介绍
类风湿关节炎（RA）是一种慢性自身免疫性疾病，在女性中发病率较高Oliveira和Fierro（2018）以炎症过程为特征，全球流行率为0.3%至1%。目前治疗类风湿关节炎的药物主要分为以下几类：非甾体抗炎药、治疗疾病的抗风湿药、糖皮质激素和生物反应调节剂(Zhang等人，2015年). 这些治疗的局限性与副作用和给药不便有关，并在部分患者中观察到(Zhang等人，2015年). 已经开发出越来越多的补充和替代药物治疗，以减轻RA的严重程度并改善患者的身体状况。以多元治疗为特征的中药/民族药的发展为RA的治疗提供了一种具有代表性的方法。
白果Gaultheria leucocarpa变量。云南（Franch.），在TC/EMs中称为“点白珠”，属于杜鹃花科，主要分布于中国西南部。在彝族被广泛用作治疗RA、慢性气管炎等炎症性疾病的民间药物(刘等人，2013). 许多含滇白珠的非处方TC/EM用于治疗RA，例如，透骨香软膏、金谷连胶囊/片剂、风合竹痹酊和滇白竹糖浆。它们的主要成分包括水杨酸衍生物、木脂素、黄酮和从云南广藿香(刘等，2015;Xu等人，2016年). 分离物来源高氏牙形石属如MSTG-B、MSTG-A、gaultherin和绿原酸具有抗炎和镇痛活性，这些都已通过使用体内和在体外模型(Zhang等人，2011年;谢等人，2014;Nabavi等人，2017年). 抗风湿性关节炎成分（ARF）G公司.云南通过筛选活性确定，发现其活性优于上述单一有效成分。本研究的研究小组通过模拟胃肠液和人体肠道细菌模型进行了验证在体外ARF在胃肠道相对稳定(Wang等人，2019年). ARF抗RA进展作用的生物活性成分和分子机制尚不清楚。
系统生物学和生物信息学的发展为发现用于治疗类风湿性关节炎的中草药的作用机制创造了机会。网络药理学是从整体角度阐明和解释多成分和多靶点药物的协同作用和潜在机制的合适工具(郭等，2015;Kibble等人，2015年). 在大多数研究中，网络药理学考虑草药数据库中的类药物成分，而这些成分的包容性和覆盖率往往被忽视。因此，特别是对于少数民族药物，如民族药物点白术，网络药理学预测的主要成分和靶点可能与事实不符。因此，有必要建立一个更全面的TC/EM类药物相似性评价体系。
目前制药行业面临巨大压力，尤其是在降低医疗成本和筛选新化合物数量方面(Yang等人，2019年). 吸收、分布、代谢和排泄（ADME）的分子特性在药物设计和开发的评估系统中至关重要。由于吸收不良，许多潜在药物的开发已经停止。包括ADME特性在内的几种筛选范式已被用于提高药物开发阶段的成功概率。传统的研究方法和模型正在发生变化，无法满足新药研发快速发展以及海量数据操作的要求。使用机器学习（ML）开发ADME预测模型来处理高通量信息，特别是定量结构-活性关系（QSARs），作为一种统计模型，定量关联化学结构信息（称为分子描述符），已成为一种趋势反应终点（生物活性、性质、毒性等）(Khan和Roy，2018年). 这在ADME数据模型的建立和预测中占据着至关重要的地位。目前，ADME预测也被应用于设计新的抗2019年新型冠状病毒病（COVID-19）的化合物(Hage-Melim等人，2020年). 作为化学计量学研究的基础和热点之一，它受到了广泛的关注，并被广泛应用于有机微污染物的处理技术中(Huang等人，2020年)有机污染物的迁移与转化、药物的开发与设计、图形信号处理(Matsushita等人，2019年)和环境相关研究(Song等人，2020年). 通过对有助于目标属性的选定描述符进行分类和/或回归分析，建立QSAR模型(Gaikwad等人，2016年). ML实现的相关分析主要包括偏最小二乘（PLS）、随机森林（RF）、K近邻（KNN）、误差反向传播训练（EBPT）、判别分析（DA）、PLS-DA、支持向量机（SVM）等单分类器算法(Jiang等人，2020;Maharao等人，2020年;Spiegel和Senderowitz，2020年). 长期以来，在使用所报告的QSAR模型方面存在一些障碍，包括变量选择、数据冗余以及公共领域缺乏一致和同质的数据(Lee等人，2020). 药物发现速度的加快提高了对有效预测方法的需求。遗传算法（GA）在变量选择、模型优化和效率方面具有很大的优势。虽然在QSAR模型构建中单独使用遗传算法或与其他算法结合使用是一个关键的终点，但公共领域中几乎没有数据(埃蒙迪和卡隆，2019年). 因此，尝试将遗传算法与多个单一分类器相结合，构建QSAR模型，以获得具有良好预测性能的高效ADME预测模型。
为了研究ARF对RA的治疗作用，对ARF的多组分和多尺度机制进行了系统研究，并采取了以下步骤：云南广藿香使用超高效液相色谱结合线性离子阱轨道质谱法（UHPLC-LTQ-Orbitrap-MSn个); 2） 测定大鼠佐剂性关节炎（AIA）的器官指数体内观察关节的组织学和病理学变化，分析ARF对RA的抑制能力以及炎症因子的释放；3） 提出了基于RF、SVM、KNN、PLS-DA和EBPT单独或结合GA的ADME特征QSAR模型。预测并评估了ARF化合物的ADME相关参数；4） 对关键靶点进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析、KEGG通路和基因本体（GO）富集分析；5） 为了研究潜在的机制，开发了化合物-共同靶点和RA相关通路网络，并选择关键靶点进行后续实验验证在体外因此，更好地理解ARF的潜在药效学可以为治疗RA提供新的见解。目前，这种探索策略可以展示ARF缓解RA的关键活性成分和潜在机制，并为筛选RA的临床新治疗方法带来重大益处。本研究的整体框架图如所示图1.
材料和方法
试剂和抗体
滇白竹采自楚雄（中国云南）。甲氨蝶呤（MTX）购自SPH Sine Pharmaceutical Laboratories Co.，Ltd.（H3102067804，中国上海）。阿司匹林购自江苏平光制药有限公司（中国江苏省H19980197）。弗氏完全佐剂（FCA，101722747）和β-肌动蛋白（A5441）来自美国西格玛公司。RA的人成纤维细胞样滑膜细胞（HFLS-RA）购自湖南丰惠生物科技有限公司（中国湖南）。DMEM/F12培养基（18219003）、FBS（190913）和青霉素-链霉素溶液（30002303）来自北京比奥迪生物科技有限公司（中国北京）。IL-1β（P01584）由Novoprotein Technology Co.，Ltd.（中国江苏）提供。大鼠IL-2 ELISA试剂盒（KA30281115）、大鼠IL-1βELISA试剂瓶（KA301B90421。一抗（抗兔）和二抗（抗鼠）购自Cell Signaling Technology，Inc.（CST，USA）。使用针对以下蛋白质的抗体：EGFR（18986-1-AP）、MMP9（10375-2-AP）、IL2（Ab92381，Abcam）、MAPK14（8690，CST）和KDR（Ab126679，Abcam）。这些抗体以及RIPA裂解缓冲液（S1004）、蛋白酶抑制剂（KGP603）、BCA KIT（Thermo，USA）均由北京百维生物科技有限公司（中国北京）提供。AB-8树脂来自中国河北沧州邦吸附器科技有限公司。
抗风湿性关节炎组分的制备
滇白竹是从云南白果Gaultheria leucocarpa var.yunnanensis（法语）TZ Hsu和RC。Fang来自高氏牙形石属Kalm ex L.（杜鹃花科）(Wang等人，2019年). 样品由魏胜利教授（北京中医药大学）鉴定。凭证标本和草药保存在中药化学实验室（B417）。ARF的编制如前所述(Wang等人，2019年). 简单地说云南广藿香用238-L 30%乙醇-水三次提取（17kg），每次2h，采用热循环提取法。将溶剂从乙醇提取液中完全蒸发，得到粗提取物（约1.7 kg）。将总乙醇提取物溶解在水中，然后用AB-8树脂柱吸附。依次用蒸馏水和35%乙醇-水洗脱，得到35%洗脱分数（约500 g）。将该部分在减压下浓缩，得到ARF粉末。然后将其溶解在蒸馏水中，并通过0.22-μm过滤器进行UHPLC-LTQ-Orbitrap-MSn个分析。
UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS鉴定抗风湿性关节炎组分中的化合物n个
对于UPLC-ESI-MSn个实验中，大多数分析条件与已报道的Wang等人（2019）除梯度程序和注入量外。流动相系统由0.1%甲酸-水溶液（A）和乙腈（B）组成。梯度程序如下：0-2min，10%B；2–10分钟，10–20%B；10–12.5分钟，20%B；12.5–17.5分钟，20–40%B；17.5–25分钟，40–80%B；25–27.5分钟，80–95%B；27.5-33分钟，95%B。注射体积为5μL。
动物实验
动物
所有动物均按照中国生理学会《动物护理和使用指导原则》以及北京中医药大学动物护理委员会的授权进行手术。
8周龄SPF Wistar大鼠，平均体重为（200±20）g，雄性和雌性大鼠数量相等，来自北京Vital River实验动物技术有限公司（认证号SCXK（京）2016-0006）。这些动物被安置在北京中医药大学适宜的温度和湿度条件下，光/暗周期为12小时。所有Wistar大鼠都被允许适应7天的环境，并且可以免费获得自来水和食物。
佐剂性关节炎模型的建立及分组
ARF用蒸馏水稀释用于试验体内ARF的最低剂量选择是电白珠每日剂量的两倍，其次是RA患者（25 g/60 kg体重）。驯化1周后，Wistar大鼠被随机分为7组(n个=8）：对照组（空白组）、模型组（模型组）、ARF治疗组1（608 mg/kg/d，ARF-H）、ARF-治疗组2（304 mg/kg/d，ARF-M）、ARF-治疗组3（152 mg/kg/d、ARF-L）、MTX治疗组（0.5 mg/kg/d）和阿司匹林治疗组（100 mg/kg/d。右后脚皮下注射FCA建立RA模型。注射7天后，ARF-、MTX-和阿司匹林治疗组分别口服ARF、MTX和阿司匹，为期21天。空白组和模型组用蒸馏水处理。
关节炎严重程度评估
在初次免疫后每两天对大鼠进行一次观察。关节炎的严重程度与之前的研究相同(郭等，2016;Slovák等人，2017)包括关节炎评分、体重、后爪体积、四肢关节炎百分比以及关节炎首次出现的时间。
组织病理学分析
第一次免疫后28天，大鼠颈部脱位处死。解剖后肢，包括爪子和脚踝，立即用4%多聚甲醛固定，并用石蜡包埋。将组织切片（5μm）安装在普通载玻片上，用苏木精-伊红（H&E）或藏红-O-固绿染色。盲目评估组织病理学特征。数据表示为平均炎症评分，所有部分由两名训练有素的观察者随机分组并评估，他们对治疗组和每只大鼠的关节炎严重程度一无所知(Zhang等人，2015年).
酶联免疫吸附试验
在第27天获取所有AIA大鼠的血样，并用肝素钠抗凝。根据试剂盒的方案，使用市售大鼠ELISA试剂盒检测血浆中IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-2的水平，并在405 nm处测定吸光度(Park等人，2020).
吸收、分配、代谢和排泄评估
ADME的特性有助于药物发现过程早期阶段的重要任务。为了评估ARF的生物活性，使用KNN、SVM、RF、PLS-DA、EBPT和GA建立QSAR预测模型，以评估药代动力学特性，即口服生物利用度（OB）、P-糖蛋白底物（PGPS）、P-糖蛋白抑制剂（PGPI）、人体肠道吸收（HIA）和Caco-2细胞通透性（Caco-2）。
根据之前报道的参考文献，应用ML方法构建QSAR模型，但有一些变化(Welling等人，2015年;Wenzel等人，2019年). 简单地说，使用PaDEL-Descriptor软件生成的1100个化合物的一维和二维分子描述符（MD）的不同组合、数据剪枝和拆分以及MATLAB 2017a软件中实现的ML工具，获得了几个QSAR模型(Przybyek和Cysewski，2018年;Chen等人，2020年). 在开发模型之前，通过丢弃低方差和高相关性的描述符列表，进一步完善了描述符列表。为了评估和验证目的，使用了留一交叉验证和五倍交叉验证。最佳模型的选择是基于对所有化合物组获得的正确分类的准确性；训练集（TRS）、测试集（TES）和验证集（VAS）在补充材料通过与参考文献进行比较，进一步验证了预测结果。模型的详细建模过程、评估方法、验证和应用领域分析都包含在补充材料.
网络建设
抗风湿性关节炎组分成分的靶向预测
UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS表征的化合物n个已选择用于下一个协议。根据QSAR模型预测ADME性质的结果筛选活性化合物。根据Yang等人（2019）。PharmMapper服务器(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper网站/，更新日期：2019-04-10），用于预测ARF成分的潜在目标。此外，如果拟合分数≥4.0，则保留目标（如果拟合分数不≥4.0，那么将分数调整为3.5）。设置的其他参数是Generate Conformers:Yes；最大生成构象：300；选择目标集：仅人类蛋白质目标；保留的匹配目标数量（最大1000个）：300(Wang等人，2017年).
RA已知治疗靶点
通过关键词“类风湿关节炎”，已知的RA相关靶点主要从现有的常见资源中获得，如DrugBank和OMIM数据库。只有那些药物被FDA批准用于RA治疗的药物与靶点相互作用以及那些人类基因/蛋白质靶点才被使用(Tian等人，2019年). 此外，从治疗靶点数据库、Yaozhi、ChemicalBook、BaseChem、YaoDu、SuperTarget和Binding数据库收集的靶点补充了已知的RA相关靶点数据。PPI分析用于进一步筛选核心药物靶点。
网络建设
使用Cytoscape软件（3.6.2版）构建了以下网络：ARF的假定靶网络；已知RA相关目标网络；公共目标PPI网络；ARF的复合-靶-通路网络(Franz等人，2016年). PPI网络是根据从STRING数据库获得的信息构建的(https://string-db.org/)，然后使用Cytoscape软件进行可视化(Mou等人，2020年).
网络拓扑特征集定义
为了评估网络中每个节点的拓扑特性，根据之前的研究评估了四个特征，即度值（DV）、节点度分布（NDD）、节点间中心性（NBC）和节点接近中心性（NCC）(郭等，2016). 网络中节点的重要性是通过这些指数的值来确定的，值越高表示重要性越大(Zheng等人，2013).
富集分析
利用DAVID 6.8数据库分析PPI网络相关蛋白的GO功能和KEGG通路富集，探讨ARF目标化合物的功能注释及其在信号转导中的作用(https://david.ncifcrf.gov网址) (Banerjee等人，2019年). 如前几次调查所述对-从DAVID数据库中获得的值经过了改进，Fisher精确对-值(Huang等人，2008年). 统计显著性的边界值为对< 0.05.
实验验证在体外
细胞培养与药物治疗
HFLS-RA在DMEM/F12培养基中培养，加入10%FBS、100μg/ml链霉素和100 U/ml青霉素，5%CO237°C时(Wang等人，2020年). 所有实验均在第4代和第8代之间使用细胞。使用50-ml DMEM/F12培养基和FBS超声分散约3.3252 g ARF。使用相同的培养基将悬浮液稀释10倍，以获得初始ARF溶液（A0，6.6504 mg/ml）。通过两倍稀释法获得ARF的一系列给药浓度，即3.3252（A1）、1.6626（A2）、0.8313（A3）、0.4157（A4）、0.2078（A5）、0.1039（A6）、0.05196（A7）、0.0260（A8）、0.0130（A9）和0.0065 mg/ml（A10）。对不同浓度（A1–A10）的ARF进行过滤，并使用0.22-μm滤膜进行消毒，以进行进一步实验在体外同样，5×10的细胞毒性−3μM（MTX-1），1×10−3μM（MTX-2），5×10−4μM（MTX-3），5×10−5μM（MTX-4），5×10−6μM（MTX-5），1×10−6μM（MTX-6）对HFLS-RA也进行了研究。实验在HFLS-RA播种后12小时进行。HFLS-RA（6.6×104细胞/皿）与1 ng/ml IL-1β和不同浓度的ARF（1.6626、0.4157和0.05196 mg/ml）或MTX（1×10−5μM）持续48小时。为了评估细胞增殖能力，使用MTT法检测暴露于不同浓度ARF/MTX（含或不含IL-1β）的细胞培养液(Zhai等人，2017).
西方印迹法
按照下述方法进行蛋白质印迹：郭等（2017）和赵等（2018）简单地说，HFLS-RA是在RIPA裂解缓冲液中采集和裂解的。以16000×克在4°C下保持20分钟，以分离上清液。首先，收集HFLS-RA中的总蛋白，并使用BCA试剂盒进行定量。定量蛋白质样品经过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，并用脱脂奶（5%）密封(Wang等人，2020年). 其次，将PVDF膜与相应的一级抗体在4°C下孵育过夜，然后与辣根过氧化物酶结合二级抗体孵育（1:2000）(Wang等人，2020年). 然后使用可视化化学发光仪器测量膜，并使用ImageJ软件进行分析。β-actin作为参考。
统计分析
数据以学生的t吨-显著性水平的方差检验或单向分析对< 0.05 (Chen等人，2019年)使用SPSS 22.0和GraphPad Prism 6.0，数值表示为平均值±SD。
结果
UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS分析抗风湿性关节炎组分中的化学成分n个
在负离子模式下，利用UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS快速鉴定ARF中的化学成分n个; ARF中化学成分的鉴定方法与之前报道的方法一致Wang等人（2019）.质量误差阈值固定在±5 ppm。共鉴定并初步表征了48个化合物，包括7个水杨酸甲酯糖苷衍生物、13个黄酮类化合物和12个有机酸，以及16个其他化合物。这些部件的MS数据列于补充表S2，ARF的总离子色谱图如所示图2.
抗风湿性关节炎组分改善佐剂性关节炎大鼠的症状
抗风湿性关节炎组分对RA相关病理过程影响的推断
本研究采用FCA诱导的AIA大鼠，观察ARF对RA的治疗作用。模型组可见关节炎的溃烂、肿胀等形态学特征。然而，治疗组明显减轻了AIA大鼠关节炎的严重程度(图3A). 组织病理学结果(图3B、C)表明AIA大鼠踝关节存在大量炎性细胞涌入、滑膜增生和软骨和骨严重侵蚀。ARF治疗大鼠的炎症和滑膜增生症状以及关节破坏明显减轻。ARF对软骨损伤有保护作用，可以减轻AIA大鼠骨损伤和软骨损伤的程度。在治疗过程中，使用ARF的AIA大鼠的AI评分明显低于使用汽车治疗的AIA鼠(图3D、E). ARF对胸腺、脾脏、肝脏、心脏、肾脏和肺部没有明显损伤，通过比较AIA模型大鼠获得的OI很容易发现(图4A-F). 值得注意的是，MTX组大鼠心脏、肝脏和肾脏的OI值高于其他组；然而，胸腺的OI值小于其余六组的值(对< 0.05). 这表明MTX对这些脏器有害，而ARF对AIA大鼠是安全的。这些结果表明，ARF可降低AI评分，抑制滑膜增生，改善软骨损伤，保护模型大鼠的内脏器官，但明显不依赖于使用剂量。
抗风湿性关节炎组分对佐剂性关节炎大鼠细胞因子产生的影响
采用ELISA法测定四种细胞因子，以评估ARF对AIA大鼠促炎细胞因子产生的影响。治疗AIA动物3周后，发现除阿司匹林外，ARF和MTX治疗组的TNF-α水平与模型组无显著差异(对> 0.05,图5A). 三种剂量的ARF之间没有显著差异(对> 0.05). 口服高、中剂量ARF显著抑制AIA大鼠IL-1β和IL-6水平(对<0.01）与模型组相比(图5B、C). 与模型组相比，所有三种ARF剂量的治疗均显著降低AIA大鼠的IL-2水平(对< 0.01) (图5D). 总之，ARF对改善血浆中IL-1β、IL-2和IL-6的含量具有剂量依赖性，表明ARF对RA的作用主要是通过抑制三种细胞因子水平的上调。有趣的是，尽管ARF的活性成分与阿司匹林具有相同的结构单元，但ARF的这种作用机制与阿司匹不同，后者更类似于MTX。
抗风湿性关节炎组分中化学成分的吸收、分布、代谢和排泄特性预测
综合考虑预测精度、变量个数、操作时间、模型稳定性等因素，最终得到优化的五属性预测模型，分别记录为PGPI-SVM、PGPS-RF+GA、Caco 2-SVM、HIA-SVM和OB-PLS-DA+GA。五个属性的QSAR模型的筛选和优化的详细信息参见补充表S1、S3–S13和补充图S1-S8.
根据PaDEL-Descriptor软件计算ARF中47种成分的MDs。根据中描述的预处理方法，MATLAB软件排除了约703个MD变量补充方法最后，得到了47×741（化合物数×MDs）的数据矩阵。在预处理MD和PCA分析后，利用本研究建立的每种性质的五个最佳模型，得到ARF中化合物的ADME性质预测结果。详细数据如所示表1采用文献验证的方法验证了ARF中各成分的ADME性能预测结果。使用约47种化学成分和5种ADME属性名称作为关键词搜索CNKI中的相关文献(网址：https://www.cnki.net)和PubMed数据库（NCBI，https://www.ncbi.nlm.nih.gov). 一些化合物的验证结果列于补充表S13这与本研究的预测结果一致。与参考值相比，总预测准确率为95.56%，表明五种模型都是相对准确可靠的。ARF中含有25个OB（+）和22个OB，42个Caco 2（+），5个Caco 1（-），16个PGPS（+）以及31个PGPS，21个PGPI（+）及26个PGPI。结果表明，ARF中的大多数成分具有较高的膜透性、较好的肠道吸收特性和较好的口服生物利用度。
复合常见目标网络分析
RA的260个目标和ARF的303个目标共有44个重叠(图6A)表明它们可能是RA治疗中ARF的关键。为了显示ARF如何作用于RA，ARF中活性化合物的靶点以及公共靶点网络（简称CCTN）显示在图6B已鉴定出33种对RA有治疗作用的活性成分。44个蓝色节点表示RA和ARF之间的重叠目标。钻石节点代表ARF中的活性成分：红色、橙色、紫色、绿色和粉红色钻石节点分别代表水杨酸甲酯苷（7）、黄酮（13）、木脂素（5）、有机酸（4）和其他类别成分（4）。边表示节点之间的相互影响。
网络集中度和异质性分别为0.476和1.222，表明一些节点对该网络的贡献大于其他节点。据估计，这些节点可能是关键的，值得进一步研究。如所示补充表S15多组分具有多靶点，如芍药苷（度=40）、乙酸龙脑酯（度=16）、柠檬酸（度=13）、9-十八烯酸（度=10）、橙皮苷（度=8）和芦丁（度=8）。同时，同一目标受多化合物影响，例如GSTP1（度=25）、AKR1B1（度=18）、VDR（度=12）和HPRT1（度=10）。这些研究结果表明，ARF缓解RA的多维作用是由一种成分-多靶点和一个靶点-多成分的风格决定的。需要说明的是，由于数据库和现有文献的限制，芍药苷的靶点数量明显多于其他化合物。这不仅是使用网络药理学方法的优点，也是一个缺点，表明这些成分和靶点应该通过深入研究加以验证。
共同靶点蛋白质相互作用网络分析
本文建立了包括ARF和RA疾病共44个靶蛋白的PPI网络，以评价ARF的细胞功能和过程。详细信息请参阅补充表S16Cytoscape软件用于对该PPI网络进行可视化和拓扑分析。综合评分和DV用于评估边缘和节点的大小。在删除两个断开连接的节点（PDE4B和SEC14L2）时，结果表明该网络包含42个节点和125条边(图6C). 根据拓扑分析结果，PPI网络中三个相应指标均高于平均DV 5.95的节点、节点间中心性（NBC，3.97×10−2)和节点紧密度中心度（NCC，0.40）被视为主要节点。共有10个靶点，包括EGFR、MMP 9、IL-2、Mapk14、KDR和其他五种蛋白质（如表2)，最终被选中。据估计，这10个目标很可能是ARF发挥抗RA作用的核心目标。因此，选择了10个关键节点进行GO和KEGG途径的富集分析。
KEGG通路富集分析
使用Cytoscape 3.6.2软件绘制ARF的组件密钥目标路径网络图，如所示图7A在DAVID平台上从KEGG中筛选出与10个核心靶点和RA密切相关的信号通路，以充分认识ARF在改善RA中的功能和作用。通过KEGG富集共获得27条途径，并绘制了KEGG途径的气泡图图7B。使用财务总监<0.05为临界值，筛选出7条信号通路(补充表S17). 关键靶点主要与这些信号通路有关，例如癌症中的蛋白聚糖（折叠富集=13.8，对<0.01）和Rap1信号通路（折叠富集=13.1，对<0.01），PI3K-Akt信号通路（折叠富集=7.98，对<0.01）和Ras信号通路（折叠富集=9.13，对< 0.05). 这些结果表明，ARF可能作用于这些信号通路，以达到治疗RA的目的。
ARF中不同类型的化合物用不同的颜色表示，并绘制了成分-核心靶点-通路网络(图7A). 与核心靶点和途径相关的主要化学成分类型为ARF中的黄酮类化合物和水杨酸甲酯苷类化合物，分别含有9种和4种成分。此外，三种有机酸、两种木脂素和四种其他成分与核心靶点和途径略有关联。结果表明，黄酮类化合物和水杨酸甲酯苷可能是ARF抗RA作用的关键成分。已证实ARF的药理作用是由多组分和多靶点产生的。这些成分和靶标可以部分或同时对相似或相同的生物过程产生影响。如所示图7B在癌蛋白多糖、Rap1信号通路和PI3K-Akt信号通路的KEGG通路分析中，各有四个靶基因。上皮细胞信号转导幽门螺杆菌感染途径和Ras信号途径各包含三个靶基因。其他途径（如膀胱癌）中存在两个靶基因。特别是，根据上述网络通路分析和已发表的文献，发现关键核心蛋白或通路与细胞生理过程或炎症有关(Chen等人，2020年;Ney等人，2020年;刘等人，2021年). 例如，PI3K/AKT、Rap1和Ras信号通路与炎症进展的发生和发展密切相关，炎症进展可以调节促炎和抗炎因子的平衡，以及组织中炎症的持续或缓解(Shah等人，2018年;刘等人，2021年). 因此，推测ARF通过抗炎作用缓解RA；因此，为下一次实验选择了五个关键目标来验证这一点。
基因本体丰富分析
利用DAVID V6.8数据库的GO分析功能，对10个核心靶点进行富集分析，以验证电白珠抗RA作用。获得约63个GO项目（包括42个BP、13个MF和8个CC项目）(补充表S18)，以及导出的GO气泡图，如所示图7C. The对-利用Fisher精确检验算法计算值，对GO富集结果进行排序，以识别和区分其重要性。除了调节参与炎症反应和蛋白质自磷酸化的细胞因子外，BP还主要与细胞周期蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、蛋白磷酸化、有丝分裂细胞周期G1/S转换以及细胞生长、增殖和迁移的正调控有关，以及中性粒细胞介导的免疫（如补充表S18). MF主要涉及各种蛋白质结合、酶活性、ATP结合、受体激活等方面。CC包括细胞外间隙、膜筏、内胚体、肥大细胞颗粒、核周区、细胞外区域、信息节点、膜等对<0.01和FDR<0.05，进一步确定了两个GO项目，如补充表S18其中，有一项与生物过程有关，主要涉及蛋白质磷酸化的正调控（GO ID:0001934，Fold富集=506，对< 0.001). 有一项与分子功能相关，即受体信号蛋白酪氨酸激酶活性（GO ID:0004716，折叠富集=52.9，对< 0.001). 综上所述，推测ARF的抗RA作用主要与蛋白质磷酸化的生物学过程和受体信号蛋白酪氨酸激酶的活性有关。
抗风湿性关节炎组分抑制IL-1β诱导的HFLS-RA增殖
众所周知，IL-1β刺激的HFLS-RA模型用于开发RA治疗的中间靶点。以细胞活力为指标，首次研究了IL-1β（1、2、10、20、50和100 ng/ml）对HFLS-RA增殖的影响。如所示图8A1、2、10和100 ng/ml IL-1β刺激明显增强HFLS-RA的细胞增殖活性（与空白组相比，对分别<0.001、0.01、0.05和0.05），表明IL-1β可以诱导HFLS-RA增殖。在本研究中，选择IL-1β（1 ng/ml）与细胞孵育48 h以最终诱导炎症。ARF对HFLS-RA的潜在细胞毒性作用在体外进行了安全性和有效性测试。如所示图8B、CMTT试验结果表明，ARF（0.0065–3.3252 mg/ml）和MTX（1×10−6至5×10−3μM）对HFLS-RA的细胞活力无明显抑制作用。ARF（0.0519–1.6626 mg/ml）对IL-1β诱导的HFLS-RA增生有显著抑制作用（与模型组相比，对< 0.001,图8D). 结果表明，ARF能安全有效地抑制IL-1β诱导的HFLS-RA的增殖，且呈剂量依赖性。
抗风湿性关节炎组分调节EGFR、MMP9、IL2、MAPK14和KDR的表达
根据DV、NBC和NCC值的顺序表2结合ARF在抑制RA过程中的重要性和相关性，选择了5种靶蛋白，即EGFR、MMP9、IL2、MAPK14和KDR，以验证网络药理学分析的结果和ARF治疗RA的作用机制。Western blot检测EGFR、MMP9、IL2、MAPK14和KDR的表达水平。波段如所示图9A.灰度分析结果如所示图9B–9F模型组HFLS-RA中MMP9、IL2、MAPK14和KDR的水平明显高于空白组(对< 0.05). ARF-L、ARF-M、ARF-H和MTX组IL-2、MAPK14和KDR的表达降低(对< 0.05). ARF-H和MTX组MMP9的表达水平显著下调(对< 0.05). 更有趣的是，与空白组相比，IL-1β诱导的HFLS-RA中EGFR的表达水平降低，但无显著性差异(对> 0.05). 术后ARF-H和MTX组EGFR表达水平上调，但仍低于空白组(对> 0.05). 与ARF-H组相比，ARF-M组和ARF-L组EGFR的表达量没有明显上调(对> 0.05). 数据表明，ARF能有效下调HFLS-RA中MMP9、IL2、MAPK14和KDR的含量，提示ARF可能通过靶向MMP9/IL2/MAPK14/KDR蛋白来缓解RA症状。
讨论
目前，RA的主要治疗方法基本上集中在缓解症状和改变生活方式上。在过去的二十年里，从依赖广泛活性的传统药物，现在的焦点已经转向使用单克隆抗体、融合蛋白或靶向小分子的更特异的药物，这些药物通常以单个受体、细胞因子或细胞类型为靶向(Davis等人，2020年). 这一改变改变了RA的治疗，但随之而来的是风险，如感染并发症(Schett等人，2020年). 目前还没有开发更多治疗RA的新药的有效策略。由于TC/EM的化学成分复杂多变，因此很难解释和揭示其机理。结合ML和网络药理学，提出了一种基于从化合物到机制的全局跟踪定位的TC/EM开发策略，需要进一步探索。这一战略与技术合作/应急机制的整体发展相吻合。滇白术作为一种中草药，长期用于治疗RA。迄今为止，尚未对ARF治疗RA的疗效进行系统药理学评估。
本研究的可分解研究框架及其之间的关系以及关键结果如所示图形摘要在本研究中，首次使用UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS鉴定了ARF的成分n个在负离子模式下。共有48种化合物在ARF中进行了表征。随后，根据已知化合物的ADME性质数据，通过一系列统计方法建立了ADME性质预测或分类的QSAR模型。使用QSAR模型评估ARF中这些成分的ADME参数。研究表明，ARF具有显著的潜在生物和药理活性，具有良好的药物相似性。在建模过程中，需要注意的是，大多数基于PCA总数据集的模型计算时间长，质量差。因此，采用名为PCA-80的数据矩阵对每种算法的训练和建模进行研究。因此，总共开发了50个具有可靠和正确统计数据的ADME属性分类预测模型。此外，实例的仿真结果证明，与五个单分类器相比，用遗传算法训练五个单标识符的方法可以提高模型的计算精度和收敛速度。结果还证实了属性类型和单个分类器对提高模型遗传算法的可扩展性都有一定的影响。遗憾的是，在这些性质和单个分类器中，只有RF结合GA才能更有效地对化合物的PGPS进行分类，这在QSAR模型的建立中起着重要作用。遗传算法选择合适的描述符有助于模型的可扩展性。模型中变量过多，不仅计算量大，还可能导致边模型不稳定。为了解决这个问题，应该进行变量筛选。遗传算法可以处理任何形式的目标函数和约束，无论是线性还是非线性、离散还是连续(彭等，2014). 建议未来的QSAR模型结构应综合分析和比较多个因素之间的相互作用，而不仅仅是简单的技术叠加。本研究中使用的计算方法和模型可用于预测未来其他药物的ADME表现。
潜在作用机制和实验验证在体外通过网络药理学预测探讨ARF对RA的影响。值得一提的是，在模拟胃肠液和人体肠道细菌培养的ARF中可以检测到芦丁和异槲皮素在体外(Wang等人，2019年). 它们是ARF中黄酮类化合物的主要代谢产物。据报道，它们具有显著的抗RA作用(Adhikary等人，2018年;Teixeira等人，2020年). 因此，基于ARF发挥整体作用的思想，还选择芦丁和异槲皮素作为主要成分，以促进ARF对RA治疗靶点预测和验证的研究。通过PPI网络拓扑分析，筛选出约10个ARF直接或间接治疗RA的核心靶点，如EGFR、MMP 9、IL-2、MAPK14、KDR、ACE、NOS2、ADAM17、KIT和AKR1B1。据推测，它们可能通过蛋白质磷酸化过程和调节受体信号蛋白酪氨酸激酶活性，在基因水平促进RA的改善。特别的是，最近的研究证实，这些靶点在类风湿性关节炎中发挥着多种作用(Ren等人，2019年). 这五个核心靶点与炎性因子之间的相关性也验证了实验结果的准确性和合理性体内实验表明，ARF通过下调AIA模型大鼠血浆中IL-6、IL-1、IL-2和TNF-α的含量，发挥抗RA作用。研究结果表明，ARF可以通过调节这五个靶点的表达来影响RA的发生和发展，从而发挥治疗作用。
此外，很少有KEGG通路被ARF治疗RA的核心靶点/基因丰富，主要包括癌症中的蛋白聚糖、Rap1信号通路、PI3K-Akt信号通路、癌症中的通路、RAS信号通路等(补充表S17). 据报道，Ras和PI3K-Akt信号通路与RA密切相关，分别通过激活各种下游靶蛋白和诱导凋亡使炎症持续存在于组织中(Fu等人，2020年). 推测ARF的关键靶点通过参与多种途径在抗RA中发挥协同作用。此外，富集途径和靶点的数量总体上相对较少，这可能与文献中很少报道ARF的化学成分有关。这也表明TC/EMs网络药理学研究数据库存在一些局限性。有许多开源数据库可以使用，但它也增加了目标和路径预测的难度和准确性。在本文中，类黄酮和水杨酸甲酯苷与ARF的核心靶点和途径关系更密切，其次是其他成分、有机酸和木脂素。结果反映了多种成分之间的相互作用方式，表明ARF中黄酮类和水杨酸甲酯苷对RA作用的重要性。这些成分类型与ARF及其代谢产物在胃肠道的成分类型基本一致，表明ARF作为一个整体起到抗RA的作用。这种完整性反映在多成分-目标-途径中。结果清楚地表明，ARF通过PI3K-Akt信号通路、Ras信号通路等10个核心靶点上的水杨酸甲酯苷类、黄酮类、有机酸、木脂素等成分对RA发挥药效作用。本研究为RA的防治提供了新的认识和临床前基础。
结论
在这项工作中，使用UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS对ARF的48个主要成分进行了表征n个在ML算法的基础上，建立了50个关于这些组分ADME性质的QSAR模型。五种性质的最终优化模型被成功应用于ARF的生物活性预测。结果表明，遗传算法在建立和筛选QSAR模型时不利于每一个ML，其优势更多地取决于组分的性质。未来还需要通过增加化合物的数量来进一步评估。ARF的网络药理学分析表明，ARF中的水杨酸甲酯苷和黄酮类化合物与RA的治疗更相关(图7A). 进一步的实验验证也提供了令人信服的证据，即ARF可以通过恢复EGFR、MMP 9、IL2、MAPK14和KDR的表达水平，以及通过调节炎症因子逆转RA进展过程中的病理事件，部分减轻RA。白果Gaultheria leucocarpa变量。云南是本研究课题组近十年来开发的一种民间药物，但其药效成分和作用机制尚未被发掘。在本研究中，确定了抗RA化合物及其潜在机制，可作为治疗RA的一种潜在选择而无副作用。
本研究首次将药物靶点和ADME性质预测与网络分析结合起来进行综合分析，阐明ARF缓解RA的药理机制。该系统研究有助于揭示这种病因不明的复杂疾病的TC/EM规律。由于新冠肺炎即将出现毕业时间和意外情况，本研究中QSAR模型预测的相应ADME特性，以及网络药理学预测的相关关键靶点和途径，对新冠肺炎的抗RA作用进行了预测G公司.云南尚未得到充分的测试和验证，这将在本研究的后续研究中进一步调查。
数据可用性声明
本文中包含了本研究中的原始贡献/补充材料，可向相应作者进行进一步查询。
道德声明
该动物研究由北京中医药大学动物护理委员会审查和批准。
作者贡献
XW：进行实验，数据整理，撰写初稿。YS：操作、建模。LL：操作，建模。XR：调查，软件。四十： 进行了实验，可视化。YW：进行了实验，软件。YD：准备ARF，计算。JM：准备ARF、软件。RS：调查、验证。AY：验证。JW：验证，进行实验。QF：调查、数据收集。MG：可视化、调查。TZ：数据收集、数据管理。RD：数据收集。GS：监督、写作审查和编辑。
基金
本研究得到了国家自然科学基金（No.82074121，82104531，81573692，81001697）的资助。
利益冲突
作者声明，该研究是在没有任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或金融关系的情况下进行的。
审稿人YS在审稿时向经办编辑声明了与作者的共同从属关系。
出版商备注
本文中表达的所有声明仅为作者的声明，不一定代表其附属组织的声明，也不一定代表出版商、编辑和审稿人的声明。任何可能在本文中进行评估的产品，或制造商可能提出的索赔，都不受出版商的保证或认可。
补充材料
本文的补充材料可以在以下网站上找到：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2021.7040/full#补充-材料
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词汇表
ARF抗风湿性关节炎部分
ADME的吸收、分布、代谢和消除
主成分分析
TRS训练套件
TES测试集
VAS验证集
GA遗传算法
胎牛血清
PGPI P-gp抑制剂
PGPS P-gp物质
HIA人体肠道吸收
OB口服生物利用度
QSAR定量结构-活性关系
ML机器学习
RF随机林
KNN K-最近邻
PLS-DA偏最小二乘判别分析
EBPT误差反向传播训练
支持向量机
SMOTE合成少数过采样技术
IR失衡指数
LOO离开十字架
5 FCV 5倍交叉验证
曲线下AUC面积
RMSE均方根误差
ER错误率
MCC Matthew相关系数
OA总体预测精度
SE灵敏度
SP特异性
ROC接收机工作特性曲线
AD应用程序域
SR标准化残差
类风湿性关节炎的HFLS-RA人成纤维细胞样滑膜细胞
DV度值
NDD节点度分布
NBC节点之间的中心性
NCC节点贴近度中心性
MSTG-B苯甲酸甲酯-2-O-β-D-吡喃葡萄糖（1→2） -[O-β-D-木吡喃糖（1→6） ]-O-β-D-吡喃葡萄糖苷
MSTG-A水杨酸甲酯-2-O-β-D-木吡喃（1→2） -[O-β-D-木吡喃糖（1→6） ]-O-β-D-吡喃葡萄糖苷
甲基水杨酸愈创木脂素-2-O-β-D-木吡喃糖（1→6） -O-β-D-吡喃葡萄糖糖苷
