本文中提到：

介绍

胰腺癌是侵袭性最强的癌症之一恶性肿瘤的类型，是第六大致死原因在中国，癌症相关死亡的第四大原因在美国，预后最差癌症(1——三). 此前估计53070例胰腺癌新发病例和41780例死亡病例由胰腺癌引起的疾病将于年在美国发生2016 (4). 几个风险因素已确定有助于胰腺癌的发生，包括年龄、吸烟、肥胖和慢性胰腺炎(5——7). 在在过去的几十年里，癌症研究的巨大进展导致了新的诊断和手术技术的发现。然而，尽管这些有助于改善发病率和术后死亡率，对生存率没有显著影响(8). 总的5年生存率胰腺癌各阶段的发病率仅为5%，且中位数生存时间约为6个月(9).胰腺癌患者预后不良主要是归因于非特异性症状、侵袭性生长、早期和侵袭性局部侵袭、转移潜能和抵抗化学疗法和放射疗法(10——12).因此，阐明胰腺癌发病机制及新进展治疗对于改善预后和胰腺癌患者的治疗效果。

最近，microRNAs（miRNAs）内源性、单链、小的、非编码的调节RNA长度为18–24个核苷酸的分子注意(13). miRNAs减少靶向部分互补元件的基因表达目标基因的3′非翻译区（3′UTR），以及通过两种机制发挥作用：降低靶基因的表达基因和/或抑制其翻译(14). 单个特异的miRNA可以调节大量的靶基因，通常以许多组分为靶点复杂的细胞内网络(15). miRNAs的关键作用是在各种生物过程中建立，包括细胞增殖、分化、代谢和凋亡导致多种疾病的发病机制，包括癌症。以前的研究表明miRNAs及其靶基因的表达与致癌与癌症进展(16——18).据报道，许多miRNAs在胰腺癌，而特异性miRNAs的表达与疾病预后不良相关，从而证明这些分子作为新型治疗靶点的潜力癌症治疗(19——21).

本研究旨在调查该模式a的表达、生物学作用和作用机制胰腺癌中的特异性miRNA分子miR-296。在此外，还发现AKT2是miR-296在胰腺癌中的表达，表明miR-295可能作为胰腺治疗分子靶点的潜力癌症。

材料和方法

临床标本

患者胰腺癌组织样本胰腺癌患者（男性7人，女性5人；年龄范围39–68岁年龄）和匹配的对照正常组织（7男5女；年龄范围，39–68年）样本在潍坊人民医院获得医院（中国潍坊）。这些标本立即snap冷冻并储存在液氮中，直到进一步加工。本研究经潍坊市道德委员会批准人民医院。书面知情同意书也来自所有参与本研究的患者。

细胞系、培养条件和寡核苷酸转染

人胰腺癌细胞系PANC-1，BxPC-3、Capan-2、SW-1990和AsPC-1，以及人类正常胰腺细胞系HPDE6c7购自American Type文化收藏馆（美国弗吉尼亚州马纳萨斯）。获得HEK293T细胞来自上海生物化学与细胞生物学研究所（中国上海）。所有细胞均在改良Dulbecco’s培养基中培养Eagle's medium（DMEM；Thermo Fisher Scientific，Inc.，马萨诸塞州沃尔瑟姆，美国）补充10%胎牛血清（FBS；Thermo FisherScientific，Inc.），并在5%CO中保持在37°C2大气。

miR-296模拟物和阴性对照（NC）购自上海基因制药有限公司（中国上海）。AKT2（5′-AGTGACCATAATGACTTC-3′）和NC（5′-TCTACGAGTCGGCATTC-3’）小干扰RNA（siRNA）来自广州RiboBio有限公司（中国广州）。PANC-1和Capan-2细胞使用Lipofectamine 2000转染这些寡核苷酸试剂（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）作为交付代理，遵循制造商的协议。

RNA分离和逆转转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）

从临床标本和使用TRIzol试剂的细胞（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，根据制造商协议。总RNA为使用PrimeScript RT试剂盒反向转录成cDNA（中国大连Takara生物技术有限公司），以下为制造商协议。cDNA的qPCR分析使用荧光染料掺入法预混料Ex Taq（塔卡拉生物科技有限公司）荧光报告探针。检测到miR-296表达带有发夹式miRNA qPCR定量试剂盒（上海基因制药有限公司）。qPCR的20µl反应体系包含10µl SYBR绿色I混合漆、2µl正向底漆、2¦µl反向底漆和4µl双重蒸馏水。qRCR的热循环条件为如下：95°C持续30秒；95°C 40次循环5秒；和60°C30秒。使用以下引物：miR-296正向，5′-TGCCTACTAATTCAGAGGTTGG-3′和背面，5′-CTCCCTCTGGCACAG-3′；U6正向，5′-CTCGCTGGCAGCACA-3′和反向，5′-AACGCTCACGAATTTGCGT-3′；AKT2正向，5′-TCCAGAACACCAGCACC-3′反向为5′-ATTGTCCTCCAGCTCCA-3′；和GAPDH转发，5′-GCACGTCAGTGAGAAC-3′和背面，5′-TGGTGAAGACGCAGAGGA-3′。RT-qPCR在ABI Prism 7700序列检测器中进行（应用生物系统公司；赛默飞世尔科技公司）。相对miR-296和AKT2 mRNA的表达水平使用第2个-ΔΔCq方法(22)并将结果归一化为U6miR-296的表达和mRNA的GAPDH表达。

细胞计数试剂盒8（CCK8）检测

用CCK8（Dojindo）评估细胞增殖Molecular Technologies，Inc.，日本熊本）。转基因细胞收获后重新悬浮成单细胞悬浮液。A类总计4×10三150µl培养基中的细胞在96孔板中每个孔接种。之后的不同时间点播种（1、2和3天），细胞增殖测定如下如下：向每个孔中添加10µl CCK8分析溶液，并且在37°C下培养4小时。样品在450 nm处的吸光度使用多孔分光光度计（BioTekInstruments，Inc.，Winooski，VT，USA）。

跨井运移和侵入化验

迁移和入侵能力使用Costar Transwell评估胰腺癌细胞插入物（孔径，8µm；美国纽约州康宁市康宁公司）。用40µg/孔Matrigel（BD）预涂膜生物科学，加利福尼亚州圣何塞，美国），用于入侵检测。共转染后48h，收集细胞并重新悬浮在无血清DMEM中形成单细胞悬浮液。接种细胞以5×104细胞在250µl无血清培养基中；培养基在下室中添加20%的FBS。之后37°C下培养48小时，膜顶部的细胞用棉签小心取出。下面的单元格膜用甲醇固定，用结晶紫和然后在光学显微镜下计数（×200；奥林巴斯公司，日本东京）计算他们的相对数字。

蛋白质印迹分析

转染后72小时，细胞收集并在放射免疫沉淀分析溶解缓冲液中溶解补充蛋白酶抑制剂（罗氏诊断，巴塞尔，瑞士）和磷酸酶抑制剂（Merck KGaA、Darmstadt，德国）。总蛋白的浓度使用双茚二酸蛋白检测试剂盒（Pierce；Thermo FisherScientific，Inc.）。相等将提取的蛋白质样品（20µg）分离10%SDS-PAGE并转移到聚偏二氟乙烯膜上（EMD Millipore，美国马萨诸塞州Billerica）。膜被5%无脂牛奶，然后在4°C下隔夜培养以下主要抗体：鼠抗人单克隆AKT2抗体（1:1000稀释；分类号sc-5270；Santa Cruz生物技术公司（美国德克萨斯州达拉斯）和抗人单克隆抗体GAPDH抗体（1:1000稀释；分类号sc-69778；Santa Cruz生物技术公司）。用含0.5%的TBS清洗三次后吐温，用辣根探测膜过氧化物酶结合山羊抗鼠免疫球蛋白G（1:5000稀释；猫。编号：sc-2005；Santa Cruz Biotechnology，Inc.）2小时在室温下。用增强的化学发光蛋白质印迹检测试剂（GE Healthcare生物科学，匹兹堡，宾夕法尼亚州，美国）协议。GAPDH被用作AKT2的负荷控制。波段使用荧光化学成像系统量化强度（Alpha Innotec，GmbH，Kasendorf，德国）。

生物信息学分析

为了预测miR-296的假定靶点，使用TargetScan进行生物信息学分析(http://www.targetscan.org/)和米兰达(http://www.microrna.org/microrna/).

荧光素酶报告试验

野生型（Wt1和Wt2）pMIR-AKT2-3′UTR和上海合成了突变体（Mut1和Mut2）pMIR-AKT2-3′UTRGenePharma Co.，Ltd.将HEK293T细胞接种在24孔板中密度为1.0×105细胞/孔并转染miR-296 mimics或NC，以及pMIR-AKT2-3′UTR Wt(1,2)或pMIR-AKT2-3′UTR静音(1,2)根据制造商的协议。转染后总共48小时收集细胞并进行萤光素酶报告基因测定使用双荧光素酶报告分析系统（Promega公司，威斯康星州麦迪逊，美国）协议。雷尼利亚荧光素酶活性被用作萤火虫荧光素酶活性的内源性调控。化验结果是一式三份。

统计分析

使用SPSS进行统计分析软件版本17.0（SPSS，Inc.，美国伊利诺伊州芝加哥）。数据为表示为平均值±标准偏差。比较了数据使用学生的t吨-方差测试或分析Tukey的事后测试。P＜0.05被认为表明具有统计学显著性差异。

结果

miR-296在胰腺中的表达癌症组织和细胞系

RT-qPCR用于检测miR-296在人胰腺癌组织样本和匹配的正常组织样品(图1A). miR-296型胰腺癌组织中的表达与匹配对照组织（P<0.05）。的表达式级别miR-296也在人胰腺癌细胞系中进行了评估在人类正常胰腺细胞系HPDE6c7中(图1B). RT-qPCR显示miR-296所有胰腺癌的表达均显著下调细胞系与HPDE6c7细胞比较（P<0.05）。

图1。 miR-296在胰腺癌组织和细胞系。（A） miR-296表达12例配对胰腺癌组织和匹配正常组织中的水平通过逆转录定量法对组织进行定量聚合酶链反应*与正常人相比P<0.05组织。（B） 5种胰腺癌细胞中miR-296的表达水平细胞系和人正常胰腺细胞系HPDE6c7也被已评估*与HPDE6c7细胞相比P<0.05。miR-296，microRNA-296。

miR-296的过度表达抑制PANC-1和Capan-2细胞的生长

为了研究在胰腺癌中，miR-296模拟物用于上调胰腺癌细胞中miR-296的表达。PANC-1型以及表现出最低miR-296表达的Capan-2细胞，用miR-296模拟物或NC转染。共48小时转染后，转染效率通过RT-qPCR(图2A). 结果发现在PANC-1和Capan-2细胞系中，miR-296水平为转染后显著增加（P<0.05）。CCK8分析研究miR-296对胰腺的影响癌细胞增殖(图。2B型). 检测显示细胞生长显著被PANC-1和Capan-2细胞中miR-296过度表达抑制（P<0.05）。

图2。 miR-296抑制PANC-1和Capan-2细胞。（A） miR-296在PANC-1和用miR-296模拟物或NC转染Capan-2细胞后逆转录定量聚合酶链测定反应。（B） 进行CCK8分析以评估miR-296对胰腺癌细胞生长的影响。在PANC-1和Capan-2中细胞，转染后生长受到明显抑制miR-296模拟*与NC组相比P<0.05。miR-296，microRNA-296；NC，阴性对照。

miR-296的过度表达抑制PANC-1和Capan-2细胞的迁移和侵袭

Transwell迁移和侵入分析研究miR-296过度表达对胰腺癌细胞的迁移和侵袭能力是恶性转移的关键(图3A和B). PANC-1和Capan-2细胞转染miR-296模拟物后，表现出明显的损害与非传染性疾病转染者相比，其迁移和侵袭能力细胞数（P<0.05）。这些发现表明miR-296的表达在胰腺癌中下调，其过度表达可能通过抑制生长和胰腺肿瘤的转移。

图3。 miR-296抑制迁移和PANC-1和Capan-2细胞的侵袭能力。（A） Transwell公司进行迁移和侵袭分析以评估miR-296对胰腺癌细胞迁移和凋亡的影响入侵。（B） 迁移和入侵的细胞数量为转染PANC-1和Capan-2细胞的miR-296模仿*与NC组相比P<0.05。miR-296，microRNA-296；NC，阴性对照。

miR-296直接靶向AKT2胰腺癌

为了探索miR-296在胰腺癌中的生物信息学分析确定潜在的靶基因。结果表明该基因AKT2的编码包含两个可能的miR-296结合位点3英尺UTR(图4A). 荧光素酶进行报告者分析以调查miR-296是否直接靶向AKT2(图4B).结果表明，miR-296过度表达导致AKT2-3′UTR Wt 1中荧光素酶活性显著降低和AKT2-3′UTR-Wt2组（P＜0.05）潜在的结合位点消除了miR-296的抑制作用过度表达。此外，western blot分析(图4C)证明miR-296过度表达诱导AKT2表达显著降低PANC-1和Capan-2细胞（P<0.05）。然而，miR-296过度表达对PANC-1和PANC-1中AKT2 mRNA的表达没有影响Capan-2细胞(图4D),表明miR-296抑制AKT2的表达转录后水平。这些结果表明miR-296可能直接靶向胰腺癌细胞中的AKT2。

图4。 miR-296直接靶向AKT2胰腺癌。（A） miR-296在AKT2的3′UTR。（B） miR-296过度表达导致AKT2-3′UTR Wt 1和AKT2-3′UTR Wt 2组。然而，潜在结合的突变位点消除了miR-296对HEK293T细胞的抑制作用。（C） miR-296降低PANC-1和Capan-2细胞。（D） 逆转录定量聚合酶链式反应表明AKT2 mRNA水平保持不变miR-296模拟物转染后*与NC组。miR-296，microRNA-296；3′UTR，3′非翻译区；Wt中，野生型；NC，阴性对照。

RNA干扰用于沉默表达PANC-1和Capan-2细胞中AKT2的表达。转染效率通过western blot分析进行评估(图5A)这表明在两个细胞中细胞株，转染AKT2 siRNA显著降低AKT2表达水平（P<0.05）。AKT2 siRNA转染后或进行NC siRNA、CCK8和跨孔迁移分析研究AKT2对胰腺癌细胞生长的影响，迁移和入侵(图。5B-D公司). 结果表明，沉默AKT2对miR-296的过度表达具有类似的抑制作用PANC-1和Capan-2细胞的生长、迁移和侵袭（P<0.05）。这些结果表明AKT2可能作为一种直接的胰腺肿瘤细胞中miR-296的靶点。

图5。 （A） 测定AKT2蛋白水平通过western blotting用AKT2 siRNA或NC siRNA进行后转染。（B） 进行CCK8分析以评估AKT2对胰腺癌细胞生长。在PANC-1和Capan-2细胞中，生长转染AKT2 siRNA后显著抑制。（C） 进行跨井迁移和侵入分析AKT2对胰腺癌细胞迁移的影响和入侵。（D） 迁移和入侵的细胞数量为转染PANC-1和Capan-2细胞的AKT2 siRNA.*与NC组相比P<0.05。3′UTR，3′非翻译区；Wt，野生型；NC，阴性对照；小干扰RNA，小干扰RNA。

讨论

阐明潜在的分子机制胰腺癌的发生和发展对肿瘤的发展至关重要新型治疗策略(23). 胰腺癌是一种侵袭性疾病以基因突变积累为特征的癌症类型在各种基因中，包括癌基因和抑癌基因(24,25). miRNAs可以负向调节基因直接靶向特异性mRNA并诱导表达抑制平移或劈开(14). 他们与人类癌症的发展，包括胰腺肿瘤(26,27).因此，miRNAs作为一种新的治疗手段具有巨大的潜力胰腺癌治疗策略。

本研究证明miR-296是胰腺癌组织和细胞系中下调。在此外，miR-296过度表达可以显著抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。此外，AKT2被发现是胰腺癌中的miR-296。据我们所知，这是第一项研究是研究其表达、生物学作用和miR-296在胰腺癌中的作用机制。

最近的研究表明，miR-296作为人类体内的肿瘤抑制因子。miR-296在非小细胞肺癌，而miR-296过度表达减少直接靶向Polo-like激酶1的细胞活力(28). 前列腺癌的特征是肿瘤内miR-296水平较低，而miR-295水平恢复表达可抑制肿瘤细胞的生长和侵袭前列腺癌细胞通过下调高迁移率组蛋白HMGA1(29). 在此外，增强的miR-296表达降低了前列腺癌的增殖与锚定非依赖性生长细胞系，通过下调Pin1，一种异构酶，其上调可能与致癌有关(30). 在人类乳腺癌组织中，miR-296水平似乎降低，miR-295表达较低与无病生存率降低相关。此外，miR-296表达水平的降低与癌症在整个系列中的传播更早远处转移。此外，miR-296已被证明可以减少肿瘤生长体内通过封锁SCRIB可能与癌症进展有关的蛋白质(31). 这些发现表明miR-296在人类致癌过程中的基本作用恶性肿瘤的进展，并说明其作为针对各种癌症的治疗靶点。

相互矛盾的研究表明miR-296可能作为癌基因发挥作用。在胃癌中，miR-296上调在肿瘤组织中，而异位miR-296表达可以增强通过抑制细胞周期阻滞和凋亡肠特异性转录因子的抑制尾相关同源异型盒1(32).miR-296的表达似乎也在食管鳞癌，miR-296下调抑制食管鳞癌的增殖细胞在体外和体内通过抑制细胞周期调节器cyclin D1和p27(33). 可能会出现这些相互矛盾的结果不同细胞类型之间的基本差异，以及展示潜在机制的复杂性肿瘤发生。本研究证明miR-296是胰腺癌中miR-296表达下调抑制胰腺癌的生长、迁移和侵袭细胞。

鉴于miR-296在致癌，本研究进一步研究了该基因miR-296的靶点，试图探索其机制潜在的胰腺癌发生。生物信息学分析用于预测miR-296的可能靶基因，并揭示AKT2在其3′UTR中包含两个可能的miR-296结合位点。荧光素酶报告分析证实AKT2是一个直接靶点胰腺癌细胞中miR-296基因，而RT-qPCR和western blot分析显示miR-296负调控转录后水平的AKT2表达。最后，AKT2沉默对miR-296在胰腺肿瘤细胞。这些结果表明miR-296可能通过直接作用于胰腺癌靶向并抑制AKT2表达。

AKT是一种保守的Ser/Thr激酶，参与在磷脂酰肌醇-3激酶/AKT途径中各种细胞过程，如增殖、迁移、，侵袭、代谢与细胞凋亡(34,35).AKT信号通路的异常与此相关患有多种人类癌症，包括乳腺癌、前列腺癌、，肺癌、肝癌和胶质母细胞瘤(36,37).AKT由三种亚型组成：AKT1、AKT2和AKT3。胰腺内癌症，据报道AKT2在mRNA和蛋白质水平，而其催化活性也增强(38,39). 这些发现表明AKT2在胰腺癌发病机制中的作用。的调查结果本研究确定AKT2是miR-296，表明miR-296/AKT2途径可能是有希望的治疗靶点胰腺癌。

总之，本研究报告称miR-296在胰腺患者组织中下调肿瘤和胰腺癌细胞系。这些发现提示它可能通过抑制胰腺癌细胞的生长、迁移和侵袭。在此外，AKT2被证实是miR-296的直接靶点胰腺癌细胞，提示miR-296作为一种新基因的作用胰腺癌的治疗靶点。

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