoverer上传至吉祥物2.1，参考数据库为uniprot-human-160701.fasta。通过UniProtKB数据库分析过滤的蛋白质的功能。

蛋白质印迹

为了进行免疫印迹，使用RIPA裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂混合物）获得细胞提取物或外泌体提取物（Innovation，USA）。将裂解产物进行SDS-PAGE电泳后，通过电印迹将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上。然后用一级抗体（来自Thermo Fisher的抗Alix抗体；来自美国System Biosciences的抗CD9和抗CD63抗体；来自BioVision的抗Rab5抗体；抗磷酸-Akt（Ser473）、抗Akt（pan）、抗磷酸-SAPK/JNK（Thr183/Tyr185）、反SAPK/JNK、抗磷酸-p38 MAPK（Thro180/Tyr182）、，和抗p38 MAPK抗体，来自美国Cell Signaling Technology；抗β-微管蛋白抗体，来自BOSTER生物技术，中国）。在Amersham Imager 600（GE，美国）下，使用ECL Plus试剂（Millipore，美国）检测特异性抗体结合蛋白带。

免疫组织化学染色

从石蜡包埋样品中制备5μm切片。在脱蜡、复水和抗原回收后，内源性过氧化物酶活性被抑制。用一抗（美国Santa Cruz的鼠抗人THBS1抗体和鼠抗人CD68抗体；美国Abcam的兔抗人CD80抗体）进行免疫组织化学（IHC）染色。对于THBS1染色，样品用生物素化二级抗体孵育，然后用DAB试剂盒染色（GTVision，中国）。对于CD68和CD80双重染色，根据制造商提供的协议，使用了多重鼠-HRP/兔-AP IHC试剂盒（瑞士Enzo Life Sciences）。CD68的比例⁺CD80型⁺使用从美国国立卫生研究院（NIH）网站下载的免费Image J 1.51t版对20例OSCC患者CD68+区域的面积进行了测量(https://imagej.nih.gov/ij/).

生物信息学分析和验证

使用UCSC Xena浏览器根据TCGA HNSCC队列进行生物信息学分析[36,37]. 总计，在RNAseq（polyA+IlluminaHiSeq）下搜索604例患者的基因表达。仅筛选并纳入原发性HNSCC病例，以进一步分析THBS1、TNFα、IL6、IL1B、CD68、CD80和CD86的表达模式。生成定义基因集的表达热图并在线聚类，下载详细数据用于后续统计分析。基于30例原发性口腔鳞状细胞癌病例构建了一个经验证的队列。参与本研究的患者签署了书面知情同意书，研究得到了上海交通大学医学院第九人民医院医学伦理委员会的批准。

细胞迁移分析

Transwell分析用于检测OSCC细胞对外泌体处理的巨噬细胞CM的迁移能力。将癌细胞悬浮在200μl（5 × 10⁴细胞），并用300μl含有10%FBS和300μl CM的培养基（来自底部腔室中经外泌体处理的巨噬细胞）置于Millicell腔室（8μm，Millipore Corporation，USA）中。24小时后，用多聚甲醛固定通过过滤器迁移的细胞，并用10%结晶紫染色。对迁移的细胞进行拍照和计数。

统计分析

本研究中的所有统计分析均使用SPSS16.0软件（SPSS，Inc.，Chicago，IL，USA）进行，数据表示为平均值 ± 两组之间的显著差异由Student’st吨-测试。采用皮尔逊卡方检验评估两个变量之间相关性的统计显著性。A类第页-价值< 0.05被认为具有统计学意义。

结果

OSCC细胞的条件培养基将巨噬细胞极化为M1样表型

在癌前状态下，OSCC从正常上皮发育而来，具有特定的转化过程。为了研究OSCC转化过程中巨噬细胞的功能和表型可塑性，我们使用HIOEC、Leuk1、SCC25和Cal27进行了研究。THP-1衍生的巨噬细胞在与来自HIOEC和Leuk1的CM孵育时呈现圆形和光滑，类似于M0巨噬细胞，而与来自SCC25和Cal27的CM孵育时，巨噬细胞呈现粗糙和分支（图。1a个)。通过检测M1标记CD86和M2标记CD163的表达，我们观察到CD86的频率显著增加⁺用SCC25和Cal27中的CM预处理巨噬细胞中的细胞，与HIOEC和Leuk1中的CM进行比较（图。1亿)表明THP-1衍生的巨噬细胞在使用来自OSCC细胞的CM而不是来自正常上皮或白斑细胞的CM治疗时表现出M1样表型。此外，在CM-SCC25和CM-Cal27处理的THP-1衍生的和PBMC衍生的M0中发现代表性M1细胞因子TNFα、IL1β和IL6的表达水平增加（图。1c个)。此外，CM-SCC25和CM-Cal27治疗显著增强了巨噬细胞对LPS和IFNγ刺激的反应（图。1c个).

图1

CM培养巨噬细胞的特征。一通过CM从HIOEC、Leuk1、SCC25和Cal27培养24小时THP-1衍生巨噬细胞的典型形态学图像。细胞骨架用荧光555-Phalloidin（红色）标记，细胞核用DAPI（蓝色）标记。b条代表性散点图显示，通过流式细胞术评估由来自HIOEC、Leuk1、SCC25和Cal27细胞的CM培养24小时的THP-1衍生巨噬细胞中的CD86和CD163水平。直方图显示了CD86百分比的统计分析⁺巨噬细胞。c（c）通过定量实时PCR测定THP-1衍生和PBMC衍生巨噬细胞的TNFα、IL1β和IL6的表达水平，这些巨噬细胞由来自HIOEC、Leuk1、SCC25和Cal27的CM培养24小时，随后是否刺激LPS和IFNγ24小时。数据表示为平均值 ± 三个独立实验的SD**第页 < 0.01

OSCC细胞释放的外显子激活巨噬细胞

细胞外小泡是CM中除可溶性因子（如细胞因子、趋化因子和生长因子）外的另一个主要成分，在这些小泡中，外泌体被认为是细胞间通讯的关键介质[38,39]. 为了阐明CM中的功能效应物，我们成功地从OSCC细胞系的CM中分离和鉴定了外泌体（图。2a个,b条)。先前的研究报道巨噬细胞在外泌体快速摄取和信息传递中起着关键作用[40,41]. 我们使用共焦荧光显微镜观察并追踪荧光标记外泌体的摄取。我们观察到THP-1衍生的巨噬细胞和PBMC衍生的巨噬细胞对OSCC衍生的外泌体的摄取（图。2厘米)表明巨噬细胞可以直接吸收OSCC外泌体的生物信号。我们分别使用CM、等量外显体上清液和不含外显体的CM刺激巨噬细胞。相比之下，外泌体在调节THP-1衍生和PBMC衍生巨噬细胞中M1特征基因（TNFα、IL1β和IL6。二维).

图2

OSCC细胞系CM的外显子分离。一将新分离的外显子按1:1000稀释，以便使用Nanosight技术进行纳米颗粒追踪分析。曲线图表明，SCC25-exosomes和Cal27-exosomes的大多数外泌体分布在大小分别为103 nm和112 nm的峰。进行了三个独立的实验，并将结果合并为一条曲线。b条条带代表人Alix、CD63、CD9和Rab5在从SCC25和Cal27分离的全细胞裂解物和外泌体裂解物上的免疫印迹分析。c（c）THP-1衍生和PBMC衍生的巨噬细胞对外泌体的摄取。巨噬细胞被标记为488-磷脂（绿色），外显子被标记为外显子-Red（红色），细胞核被标记为DAPI（蓝色），bar = 25微米。阴性对照出现在附加文件中三.D.通过来自SCC25和Cal27的条件培养基、外泌体上清液或不含外泌体的条件培养基培养24小时，THP-1衍生的巨噬细胞和PBMC衍生的巨噬细胞中TNFα、IL1β和IL6的转录水平。数据表示为平均值 ± 三个独立实验的SD。

我们检测了来源于THP-1和PBMC的巨噬细胞中M1和M2特征基因的转录水平，这些巨噬细胞由SCC25和Cal27的丰富外显体上清液刺激。巨噬细胞中M1相关基因（TNFα、IL1β和IL6）的表达水平显著增加，而M2相关基因的表达水平（IL10、CCL18和MRC1）没有改变（图。3a年)。通过Luminex分析评估这些细胞因子的蛋白水平，结果表明，OSCC衍生的CM和胞外体上清液显著提高了这些M1相关细胞因子的分泌水平（图。3亿,c（c）)。这些数据表明，OSCC-CM中的外泌体将巨噬细胞激活为M1样表型。

图3

OSCC细胞系的外显子将巨噬细胞激活为M1样表型。一用SCC25和Cal27的胞外体上清液刺激24小时后，通过qPCR测定THP-1衍生和PBMC衍生巨噬细胞中代表性M1和M2标记基因的表达。b条通过Luminex分析评估细胞因子表达谱的热图。THP-1衍生的巨噬细胞分别用来自HIOEC、Leuk1、SCC25和Cal27的CM和来自SCC25及Cal27细胞的胞外体上清液处理24小时。所有样品一式三份。图示的颜色折叠变化（参见色阶）。红色：上调；蓝色：下调。c（c）在HIOEC、Leuk1、SCC25和Cal27细胞的CM和SCC25及Cal27的胞外体上清液培养24小时后，检测THP-1衍生和PBMC衍生巨噬细胞培养上清液中IL1β、TNFα和IL6的水平。数据表示为平均值 ± SD来自三个实验**第页< 0.01，与对照组、CM-HIOEC和CM-Leuk1治疗组相比有显著差异

此外，我们观察到CD86的百分比⁺在体外，经OSCC衍生的胞外体上清液处理后，巨噬细胞显著增加（图。第4页)。在实体组织中，CD68被用作巨噬细胞的泛标记物，CD68和CD80的共同表达表明巨噬细胞呈M1样[42]. CD80和CD68在原发性口腔鳞状细胞癌中的显色双重染色显示，M1样巨噬细胞在CD68中集中分布⁺癌巢中的簇（图。4b个)。从统计上看，CD68⁺CD80型⁺区域约占所有CD68的31%（范围：22-45%）⁺20个OSCC样本中的区域。基于主要TCGA HNSCC队列的生物信息学分析显示CD68和CD80或CD86之间存在显著的共表达（图。4c类)。在基于30例原发性口腔鳞状细胞癌病例的验证队列中，还观察到CD68与CD80或CD86之间的显著共表达模式(第页 < 分别为0.01，图。第4天)。上述数据表明，口腔鳞癌组织中广泛存在M1样巨噬细胞。

图4

OSCC外泌体激活的巨噬细胞和OSCC样品中的M1样极化。一代表性散点图显示，通过流式细胞术测定SCC25和Cal27外泌体刺激THP-1衍生巨噬细胞24小时后CD86的表达水平。直方图显示了CD86百分比的量化⁺巨噬细胞。数据以平均值表示 ± 三个独立实验的SD**第页 < 0.01，与对照组相比差异显著。b条.初级OSCC样品中CD80（粉红色）/CD68（棕色）的显色双重染色。在OSCC样本中观察到CD80和CD68双重阳性细胞。显示的代表性图像为100倍和200倍放大倍率；控制图像显示在附加文件中4.c（c）基于主要TCGA HNSCC队列的UCSC Xena Browser的Heat-map描述了巨噬细胞的CD68泛表面标记与M1极化表面标记CD80或CD86之间的基因表达关系**第页 < 0.01，CD80和CD86.D均与CD68表达显著相关。在经验证的初级OSCC队列中，CD68、CD86和CD80的表达模式(n个 = 30)

OSCC的外显子通过激活p38、Akt和SAPK/JNK信号触发M1样巨噬细胞

激活有效的细胞内信号以响应各种细胞外刺激对巨噬细胞极化至关重要。接下来，我们研究了外泌体激活OSCC中巨噬细胞的潜在分子机制。我们发现经外泌体处理24小时后THP-1衍生的巨噬细胞内的细胞内MAPK，尤其是p38 MAPK显著激活（附加文件1; 图。5a级)。TNFα、IL1β和IL6 mRNA表达水平的动力学分析表明，巨噬细胞的激活发生在外泌体刺激后的早期阶段（图。5亿)。因此，在外泌体处理2小时和6小时后，分析THP-1衍生的巨噬细胞的细胞裂解物的细胞内信号改变，并观察到p38 MAPK、Akt和SAPK/JNK的激活（图。5厘米)。免疫印迹分析进一步证实，p38 MAPK、Akt和SAPK/JNK信号的激活发生在外体刺激后的早期（图。5天).

图5

巨噬细胞对胞外体激活反应的细胞信号分析。一用外显体处理24 h后，裂解THP-1衍生的巨噬细胞，并使用PathScan免疫细胞信号抗体阵列试剂盒通过测量密度值检测细胞裂解物。进行了四个独立的实验，并显示了具有代表性的图像**第页 < 0.01，与对照组相比。b条分别用OSCC外泌体处理THP-1衍生的巨噬细胞0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、12 h、24 h和48 h。检测TNFα、IL1β和IL6的转录水平。数据是三个独立实验的代表。c（c）用外泌体处理2 h和6 h后，裂解THP-1衍生的巨噬细胞。使用PathScan细胞内信号抗体阵列试剂盒通过测量密度测定值对细胞裂解物进行分析。观察到p38 MAPK Thr180/Tyr182（黑盒区）、Akt Ser473（蓝盒区）和SAPK/JNK Thr183/Tyr185（红盒区）的激活。天用OSCC衍生的外泌体处理THP-1衍生的巨噬细胞0 h、2 h、6 h、12 h、24 h和48 h。收集细胞裂解物并通过免疫印迹分析Akt、SAPK/JNK和p38信号的激活

外显子介导的THBS1转移使巨噬细胞极化为M1样表型

p38 MAPK、Akt和SAPK/JNK信号的早期激活表明巨噬细胞的激活可能是由外体内效应蛋白的直接作用引起的。基于质谱的提取外泌体定量蛋白质组学分析显示，891种蛋白质在SCC25和Cal27衍生的外泌体中重叠（图。第6页)。然后根据KEGG分析，通过关注炎症相关通路（PI3K-Akt、HIF-1、MAPKs、Notch、NF-κB和Ras信号通路）筛选共享的蛋白质。蛋白质与< 5%的覆盖率被排除在外。最终，39个蛋白质保留下来，并通过UniProtKB数据库进行进一步的功能分析（图。第6页)。我们发现，在39种选定的蛋白质中，THBS1覆盖率最高，对GO生物过程分析中的巨噬细胞活化具有正调控作用[43].

图6

对SCC25和Cal27细胞CM中提取的外显体进行定量蛋白质组学分析。一维恩图显示SCC25-和Cal27-外显体之间共有891个蛋白质。b条SCC25-和Cal27-外泌体中共享的蛋白质基于KEGG通路分析，重点关注炎症相关通路、PI3K-Akt、HIF-1、MAPK、Notch、NF-κB和Ras信号通路。蛋白质与< 5%的覆盖率被排除在外。c（c）在筛选出的39个蛋白质中，通过UniProtKB分析功能。选择THBS1进行进一步分析

THBS1是巨噬细胞的一个强大的促炎信号，也是由巨噬细胞产生的[44,45]. 为了确定THBS1在外泌体中携带，我们以时间依赖的方式检测了外泌体激活的巨噬细胞中THBS1及其下游分子PAI1的表达水平。我们发现在外体处理6小时后THBS1的表达增加（图。第7页)PAI1的表达在2小时开始增加（图。7亿)这表明是外泌体中的THBS1，而不是受刺激巨噬细胞中的内源性THBS1。此外，我们观察到SCC5和Cal27细胞中THBS1的水平高于HIOEC和Leuk1细胞（图。第7页c,天)。我们观察到THBS1在SCC25和Cal27的外泌体中显著积累（图。第7页)这表明外泌体是从HNSCC细胞转移THBS1的有效载体。在原发性OSCC组织中，THBS1主要在癌细胞中检测到（图。第7页)。我们说明了原发性HNSCC TCGA队列和原发性OSCC验证队列中THBS1和M1相关基因的表达关系。我们在520例原发性HNSCC样本和30例原发OSCC样本中观察到THBS1和IL1β/IL6的表达显著正相关（图。7克,小时)表明THBS1的高表达与原发性OSCC中M1极化状态的增加有关。当敲低OSCC细胞中THBS1的表达时，THP-1衍生巨噬细胞的TNFα、IL1β和IL6的表达水平显著降低，这些巨噬细胞受到CM和胞外体上清液的刺激（附加文件2; 图。第7页,j).

图7

THBS1从OSCC激活的巨噬细胞外体转移到M1样表型。a-b公司分别用OSCC外泌体处理THP-1衍生的巨噬细胞0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、12 h、24 h和48 h。用qPCR检测THBS1和PAI1的转录水平。数据是三个独立实验的代表。c（c）THBS1在HIOEC、Leuk1、SCC25和Cal27细胞中的转录水平。d-电子。通过铂ELISA分析，对细胞培养上清液和胞外体悬浮液中THBS1的表达水平进行量化**第页 < 0.01.（f）代表性免疫组织化学染色显示THBS1在原发性OSCC标本（100×）中由癌细胞表达。正常口腔上皮组织上部作为对照；初级OSCC组织的下部。克基于主要TCGA HNSCC队列的UCSC Xena Browser的Heat-map描述了TNFα、IL1β或IL6与THBS1之间的基因表达关系**第页 < 0.01.小时验证的原发性OSCC队列中THBS1、IL1β、IL6和TNFα的表达模式（n = 30).i-j公司分别用CM和来自THBS1-sh SCC25和Cal27细胞的胞外体上清液培养24小时的THP-1衍生巨噬细胞中TNFα、IL1β和IL6的转录水平。加扰作为控制**第页 < 0.01

外泌体激活的巨噬细胞的CMs促进OSCC细胞的迁移

TAM被认为在肿瘤微环境中促进与癌症相关的恶性肿瘤[2,7]. 为了研究外泌体激活的巨噬细胞对OSCC发育的影响，从外泌物激活的巨噬细胞中收集CM并将其处理为OSCC细胞（图。第8页a)。未经处理，SCC25和Cal27的增殖能力未观察到显著反应（图。8b个)。然而，CM显著促进OSCC细胞的运动（图。8b个)。这些数据表明，来自暴露于外泌体的巨噬细胞的因子在OSCC的恶性迁移中起着重要作用。

图8

来自外体活化巨噬细胞的CM对SCC25和Cal27细胞的影响。一在随后的OSCC细胞增殖和迁移分析中，来自外泌体激活巨噬细胞的CM的实验方案。b条流式细胞术进行细胞周期分析。进行了三个独立的实验，并显示了具有代表性的图像。未观察到显著差异。c（c）来自外泌体处理的巨噬细胞的CM增加了SCC25和Cal27细胞的运动能力。进行了三个独立的实验，并显示了一个具有代表性的图像**第页 < 0.01

讨论

巨噬细胞的浸润和极化被认为是致癌过程中的基本事件[12,13]，并且TAMs和癌细胞之间存在旁分泌环[三,15]. 然而，很少有研究报道TAM在上皮癌发展过程中的行为。本研究采用一个具有代表性的OSCC发育模型来说明巨噬细胞的可塑性。在这里，我们证明来自OSCC细胞的CM激活巨噬细胞成为M1样表型，而使用来自癌前或正常上皮细胞的CM治疗的巨噬细胞没有观察到明显的功能变化。此外，在初级OSCC样品中检测到M1类TAM。我们发现，巨噬细胞活化是通过在早期通过p38、Akt和SAPK/JNK信号途径摄取OSCC细胞释放的外泌体而发生的。此外，我们提供了证据表明，来源于OSCC外泌体的THBS1参与巨噬细胞活化为M1样表型。相反，来自外泌体活化巨噬细胞的CM显著促进OSCC细胞的恶性迁移。因此，我们提出了一种基于OSCC外泌体的癌细胞和巨噬细胞之间的新型旁分泌环（图。9).

图9

基于OSCC外泌体的癌细胞和巨噬细胞之间新的旁分泌环示意图。巨噬细胞通过p38、Akt和SAPK/JNK信号途径摄取OSCC细胞释放的胞外THBS1被激活为M1样TAM。相反，来自外泌体活化巨噬细胞的CM显著促进OSCC细胞的恶性迁移

在此，分别从正常上皮、癌前病变和口腔癌中提取CM，用于体外培养巨噬细胞。出乎意料的是，仅在CM-OSCC处理的巨噬细胞中观察到明显的M1样极化状态，这表明TAM的特征性激活发生在恶性转化之后。我们的结果与研究一致，这些研究确定了具有M1和M2表型的混合巨噬细胞在癌症中的存在和生物学作用[17,19,20]. 在恶性实体肿瘤中，TAM的教育是通过巨噬细胞和癌细胞之间的膜分子和旁分泌环直接接触实现的[三,15,46,47]. 在CM-OSCC处理下，我们观察到早期阶段M1样表型改变。在OSCC样本中，M1样TAM约占所有巨噬细胞的31%，表明OSCC中同时存在M2样TAMs。先前的一项研究报告称，TAMS的M1-M2转变发生在肿瘤进展过程中，但对M1/M2转换所涉及的潜在信号了解甚少[5]. 仍需要进一步的研究来确定M1和M2样TAM在OSCC的肿瘤微环境中共存的潜在机制。

以前的研究集中于癌细胞产生的可溶性因子，即细胞因子、趋化因子和生长因子。迄今为止，有人认为来自癌细胞的外泌体具有广泛的生物学功能[39,48,49,50]. 外显体被认为是重要的信号传导介质，可将脂质、蛋白质、mRNAs、microRNAs和lncRNAs转移到受体细胞，从而将癌相关信号分子转移到周围细胞，如内皮细胞、免疫细胞、间充质基质细胞等[39,50,51,52]. 癌细胞微环境中基于外显子的通讯是癌症发展中的一些关键事件。在本研究中，我们证明了来自OSCC的CM中的外泌体激活巨噬细胞到M1样表型。

接下来，我们应用细胞内信号通路分析，发现OSCC的外泌体主要通过早期激活p38、Akt和SAPK/JNK信号来触发巨噬细胞极化。Akt、p38和JNK激酶的联合激活参与巨噬细胞内促炎介质的表达[53]. 总之，这些结果为巨噬细胞对OSCC外泌体的M1样激活提供了证据。此外，巨噬细胞的早期激活表明对外泌体携带的效应蛋白有直接而快速的反应。通过基于质谱的定量蛋白质组学分析鉴定THBS1。THBS1是一种多功能蛋白，对巨噬细胞具有强大的促炎和促粒细胞信号作用[43,45,54]. 此外，THBS1已被鉴定为OSCC分泌的最丰富的蛋白质，据报道，与正常上皮相比，THBS1在OSCC中显著上调[55]. 我们的研究还发现，与癌前和正常上皮细胞相比，OSCC细胞中THBS1的mRNA表达和分泌水平更高。此外，基于两个队列和THBS1敲除试验的生物信息学分析表明，THBS1表达水平与OSCC中M1的激活密切相关。

以前的研究更多地关注M2类TAM而非M1类TAMs在癌症病理学中的作用。我们在OSCC样本的TAM中观察到M1样巨噬细胞的集中分布。因此，我们推测M1类TAM对癌细胞的生物效应应该通过旁分泌信号实现。我们发现外泌体激活的巨噬细胞可以显著促进OSCC细胞的恶性迁移。M1巨噬细胞一直被认为是通过吸引和激活NK和Th1细胞直接或间接消除癌细胞的关键效应细胞[7]. 因此，OSCC中外泌体激活的M1样TAM可能提供治疗靶点来激发这些细胞的杀瘤潜能。此外，本研究强调需要更深入地了解M1类TAM在OSCC中的作用和机制。

结论

总之，我们的研究结果表明，口腔癌THBS1的外体转移可以将巨噬细胞极化为M1样TAM。M1样TAMs的靶向管理在控制OSCCs中肿瘤细胞迁移方面显示出巨大的潜力。