显示的固有颜色首选项爪蟾蝌蚪是持久性的，需要Tegmum

介绍

在整个动物王国中，色觉对生存至关重要。动物使用颜色提示进行导航，并确定食物、住所、配偶和捕食者的位置。颜色线索是如此重要，以至于许多颜色引导的行为都是天生的，而不是后天习得的。包括斑马鱼在内的许多生物都有天生的颜色偏好(Spence等人，2008年;Guggiana-Nilo和Engert，2016年;Park等人，2016年),果蝇属(Lazopulo等人，2019年)，蜜蜂(Ostroverkhova等人，2018)鸡和鸭(赫斯，1956年;科瓦赫，1971年)、天蛾(Kuenzinger等人，2019年)还有几种不同的青蛙和蝌蚪(蒙兹，1963年;Jaeger和Hailman，1976年). 在实验上，先天的颜色驱动行为为研究光感受器和生物体区分不同波长光的能力提供了一种方便的读数。除了视网膜水平外，对先天色彩驱动行为的机制了解得更少(Kelber等人，2003年). 本研究的重点是色彩驱动行为本身的神经基础非洲爪蟾蝌蚪。的许多方面非洲爪蟾(X·莱维斯)蝌蚪使它成为研究先天视觉行为的有趣模型生物。首先，这种爪蟾已经存在了大约1750万年(Furman等人，2015年)，而其他通常研究的两栖动物，如美洲大蟾蜍和虎纹钝口螈仅在130万年前分离(Masta等人，2002年)和1000万年前(Shaffer和McKnight，1996年)分别是。除了是一个高度保守的物种外，非洲爪蟾是已知的入侵性最强的物种之一，因此了解其行为可以了解其持久的成功。第二，研究神经电路形成和功能的流行模型爪蟾蝌蚪视觉系统已被详细描述（在刘等，2016;Pratt等人，2016年). The rods of the爪蟾视网膜在色觉方面特别有趣，因为它们含有视蛋白，这些视蛋白通常存在于不同波长调谐的视锥细胞中，但与哺乳动物的视杆一样，它们对低强度（即昏暗）光仍然敏感。这意味着蝌蚪和青蛙可以根据其检测阈值区分不同的颜色(Solessio等人，2004年;Parker等人，2010年;Yovanovich等人，2017)，有利于识别南非浑浊池塘底部植物或其他动物的颜色。最后，以前的趋光性研究报告称，蝌蚪表现出天生的颜色偏好，喜欢对中光谱波长的光（绿色）进行光敏，并避免短波长（蓝色）(蒙兹，1963年;Jaeger和Hailman，1976年). 这些趋光性研究采用了一种强制选择范式，在这种范式中，蝌蚪被迫一次性决定对试验箱中两个不同颜色的手臂之一进行趋光。这里，为了扩展生成的结果通过在强制选择实验中，我们使用了一种新的开放场测试范式来表征自由泳发育阶段48/49只蝌蚪的长期颜色偏好。在48/49发育阶段，大约受精后11–18天，蝌蚪表现出强大的视觉引导行为，包括视觉回避行为、视觉运动反应（OMR；Dong等人，2009年)以及区分不同颜色的能力(Blackiston和Levin，2012年;Rothman等人，2016年). 使用这种方法，我们确定了一种持久的颜色偏好，产生这种偏好的行为动力学，以及表达这种偏好所需的潜在电路。

材料和方法

蝌蚪

所有畜牧业和实验程序均由怀俄明州大学动物护理和使用委员会（IACUC）批准。非洲爪蟾蝌蚪是从成年野生型的室内交配中获得的爪蟾青蛙或来自Nasco（美国威斯康星州阿特金森堡）。蝌蚪在斯坦伯格的溶液中饲养，并在22°C的白色孵化器中以12:12的光/暗周期饲养。所有实验均在发育阶段48/49只蝌蚪上进行（约11–18 dpf；每只的分期Nieuwkoop和Faber，1994年)每个实验组由来自四个或更多不同离合器的数据组成。阶段48/49涵盖蝌蚪生命周期的1周以上(Nieuwkoop和Faber，1994年). 虽然蝌蚪的形态在这段时间内是稳定的，但我们确定，在第48阶段的早期，在11–12 dpf时，观察到的绿色偏好仍在发展，但在13至18 dpf时保持稳定(补充图S1). 为了控制48/49阶段的这种轻微异质性，所有的颜色偏好实验都是在13-18 dpf的蝌蚪上进行的，在这个年龄范围内，绿色偏好是稳定的。

开放场组颜色偏好分析

在一个自然主义的环境中，动物们不断地与环境互动并适应环境。动物在新环境中的第一次运动行为并不一定反映出它的运动行为。为了解释这一点并量化蝌蚪随时间的颜色偏好，我们开发了一种新的检测方法，该方法使用扫描取样方法(奥尔特曼，1974年). 十种野生型爪蟾将蝌蚪转移到一个直径为140 mm的圆形培养皿中，培养皿中装满斯坦伯格溶液，深度为6 mm（75 ml）。盘子被白纸包围，以遮挡任何无关的视觉刺激，并放在LCD电脑显示器上（HP ZR22W或Dell E198FPf），以便光线投射到盘子的地板上。蝌蚪被允许适应1分钟，然后用数字摄像机（GoPro，San Mateo，CA，USA）记录它们的行为，以便随后进行分析。为了避免视觉引导行为中潜在的昼夜节律依赖性变化（振荡），所有颜色偏好分析都在下午2:00到4:00之间进行。

在记录的每一分钟，记录下感兴趣区域内蝌蚪的数量，以表征蝌蚪随时间的颜色偏好(图1A). 如果蝌蚪的两只眼睛都在感兴趣的区域，则认为蝌蚪在感兴趣区域。如果一只眼睛位于感兴趣的区域，而另一只眼睛不在，那么只有当蝌蚪的头部大部分位于感兴趣区域时，才能确定蝌蚪位于感兴趣区。否则，蝌蚪被认为不在关注区域。

投射到盘子地板上的光线因实验而异。除了一个对照实验，其中盘子的整个地板都是白色的，光总是被投射，使得盘子的一个象限（占盘子地板的25%）是一种颜色，而其他三个象限是黑色或白色。所有视觉刺激都是在Adobe Photoshop Creative Cloud 2018（19.1.4版）的实验室颜色模式下生成的。在Photoshop中，白色刺激的亮度通道（L）值为100，而黑色刺激的L值为0。绿色刺激的实验室值为L:75，a:-75，b:75（最接近的RGB:0，216，0）。蓝色刺激的实验室值为L:25、a:50、b:-100（最接近的RGB:0、33、221）。红色刺激的实验室值为L:50、a:75、b:50（最接近的RGB:232、20、42）。

通过每次试验记录蝌蚪60分钟的行为，对野生型蝌蚪的绿色偏好进行了初步试验。然而，已确定偏好不会随时间变化(图1D). 因此，随后的实验记录了蝌蚪每次试验30分钟的行为。

只有在至少75%的蝌蚪连续10分钟不动的情况下，绿色偏好试验才被排除在分析之外。在这种情况下，蝌蚪的不动意味着任何分析都不再量化蝌蚪游泳行为。这一标准仅排除了78项试验中的两项。每组10只蝌蚪只接受一次测试，但视顶盖（OT）消融组和被盖消融组除外，这两组蝌蚪进行了两次测试，以尽量减少接受消融的蝌蚪数量。

行为动力学

个人偏好

为了评估组内个体蝌蚪的偏好，对两个试验中的个体进行了30分钟的手动跟踪。使用相同的标准，我们用于量化群体偏好，在每一分钟的时间点，确定个体是否在盘子的绿色象限中游泳。通过这种方法，我们确定了每只蝌蚪在盘子绿色象限中的时间百分比。

游泳速度

我们通过测量蝌蚪在进入盘子的绿色或指定的白色象限后立即在300帧（10秒）内行走的距离，量化了绿色偏好最强的那些试验的游泳速度。在所分析的七个视频中，每一个视频都记录了15分钟后的前五个过境点（视频的27000帧），分别是菜的绿色象限和指定的白色象限的边界。使用Measure函数在ImageJ 1.51m9版本中量化所有游泳距离。

为了纳入数据集，蝌蚪必须在300帧中的至少150帧（10帧中的5帧）内保持在感兴趣的区域（即盘子的绿色或白色象限）。例如，如果一只蝌蚪进入盘子的绿色象限，但在30帧（1s）后离开绿色象限时，该数据点不能用于量化绿色中的游泳速度。然而，这种情况极为罕见，这一标准仅排除了39个试验中的4个。

交叉分析

为了量化蝌蚪跨过绿色象限的频率，我们计算了进入绿色象限和进入盘子白色部分绿色象限正对面象限的跨过次数(图2A原理图）。在每个视频的第10分钟进行所有交叉测量（第18000-19800帧）。

深色养育

为了测试视觉体验对颜色偏好的表达是否必要，一些蝌蚪在没有所有视觉刺激的情况下饲养，即完全黑暗，从发育阶段25（约3 dpf）到测试阶段48/49（13–18 dpf）。在阶段25，爪蟾蝌蚪还没有形成眼杯(Nieuwkoop和Faber，1994年). 因此，在开始暗读程序之前，没有视觉信息到达大脑的任何区域。

与对照蝌蚪一样，深红色蝌蚪在22°C的培养箱中饲养。孵化器的内部没有灯，但考虑到任何可能漏光的情况，碗上还完全覆盖了铝箔。在测试开始前几秒钟，铝箔一直保持在碗上，在评估颜色偏好之前，尽量减少对任何视觉刺激的暴露。

Tectal和Tegmal消融

在所有消融手术中，48只蝌蚪在0.01%MS-222中被麻醉，直到它们不再游泳（大约5-10分钟）。一旦完全麻醉，个体蝌蚪被转移到斯坦伯格的溶液浸湿的纸巾上。使用无菌的25号针头，在中线处，通过OT上方的皮肤切开一个小切口，以接近OT和被盖。

Tectal消融

由Leica Microsystems机械手（德国Wetzlar）控制的锋利玻璃吸管以倾斜、几乎水平的角度穿过切口，进入位于机械手一侧对侧的OT背侧叶(图3B). 与报告的程序类似McKeown等人（2013）移液管被推进并缩回，在OT的整个叶上造成一到两处刺伤，然而，没有抽吸来移除神经元。接下来，移液管完全收回，蝌蚪旋转180°，在另一个OT叶上重复该过程。

小腿消融

被盖直接位于尾侧腹侧，是OT最广泛（“最宽”）的区域(图3A;Bernardini等人，2010年;Miraucourt等人，2012年;Bandin等人，2013年). 两个中脑区域沿D-V轴被大中脑室（MV；图3B、C).

颞叶消融与顶盖消融类似，不同的是移液管的放置角度更陡，这样移液管就可以横穿大MV穿透颞叶(图3C). 对于不同的消融程序，通过覆盖皮肤的切口大小和针头大小是相同的，唯一的区别是针头进入大脑的角度和距离(图3B、C原理图）。

药理学操作

对于长期接触选择性血清素再摄取抑制剂（SSRI）曲唑酮的蝌蚪，从发育第43阶段（约4 dpf）开始，将1μM或10μM盐酸曲唑酮（Sigma–Aldrich，目录号T6154）添加到其Steinberg饲养液中直到他们接受了颜色偏好测试（阶段48/49，约13-18dpf）。每48小时更换一次各组的饲养液，直到实验结束。为了观察曲唑酮的急性作用，蝌蚪在测试前仅24小时暴露于相同浓度。在急性和慢性实验中，每组10只蝌蚪在2天内进行了30分钟的绿色与白色、绿色与黑色对比试验。

统计分析

所有描述性统计均以平均值±标准平均误差（SEM）的形式报告。通过Shapiro-Wilk检验，确定了几个数据集遵循非正态分布（观察绿色和白色盘子绿色象限中野生型蝌蚪的数量：W公司= 0.962,对=2e–16，n个= 1,620; 盖突蝌蚪速度数据，白色象限中的速度：W公司= 0.918,对=0.02，n个=30，绿色象限：W公司= 0.821,对=1e–4，n个= 30). 因此，所有分析均采用非参数检验。Kruskal–Wallis检验用于多组比较，所有成对比较均采用非参数Mann–Whitney U检验本杰米尼和霍奇伯格（1995）对多次比较进行适当修正。采用Wilcoxon符号秩检验对理论值进行比较。使用R进行统计分析(2020年R核心团队)、Excel和Graphpad/Prism。

结果

在所有实验中，将10只48/49级蝌蚪（约13–18dpf）放在电脑显示器顶部的一个大培养皿中。四分之一的培养皿被给定的颜色（绿色、蓝色或红色）照亮，剩下的四分之三的培养皿是白色或黑色(图1A). 蝌蚪在盘子周围自由游动的过程中被拍摄了30分钟，盘子彩色象限内蝌蚪的数量每分钟统计一次。假设盘子的有色部分是整个区域的四分之一，如果没有对给定颜色的偏好或回避，预计平均有25%的蝌蚪会在任何给定的时间点占据有色象限。大于或小于25%的值分别表示对彩色象限的偏好或回避。25%的理论值假设蝌蚪在盘子中随机分布。为了测试可能造成蝌蚪在盘子中分布不均匀的上学行为，蝌蚪被记录在一个全白色的盘子中。我们发现，平均24.4±0.9%(n个=11次试验），蝌蚪在任何给定时间点占据全白盘子的指定象限(图1B)，反映出测试皿中蝌蚪分布均匀。此外，指定象限内蝌蚪数量的两个最常见值分别是2和3，这表明没有发生成群现象(图1C).

蝌蚪表现出温和但一致的绿色优先于白色

此前有报道称，第48阶段爪蟾蝌蚪避光避暗(Moriya等人，1996年)但也有报道称，在同一发育阶段，他们更喜欢绿色而不是其他颜色(Jaeger和Hailman，1976年). 为了确定哪个偏好优先，我们将绿色与白色进行对比。我们观察到，与全白盘子的指定象限相比，在任何给定时间占据绿色象限的蝌蚪明显更多[图1B，Kruskal–Wallis测试比较所有组：对=0.001，总计n个=46项试验，下面报告了各组样本量以及各组各自的配对比较；全白盘子指定象限内蝌蚪的平均数量：24.4±0.9%，n个=11次试验；绿色象限：32.4±1.8%，n个=18次试验；Mann–Whitney U检验事后（post-hoc）全白盘子和绿白盘子之间的比较，以及Benjamini-Hochberg（BH）的调整：对= 0.02]. 事实上，我们最经常在绿色象限观察到3或4只蝌蚪(图1C). 偏爱绿色的适度性可能是因为菜肴中更明亮的白色区域同时具有竞争吸引力。如果是这样，那么在与黑色进行测试时，对绿色的偏好会更加明显。然而，当与黑色相比时，观察到的对绿色的偏好与与白色相比时相似(图1B，绿色和黑色盘子：33.6±2.2%，n个=5次试验；与绿色和白色菜肴的对比(n个= 18)通过Mann–Whitney U测试事后（post-hoc）带BH调整：对= 0.85). 两个实验中绿色象限内蝌蚪数量的分布相似(图1C)这表明，对绿色的偏好并没有因为对更高亮度（白色）的竞争吸引力而减弱。这与之前的研究形成对比，之前的研究报告称，在蝌蚪活动期间，亮度偏好可能会掩盖颜色偏好最初的趋光决定(Jaeger和Hailman，1976年). 鉴于这种行为上的差异，我们研究了蝌蚪与白色相比，随着时间的推移，是否表现出对其他颜色的偏好。我们发现，蝌蚪在红色象限的时间往往多于白色象限，尽管对红色的偏好在统计上并不显著[图1B; 红色象限蝌蚪平均数量：29.1%±1.9%，n个=6次试验；与全白菜肴的比较(n个= 11)通过Mann–Whitney U测试事后（post-hoc）带BH调整：对= 0.11). 有趣的是，蝌蚪倾向于避开蓝色，尽管这在统计学上也不显著(图1B; 蓝色象限内蝌蚪的平均数量：19.1%±2.3%，n个=6次试验；与全白菜肴的比较(n个= 11)通过Mann–Whitney U测试事后（post-hoc）带BH调整：对= 0.11].

总的来说，这些数据表明，无论剩下的3/4只蝌蚪是黑色（比绿色深）还是白色（比绿色亮），如果有选择的话，48/49级蝌蚪将在绿色象限中花费更多的时间。通过绘制试验每分钟绿色象限中蝌蚪的数量，进一步分析了绿色数据对白色数据的偏好。此图如所示图1D，揭示了对绿色的偏好是在第一分钟建立的，并且偏好程度在整个试验期间是稳定的。因此，对绿色的偏好不仅在试验期间，而且在试验期间都是一致和持久的。

个体蝌蚪对绿色的偏好与群体平均水平接近

观察到的对绿色的偏爱可能是由于所有蝌蚪都表现出对绿色的适度偏爱，也可能反映出另一种分布，例如双峰分布，其中一些蝌蚪强烈偏爱绿色，而一些则避开绿色。为了确定是哪种情况，我们追踪了10只蝌蚪，并在每个时间点（间隔1分钟）确定蝌蚪是否在绿色象限内。这项分析表明，个体蝌蚪表现出的偏好与整个群体的平均水平密切相关。事实上，单个蝌蚪对绿色的偏好与测试组的平均值之间的差异平均只有11%，没有一只蝌蚪的绿色偏好与组平均值之间差异超过19%(表1)表明群体偏好的大小反映了每个蝌蚪的偏好。

游泳速度的变化是绿色偏好的全部原因

对绿色的偏好可能是由于进入绿色时游泳行为的改变，蝌蚪进入绿色的频率增加，或两者兼而有之。为了评估游泳行为的变化，在盘子的白色和绿色部分测量了蝌蚪个体的游泳速度。我们观察到蝌蚪在盘子的绿色部分比白色部分游得慢(图2A; 白色平均速度：13.14±1.14 mm/s，n个=35只蝌蚪；平均绿色速度：8.82±0.92 mm/s，n个=35只蝌蚪；Mann–Whitney U测试：对=2e–16）。事实上，蝌蚪在进入果岭时表现出惊人的速度减慢，而在离开果岭进入果岭的过程中往往会加快速度。盘子绿色和白色部分蝌蚪游泳速度差异的示例如所示图2B为了确定蝌蚪穿越绿色象限的次数增加是否也有助于绿色偏好，我们计算了蝌蚪在1分钟的时间间隔内从盘子的白色区域穿越到绿色区域的次数。我们将这个结果与蝌蚪进入指定（“任意”）白色象限的次数进行了比较(图2C). 两组之间无显著差异（绿色象限：14.14±1.62交叉/min，n个=7分钟；白色象限：12.29±1.6交叉/min，n个=7分钟；Mann–Whitney U测试：对= 0.56). 综上所述，这些结果表明，进入菜的绿色部分时游泳行为的变化可以完全解释绿色偏好。具体来说，蝌蚪在果岭上呆的时间更长，因为它们在进入果岭时会减速。

对绿色的偏好与经验无关

众所周知，在感觉电路的发展过程中，感官驱动的经验为活动依赖机制提供了活动。确定在这些阶段48/49先天性颜色偏好的表达爪蟾蝌蚪在发育过程中需要视觉体验，在没有任何视觉刺激的情况下，蝌蚪从发育阶段25（大约3 dpf，在眼镜杯形成之前）到阶段48/49（大约13–18 dpf）都是深红色的（DR），并使用与图1A我们发现，DR蝌蚪对绿色的偏好与野生型蝌蚪在12:12明/暗时间表上饲养的偏好没有差异(图3B，Kruskal-Wallis测试，比较所有组：对=0.03，总计n个=30个试验，下面报告了各组样本量以及各组各自的配对比较；绿色象限DR蝌蚪平均数量：30.9±2.8%，n个=8次试验；野生型蝌蚪：33.5±1.2%，n个= 10; Mann–Whitney U测试事后（post-hoc）构造消融蝌蚪和野生蝌蚪之间的比较，以及BH调整：对=0.62），表明先天色彩偏好的基础电路独立于视觉经验发展。尽管这里的结果表明，视觉驱动的活动对颜色偏好来说不是必要的，但这并不排除自发的、感觉独立的活动对基础电路的正确发展可能很重要的可能性。

去除色素会消除颜色偏好

接下来，我们询问观察到的颜色偏好行为背后的视觉回路。虽然已经确定蝌蚪的视觉回避行为需要一个功能正常的OT(Dong等人，2009年;沈等，2014;Liu等人，2018年)，与颜色感知有关的大脑区域尚未被描述。为了确定OT是否与颜色偏好有关，按照以下描述进行了顶盖消融：(图3B;Dong等人，2009年)通常在测试前12到18小时之间。我们观察到，与对照蝌蚪相比，切除顶盖的蝌蚪对绿色的偏好程度与白色相同。换句话说，尽管顶盖在其他视觉引导行为中起作用，顶盖的消融并不影响颜色偏好(图3D; 绿色象限中被切除顶盖的蝌蚪平均数量：32.1±1.3%，n个=6次试验；野生型蝌蚪：33.5±1.2%，n个=10次试验；Mann–Whitney U测试事后（post-hoc）构造消融蝌蚪和野生蝌蚪之间的比较，以及BH调整：对= 0.62).

另一个潜在的颜色偏好结构是被盖，这是位于OT最宽（即最广泛）区域腹侧的中脑结构(图3A). 虽然被盖在视觉处理中的作用尚未被描述，但解剖学研究描述了视网膜神经节细胞（RGC）轴突对被盖的输入(McDiarmid和Altig，1999年)我们对推测的被盖神经元的全细胞记录表明，它们从RGC轴突接收到强烈的单突触输入（未发表的数据）。为了测试被盖对颜色偏好是否必要，对其进行了手术切除。不同消融程序的切口大小和针头大小相同，唯一的区别是针头进入大脑的角度和距离（比较图3B、C原理图）。切除被盖消除了颜色偏好的表现(图3D; 绿色象限的被盖突蝌蚪平均数量：26.2±1.8%，n个=6次试验；Mann–Whitney U测试事后（post-hoc）与野生型蝌蚪的比较(n个=10），带BH调节：对=0.03）。事实上，进一步的分析表明，在绿色象限中，被剥除被盖的蝌蚪所花费的时间与偶然预期的时间没有差异，表现得好像是色盲(图3D; 单样本Wilcoxon签名秩检验与25%比较：对= 0.40). 行为偏好的缺失表明，被盖对于本研究中观察到的颜色感知和/或颜色引导行为是必要的。

鉴于对无盖蝌蚪缺乏绿色偏好，并且正常蝌蚪的绿色偏好是由于进入绿色时游泳速度的变化引起的，我们预测无盖蝌螂进入绿色时，游泳速度不会发生变化。为了验证这一预测，我们分析了盖突蝌蚪在绿色象限和指定（任意）白色象限的游泳速度，如本研究早些时候所做的那样(图2). 我们观察到白色象限和绿色象限之间的游泳速度没有总体差异(图3E; 白色平均速度：6.63±0.89 mm/s，n个=30只蝌蚪；平均绿色速度：6.34±0.79 mm/s，n个=30只蝌蚪；Mann–Whitney U测试：对= 0.99). 这一结果表明，正常蝌蚪产生绿色偏好的行为机制随着被盖的消融而消除。值得注意的是，虽然被剥除被盖的蝌蚪平均在测试皿的白色和绿色区域表现出一致的游泳速度，但它们的整体速度也比对照蝌蚪慢，甚至比盘子绿色区域的对照蝌蚪的速度还要慢(图2A). 对这一观察结果的一种解释是，消融过程可能切断被盖运动神经元的轴突或其他通过被盖的下行投射物。或者，这可能是由于被切除了被盖的蝌蚪无法感知整个测试皿中不同的视觉场景。我们推断，测试盘中的视觉场景——白色和绿色区域，以及两者之间的边界——可能会增强正常蝌蚪的运动活性。如果这是真的，正常的蝌蚪在颜色和亮度均匀的测试皿中会表现出较慢的游泳速度。为了测试这种可能性，我们在一个全白色的测试皿中测量了蝌蚪的游泳速度。与绿色和白色测试皿中记录的速度相比，观察到全白皿中的平均速度明显较慢(图3E; 全白测试皿中正常蝌蚪的平均速度：8.0±0.68mm/s，n个=30），更接近于在通常的绿色和白色测试皿中被切除被盖的蝌蚪的平均速度。这表明，测试皿的彩色图案本身刺激了运动活动，但在被膜无齿蝌蚪中没有。

暴露于选择性血清素再摄取抑制剂曲唑酮将偏好从基于颜色转换为基于亮度

众所周知，蝌蚪中缝核（位于后脑）中的5-羟色胺能神经元调节年轻人的游泳行为爪蟾蝌蚪(Sillar等人，1992年;Wedderburn和Sillar，1994年;Demarque和Spitzer，2010年;Hachoumi和Sillar，2019年). 此外，在斑马鱼中，5-羟色胺（又名5-羟色色胺，又名5HT）被证明可以调节趋光性(Burgess等人，2010年;Cheng等人，2016). 基于这些发现，我们询问5HT是否调节观察到的颜色偏好的大小或价。为了测试这一点，蝌蚪长期（从发育阶段43开始，大约在测试前10天）或急性（测试前24小时）接触SSRI曲唑酮（1μM和10μM）。然后，对对照组和暴露于曲唑酮的蝌蚪进行与前面描述的相同的绿色对白色和绿色对黑色偏好测试。由于曲唑酮的慢性和急性暴露产生了相似的效果，因此将这两组的结果结合起来。在绿色与白色的测试中，对照蝌蚪对培养皿的绿色象限表现出相同的特征偏好，而暴露于1μM和10μM曲唑酮的蝌蚪都改变了偏好，大部分时间都花在培养皿的白色（较亮）部分(图4A; Kruskal–Wallis测试比较所有组：对=4e–4，总计n个=21项试验，以下报告了单个组的样本量；对照组绿色象限蝌蚪平均百分比：33.3±2.4%，n个= 7; 1μM曲唑酮组：24.0±1.3%，n个= 7; 10μM曲唑酮组：13.9±1.9%，n个=7；Mann–Whitney U测试事后（post-hoc）与BH校正的比较：对=0.01，对照组vs.1μM，对=0.006（对照组vs.10μM曲唑酮）。在绿色和黑色测试中，对照组再次显示出对培养皿绿色区域的中度偏好，1μM曲唑酮组也是如此，10μM曲佐酮组对培养皿的绿色（较亮）区域表现出更强的偏好(图4B; 绿色象限中观察到的用于控制的蝌蚪平均百分比：40.35±3.3%，n个= 4; 1μM曲唑酮组：36±1.9%，n个= 4; 10μM曲唑酮组：52.8±2.8%，n个= 4; Mann–Whitney U检验对比对照组与10μM曲唑酮：0.0294）。总之，将蝌蚪暴露在SSRI曲唑酮下，它们的行为从更喜欢居住在盘子的绿色区域转变为更明亮（亮度更高）的区域。换句话说，特拉佐酮将蝌蚪的偏好从基于颜色转变为基于亮度。如图所示图4，长期和急性接触曲唑酮都产生了类似的效果，表明观察到的从基于颜色的偏好转向基于亮度的偏好是由于药物的急性效应，最有可能是对血清素传递的调节，而不是发育过程的改变，例如特定类型神经元的数量或电路连接方式的改变。从基于颜色的偏好到基于亮度的偏好的急剧转变表明，内源性5HT水平可能控制蝌蚪的视觉引导偏好。

讨论

本研究的主要发现是：（1）如果有选择的话，48/49只蝌蚪在自由游泳阶段，当绿色与白色或黑色形成对比时，它们在测试皿的绿色区域花费的时间要长得多。尽管这种先天行为的规模不大，但随着时间的推移，这种行为具有惊人的持久性，并且在整个试验中都是一致的。（2） 在测试皿的绿色区域中相对较慢的游泳速度可以完全解释偏好的大小。（3） 消融实验的结果表明，先天颜色偏好的表达需要被盖而不是OT，这表明蝌蚪中有两种不同的视觉流，而且迄今为止，首次报道了两栖动物被盖在颜色引导行为中的作用。（4） 暴露在SSRI曲唑酮中会激活对光的偏好，而不是对颜色的偏好，这表明这些流可能会受到5HT的差异调制。

对绿色的偏爱是持续不断的

在这项研究中，采用了一种新的开放式实验范式来确定自由游泳天生的、持久的颜色偏好X·莱维斯蝌蚪。我们发现蝌蚪对绿色的偏好最强，对红色的偏好较弱，对蓝色的偏好较弱。这些结果是根据先前的趋光性研究得出的非洲爪蟾和颞蛙，这表明在我们的研究中测试的处于相同发育阶段的蝌蚪对绿色和远离蓝色的趋光性最强(蒙兹，1963年;Jaeger和Hailman，1976年). 我们研究中使用的实验设计进一步表明，随着时间的推移，天生对绿色的偏好是持续存在的，这主要表现在盘子绿色区域的游泳速度显著下降，这是我们称之为“光合作用”的行为。因此，中光谱波长的光（“绿色”）使运动减少。绿色视觉刺激导致蝌蚪游得慢的机制是什么？基于斯皮策实验室的工作(Demarque和Spitzer，2010年)表明实验性增加了脑内5-羟色胺能神经元的数量爪蟾蝌蚪中缝缩短了游泳周期，我们推测，也许中波光（“绿色”）激活视觉系统可能会激活中缝中的血清素释放，进而抑制运动活动。我们推断，如果这是绿色依赖性运动活动减少的机制，那么实验上可以增强内源性5HT的传递通过选择性5HT再摄取抑制剂有望增强绿色诱导的运动减少，导致对绿色的更“偏好”。结果不支持我们的假设：暴露于曲唑酮的蝌蚪选择居住在最明亮的区域（当绿色与白色形成对比时，它们大部分时间都呆在白色区域；当绿色与黑色形成对比时它们更喜欢绿色区域）。由于本研究中使用的实验范式没有测试纯粹基于亮度的偏好，因此不能排除该结果背后存在波长依赖性成分。因为测试SSRI对观察到的对绿色偏好的影响的动机是为了确定蝌蚪在盘子的绿色区域游泳时减慢速度的机制，而不是为了研究亮度偏好，所以目前正在一项单独的研究中进一步描述这些意想不到的结果。尽管这项实验的结果未能阐明绿色视觉刺激如何减少运动，但它们确实表明，5HT水平可能决定蝌蚪对视觉场景的哪些品质（颜色、亮度）反应最强烈。此外，这是首次报道5-羟色胺对蝌蚪视觉引导行为的调节，这与之前的发现非常相似，即斑马鱼暴露在SSRI氟西汀下会增加对光的趋光性(Burgess等人，2010年;Cheng等人，2016).

天生的颜色偏好需要Tegmum

人们早就知道年轻人爪蟾蝌蚪能辨别不同的颜色。先前的趋光研究报告了蝌蚪天生的颜色偏好和厌恶(Jaeger和Hailman，1976年)和联想学习范式是基于这些蝌蚪容易区分红光和蓝光波长的能力(Blackiston和Levin，2012年;Rothman等人，2016年). 然而，蝌蚪大脑中颜色刺激是如何以及在何处被处理的，目前尚不清楚。蝌蚪视觉系统的主要组成部分是视网膜覆盖电路。这个回路由眼睛中的RGC组成，它们将轴突直接投射到对侧OT，在那里它们在顶盖神经元上形成突触。先前的OT消融研究已经确定，视觉回避行为需要OT(Dong等人，2009年;McKeown等人，2013年)，但OMR不需要，蝌蚪会跟随移动的光柱(Dong等人，2009年). 在这里，通过测试OT和去盖蝌蚪天生的颜色偏好，我们发现了另一种似乎不需要OT，但需要去盖的视觉行为。虽然我们的研究结果表明，被膜在先天的颜色驱动行为中起着重要作用，但不排除被膜切除的蝌蚪中观察到的颜色偏好的丧失可能是由于其他视觉引导的游泳行为（例如OMR）的破坏。然而，这种情况不太可能发生，因为众所周知，OMR与运动刺激有关，而趋光性与静止刺激有关。斑马鱼对绿光和红光的移动条是色盲的(Orger和Baier，2005年)这表明颜色驱动的趋光性和OMR，至少在斑马鱼中是由不同的视觉通路控制的功能不同的行为。此外，我们的初步数据表明，被覆盖层消融的蝌蚪表现出正常的OMR，这表明OMR是一种与OT和被覆盖层无关的行为，重要的是，被覆盖层消融的蝌蚪失去颜色偏好和游泳速度总体较慢并不是由于OMR受损，这些数据表明，两栖动物的色彩驱动行为需要被盖，此外，蝌蚪的视觉系统由涉及OT的背流和涉及被盖的腹流组成。被盖由几个不同的核组成，一般认为这些核由运动神经元和中间神经元组成。这表明被盖的输出与运动有关。虽然一项解剖学研究描述了RGC轴突向被盖视核的投射，但尚未确定蝌蚪对被盖的功能输入(McDiarmid和Altig，1999年). 在斑马鱼中，从顶盖前区到被膜中一组确定的神经元的投射被证明可以控制视觉引导的猎物捕获(Gahtan等人，2005年). 同样，我们的被盖消融数据表明，两栖动物的被盖在将视觉、颜色驱动的输入与运动输出联系起来方面发挥了作用。

壳牌游戏模型预测对安全区/喂食区的适度偏好

本研究中使用的蝌蚪对绿色表现出适度但显著的偏好，在测试前从未接触过颜色。我们发现，在完全黑暗中饲养的蝌蚪对绿色的偏好程度与在正常12:12亮/暗时间表中饲养的相同。因此，这里描述的颜色驱动行为是真正天生的，并且是硬连线的基本电路。一般来说，人们认为天生的行为能够提高个体或群体的生存率。与这一观点一致，有人建议，通过引导蝌蚪寻找绿色水生植物来增加生存机会，因为绿色水生植物为蝌蚪提供了食物和庇护所(蒙兹，1963年;Jaeger和Hailman，1976年). 同样，我们在这里观察到的对绿色的一贯偏爱会导致蝌蚪在该地区度过大部分时间，与食物和安全相关，也会促进生存。

爪蟾蝌蚪在46岁时开始觅食(McKeown等人，2017年)在本研究观察到的发育阶段之前不久。这一阶段觅食行为的发展与对绿色的偏好可能与觅食和寻求庇护有关的建议是一致的。我们发现，蝌蚪的绿色偏好是在营养受限的条件下出现的，这与报告一致，即OMR和视觉回避行为都不受营养剥夺的影响(McKeown等人，2017年). 综上所述，这些结果描绘了这样一幅图景：即使在食物匮乏的情况下，顽固的视觉引导行为仍然表现为爪蟾蝌蚪，从而提高蝌蚪生存的机会。

但是，如果居住在绿色地区真的增加了生存的机会，为什么人们对绿色的偏爱并不更强烈？如果绿色代表食物和安全的来源，蝌蚪似乎会表现出更强的偏好。一种可能性是，绿色的地板虽然确实是绿色的，但不是植物，因此不会引起最佳的行为反应。然而，一个更有趣的可能性是，持续适度的偏好最大限度地提高了生存率，因为如果蝌蚪在绿色（植物）的安全/食物来源中停留相对较长的时间，那么捕食者将更有可能了解蝌蚪（猎物）的位置。一个给定的猎物在一个安全和/或觅食区只花费适度的时间，而对给定的捕食者来说是不可预测的，这种策略是一个被称为壳博弈的捕食者-食饵动力学模型(米切尔和利马，2002年). 尽管考虑到这种特殊两栖动物难以置信的入侵能力及其巨大的进化历史，我们无法明确确定持续适度地偏爱绿色是否是一种最大限度地提高生存率的策略(Furman等人，2015年)这些蝌蚪可能天生就是贝壳游戏的主人。

数据可用性声明

本文包含了本研究生成的所有数据集/补充材料.

道德声明

所有涉及动物的实验都经过怀俄明州大学动物护理和使用委员会的审查和批准。

作者贡献

JH、JB和KP设计、执行和分析了实验。JH和KP撰写了手稿，JB协助起草。

基金

这项工作由NIGMS/NIH机构发展奖拨款#2P20GM103432（JH）和NIGMS/NIH COBRE拨款#5P20GM121310-03（KP）资助。

利益冲突

作者声明，该研究是在没有任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或金融关系的情况下进行的。

致谢

我们感谢Jerod Merkle博士对shell游戏模型的深入讨论，感谢Liu Zhenyu博士和Pratt实验室成员对原稿的评论。

补充材料

本文的补充材料可以在以下网站上找到：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fnbeh.2020.00071/full#补充-材料.

图S1|绿色偏好从13-18 dpf稳定。每个标记代表一次60分钟试验的平均绿色偏好。

工具书类