低度全身炎症与2型糖尿病的发展:社区动脉粥样硬化风险研究

1987年至1989年，ARIC研究招募了来自美国四个社区的15792名年龄在45-64岁之间的男性和女性作为人群队列(12). 所有受试者都被邀请以～3年的间隔再次进行三次临床访问，在这三次访问中确定了糖尿病的发病率。相关机构的人类受试者研究审查委员会批准了该研究，所有参与者都给出了书面同意。

我们选择了一种病例组设计来研究我们的目标，以便能够有效地使用ARIC冷冻生物标本。采样前，我们排除了2018名糖尿病流行患者、95名少数民族成员、853名未再进行任何随访、26名随访时未进行有效的糖尿病检测、7名限制血浆使用、12名缺少基线人体测量，以及之前ARIC心血管疾病病例对照研究中2506名参与者，他们的血浆储备已耗尽或处于储备状态。这导致最终样本为10275名个体（占基线未患糖尿病全队列的75%），其中1155名（11.2%）在随访期间发展为糖尿病。从这10275名符合条件的队列成员中，我们选择并测量了糖尿病发病病例和整个队列符合条件成员（共1198人）的种族分层随机样本的分析物。少数糖尿病发病病例与队列样本重叠，少数仅通过队列样本选择。在样本中，我们排除了45名不完全禁食（<8小时）或没有所有协变量值的受试者，剩下1153名受试者进行分析，其中包括581名糖尿病患者和572名非糖尿病患者。

我们在基线检查和随访时用己糖激酶法测定血糖，并用非特异性放射免疫法测定空腹血清胰岛素。我们测量了脐带水平的腰围和最大臀围的臀围，将腰臀比（WHR）定义为两次测量之间的比值。我们将父母糖尿病史定义为父母中任何一方的糖尿病报告。其他基线测量的定义和方法（身高、体重、吸烟状态、收缩压、高血压、体力活动、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、胰岛素、白细胞计数、纤维蛋白原和平均颈动脉内膜中层厚度）先前已有报道(2).

为了表征急性期反应，我们选择分析三种急性期标志物，即C反应蛋白（CRP）、口腔粘膜和唾液酸，以及白细胞介素（Il）-6，即反应的主要循环介质。为了确保从与胰腺自身免疫相关的炎症过程中测量的炎症标记物的独立性，我们还测量了GAD抗体。这些测定是在中央实验室基线时冰冻的血浆样本上进行的。我们使用人重组I通过放射免疫分析测定GAD抗体¹²⁵GAD符合制造商协议（Kronus、Boise、ID）；通过高灵敏度酶联免疫吸附试验（ELISA；明尼阿波利斯R&D Systems，明尼苏达州）测定IL-6水平；唾液酸的酶法比色测定(13)（罗氏诊断公司，印第安纳波利斯）；使用免疫比浊技术的口腔粘膜（Kamiya Biomedical，西雅图，华盛顿州）；以及Hitachi 911自动分析仪上的高灵敏度CRP（Equal Diagnostics，Exton，PA）。每个分析物（唾液酸除外）在实验室中测量两次，重复测量的平均值作为该样品的值。通过分析在基线检查时在一个受试者子集上获得的重复样本对，获得了测量人与总方差之间的信度系数。信度系数为0.87，CRP为0.94，GAD为0.98，IL-6为0.62，唾液酸为0.50。可靠性系数最低的标记物唾液酸61份血浆样品的单独分析中重复测量的相关系数为0.84。

我们创建了一个分数来表示0到6之间的低度全身炎症，将四个新测得的炎症标记物（IL-6、CRP、口腔粘膜和唾液酸）中的每一个值均大于队列样本中位数的值归为一分以及基线队列测量中的两种炎症标记物（白细胞计数和纤维蛋白原）。

我们定义糖尿病的基础是1)医生诊断报告，2)使用抗糖尿病药物，三)空腹（≥8小时）血糖≥7.0 mmol/l，或4)非预测血糖≥11.1 mmol/l。对于根据血糖值确定的偶发糖尿病，使用确定访视时和前一次访视时的血糖值通过线性插值估计发病日期。被告知患有糖尿病或正在服用糖尿病药物的受试者在确定时的空腹血糖可能受到他们对糖尿病状态的了解的影响（在某些情况下，空腹血糖<7.0 mmol/l）。对于这些受试者，达到7.0 mmol/l的时间是通过他们在早期就诊时的空腹血糖来估计的，斜率是根据所有不知道自己病情的糖尿病受试者的信息来估计的。

统计分析基于我们的病例队列抽样设计。我们使用加权分析计算社会人口统计学变量和风险因素的平均值和比例，以及研究变量之间的Spearman相关性。在这些分析中，权重与种族特异性抽样分数相反。使用SUDAAN拟合比例风险模型，以考虑权重和分层抽样(14). 之所以使用这种方法，是因为我们通过仿真发现，Barlow方法的实现(15)在其他已发表的ARIC病例组研究中，用于解释加权分层抽样，当使用分层样本而不是所有病例时，可能存在偏差。在模型中，我们调整了研究中心、性别、年龄、种族和该样本中与糖尿病相关的其他因素的研究变量估计值：父母糖尿病史、高血压、基线空腹血糖、BMI、WHR和空腹胰岛素。我们使用这些模型中交互项的Wald测试来测试关联的异质性。使用SAS进行分析(16)和SUDAAN(17).

队列随机样本包括668名个体，糖尿病事件随机样本为558名。在重叠的情况下，总样本包括1153名个体，581名糖尿病患者和572名非糖尿病患者。随访的中位数（四分位范围）为3.0年（1.7–5.9），没有患糖尿病的患者为8.9年（8.8–9.0）。在发生的病例中，499例（86%）由空腹血糖≥7.0 mmol/l确定，5例（1%）由非空腹血糖≤11.1 mmol/l确定，77例（13%）由医生诊断或用药报告确定。在这些病例中，153例（26%）为白人男性，151例（26.%）为黑人女性，76例（13%）为黑人男性，201例（35%）为黑人美国女性。在非病例中，等效数字分别为123（22%）、203（35%）、76（13%）和170（30%）。

队列随机样本的中位数（四分位范围）值如下：IL-6 1.98 pg/ml（1.32–2.96），CRP 1.41 mg/dl（0.64–3.33），orosomucoid 84 mg/dl。表1显示发生或未发生糖尿病患者的协变量和其他炎症标记物的中位数和比例。吸烟者占21%的病例（21%的非洲裔美国人和20%的白人）和22%的非病例（28%的非裔美国人和21%的白人）。

炎症标记物之间的相关性很大，大多为中等范围（0.17–0.57），其中最大的是类口腔粘膜和CRP之间的相关性。这些标记物与代谢综合征相关元素的相关性如所示表2Orosomucoid和CRP与这些综合征要素的相关性最高。与炎症标记物最密切相关的综合征要素是腰围和BMI；相关性最弱的是舒张压和高密度脂蛋白胆固醇。炎症评分与综合征要素的相关性通常与口腔粘膜和CRP的相关性相似，但通常稍弱。

表3校正年龄、中心、性别、种族、父母糖尿病史和高血压后，四个新分析的炎症标记物与糖尿病发病呈正相关（模型1）。在对肥胖指数、血糖和胰岛素进行额外调整后（模型2），只有IL-6具有统计学意义，那些数值在最高四分位数的患者患糖尿病的风险比最低四分位数高65%（危险比[HR]1.65，95%CI 1.01–2.68）。在该模型中，第二和第三IL-6四分位数的HR分别为1.18（0.72-1.95）和1.02（0.62-1.71）。在完全调整后，唾液酸的第四个四分位与第一个四分位数相比的HR为1.54（0.96–2.48），CRP为1.23（0.74–2.03）。比较类口腔粘膜极端四分位数的HR接近一致。去除GAD抗体阳性的个体几乎不会产生变化，例如，在完全调整的模型中，IL-6极端四分位数的HR仅提高到1.67（95%CI 1.01–2.74）。

在队列随机样本中，经年龄、性别、种族、教育水平、吸烟状况和BMI调整后，炎症评分的总平均值（SE）为2.86（0.08）。在非病例中，11.0%的患者没有中位数以上的标记（得分=0），8.8%的患者所有标记都有中位数以上（得分=6）。相反，在病例中，只有2.6%的患者没有中位数以上的标记物，21.6%的患者所有标记物都有中位数以上。根据调整后的平均值（±SE），队列随机样本的子集中该得分差异很大：吸烟者的得分（3.85±0.16）高于非吸烟者（2.59±0.09）(P（P）<0.001），肥胖者（3.82±0.16），而超重者（2.93±0.12）和非超重者（2.29±0.13）(P（P）<0.001），在一定程度上，非洲裔美国人（3.06±0.11）与白人（2.81±0.09）相比(P（P）= 0.08). 性别差异较小（男性2.79±0.13，女性2.90±0.09，P（P）=0.48）和教育水平（高中毕业生以下2.79±0.18，高中完成3.04±0.12，大学完成2.68±0.12；P（P）=0.046，高中与大学毕业，但P（P）=0.62（高中以下vs大学毕业）。

图1显示整个汇总得分范围内发生糖尿病的HR。相关性仅存在于白人中（炎症评分-种族交互作用，P（P）=0.001（在经较少调整的模型中），P（P）=0.005（在最终模型中）。事实上，在非洲裔美国人中比较六种炎症标记物中五种的极端四分位数时，发现HRs<1.0（数据未显示）。在最终模型中，四个、五个和所有六个标志物的中值以上的白人（与没有中值以上的白人相比）患糖尿病的HR分别为3.3（1.0-10.6）、3.0（0.83-10.8）和3.9（1.1-13.4）(P（P）=0.008（线性趋势）。

图1也表明，在非吸烟者中存在相关性，但在吸烟者身上不存在相关性（炎症积分-吸烟相互作用，P（P）=0.02（最小调整模型），0.13（最终模型）。性别间无异质性（性别互动HR=0.93，P（P）= 0.50). 因此，仅在241例和256例非白人非吸烟者中使用炎症评分进行了额外分析。

图2允许评估基线炎症和发病糖尿病之间的关联在炎症评分水平上呈现剂量反应关系的程度。它显示了在调整了越来越多的其他糖尿病风险因素的模型中，白人非吸烟者得分的每一水平的HR。仅根据年龄和性别或父母糖尿病和高血压病史进行调整时，发现存在较大的分级关联(P（P）线性趋势<0.001）。BMI的额外调整大大降低了相关性，但仍保持了较大且基本分级的反应。进一步调整WHR、空腹血糖和空腹胰岛素几乎没有进一步降低。事实上，一旦BMI被纳入模型，只有空腹血糖的增加才能进一步显著降低相关性。在这个完全调整的模型中，与那些没有炎症标记物的患者相比，那些炎症标记物高于中位数的患者的优势比分别为1.2、1.0、3.9、3.1、2.3和3.7（对于炎症评分的一个单位变化，HR=1.22，95%CI 1.06–1.43，P（P）=0.008（线性趋势）。

研究还发现，不同BMI水平之间的相关性有所不同。在白人非吸烟者中，在调整了年龄和性别的模型中，BMI<25 kg/m的人群炎症评分每增加一个单位的HR为1.3（1.0-1.6）²体重指数在25-30 kg/m之间的人群为1.4（1.2-1.7）²BMI≥30 kg/m者为1.5（1.2–1.9）²（炎症评分-BMI相互作用P（P）> 0.3).

对平均内膜中层壁厚度（一种亚临床动脉粥样硬化的测量方法）进行额外调整并没有改变这种联系。中层以上亚临床动脉粥样硬化患者之间的相关性稍弱（相互作用HR=0.85，相互作用P（P）= 0.24).

当排除仅以7.0至7.8 mmol/l的空腹血糖定义的病例时，白人非吸烟者的炎症评分与糖尿病的相关性更强（评分变量的单位变化HR=1.27，95%CI 1.07–1.50，P（P）= 0.006).

本报告与之前炎症糖尿病协会的调查一致(2–11，18)表明IL-6、CRP、口腔粘膜和唾液酸的亚临床升高与中年糖尿病的发生有关。由这四个标记物加上白细胞计数和纤维蛋白原组成的炎症评分显示，炎症与糖尿病的关系在吸烟和种族类别中是不均匀的。在不吸烟的白人中，这种关联很大，而且普遍分级。调整肥胖指数后，相关性显著下降。然而，在完全调整的模型中，六个标志物中有四个或四个以上的值高于中位数的人患糖尿病的风险是没有标志物高于中位数者的两到四倍。调整亚临床动脉粥样硬化并没有改变这种联系，在那些或多或少有亚临床动脉粥样硬化的患者中也没有明显变化。这些发现似乎不能用胰腺自身免疫性疾病来解释，因为排除GAD抗体阳性病例并没有改变结果。

对这种关联进行更详细的研究显示出显著的异质性，这种关联存在于白人中，但不存在于非裔美国人中，也存在于非吸烟者中，但并不存在于吸烟者之中。尽管BMI<25 kg/m的患者存在这种关联²，在肥胖者中最强。这种关联的异质性可能在一定程度上解释了先前报告的研究中所发现的差异。报告与高CRP水平相关最大的两项研究是妇女健康研究(三)和苏格兰西部冠状动脉预防研究(8)，这两个群体都主要由白人组成（分别为91%和接近100%）。此外，前一项研究的吸烟率较低（～12%），尽管后一项研究基线时吸烟率较高（～43%），因为这是一项预防冠心病的临床试验，但在随访期间戒烟的比例可能很大。最后，胰岛素抵抗动脉粥样硬化研究（IRAS）(11)没有发现糖尿病与CRP相关，白人比例相对较低（40%），非裔美国人比例较大（27%）。

人们越来越认识到，低度全身炎症先于并预测糖尿病和动脉粥样硬化血栓疾病的发展。可以解释这种关联的新事实正在出现。轻度炎症状态与肥胖和胰岛素抵抗密切相关。脂肪细胞，尤其是肥胖者的脂肪细胞，分泌大量促炎细胞因子(19)，其中一些已被证明直接抑制胰岛素信号(20). 脂肪细胞因子可能通过主要的促炎调节因子发挥作用，如核因子-κB的调节因子(21)和c-Jun NH₂-末端激酶（JNK）/AP-1信号通路(22)调节许多炎症蛋白编码基因的表达并改变胰岛素信号。这些行为有两个基本后果：第一，增加并维持促炎素质，第二，降低胰岛素敏感性。一些脂肪细胞因子也可能导致血管收缩(19). 血管收缩似乎会降低胰岛素的作用(23). 事实上，视网膜上的小动脉收缩最近被证明可以预测糖尿病(24).

迄今为止，通过测量循环因子来捕获这些病理生理过程和其他可能参与慢性轻度炎症状态生成的过程，主要涉及非特异性炎症标记物，每次只研究一种分析物。我们选择用分数来描述这种炎症状态。我们的评分是一种细胞因子、几个急性期反应物（一些由脂肪细胞产生）和白细胞计数的混合，这是公认的特殊性。鉴于胰岛素作用和先天免疫系统之间的相互作用可能涉及多种途径(25)从概念上讲，使用几个标记的汇总度量是有意义的。随着新知识的出现，基于概念的总结性测量应该能够更好地捕捉这种炎症状态的性质和范围。

肥胖还降低脂肪细胞脂联素的表达，脂联素具有抗炎和胰岛素敏感性(26). 脂肪细胞因子在这一过程中的重要作用可能解释了我们发现的炎症评分与较高BMI的糖尿病相关性更强。

另一方面，胰岛素除了刺激葡萄糖摄取外，最近还显示出多种抗炎作用(27). 在这方面，胰岛素抵抗状态可能不仅是葡萄糖摄取受损，而且是抑制促炎信号传导能力受损。因此，炎症介质和胰岛素之间的多重信号传导相互作用似乎是我们所描述的关联的分子底物。

此外，脂肪组织在产生炎症反应中的重要性可以解释在对本文和几乎所有其他研究中发现的肥胖指数进行调整后，炎症标志物与糖尿病的相关性显著降低。完全调整后，在白人非吸烟者中，这种关联仍然很大，且具有统计学意义，这表明它确实反映了脂肪组织产生的炎症介质之间的直接因果关系，例如肿瘤坏死因子-α、脂联素(6)血管紧张素II和糖尿病。然而，我们研究的标记物仍然可能与糖尿病的发展没有因果关系，肥胖主要通过不涉及炎症介质的途径导致糖尿病，并且在完全调整后仍然存在的关联是由于肥胖和高血糖导致的残余混杂的结果。另一方面，应该注意的是，炎症标记物显示出比BMI和WHR更大的个体内变异(28). 因此，当调整肥胖指数时，炎症标记物与糖尿病相关性的建模可能无法充分反映肥胖相关炎症过程的重要性。最后，正如ARIC研究之前报道的那样，一些炎症标记物也可以预测体重增加(29). 肥胖，如果其本身部分由炎症过程引起，可能是这些过程导致糖尿病的途径之一，即使肥胖通过非炎症病理生理机制导致糖尿病。因此，在模型中添加肥胖指数会导致过度调整。

我们发现这种关联仅限于不吸烟者，这与之前的一份报告一致，该报告在日本工人中描述了吸烟人群中白细胞计数升高与糖尿病或空腹血糖受损的关联较小(10). 然而，在日本的研究中，这种相互作用没有经过统计检验。

吸烟会引起全身炎症，这与导致的慢性肺部炎症和香烟烟雾中的促炎分子有关(30，31). 与此一致，在我们的研究中，吸烟者的综合炎症评分明显较高。然而，吸烟似乎不同程度地激活促炎性宏观调控分子，一项研究显示JNK的激活减弱(30)最近有人认为它对体重增加和肥胖相关糖尿病很重要(22). 此外，尼古丁通过烟碱受体最近被证明具有抗炎作用(32–34). 如果脂肪细胞具有类似于最近发现存在于巨噬细胞上的烟碱受体，那么吸烟虽然会产生整体促炎状态，但可以选择性地抑制炎症对脂肪细胞代谢和脂肪细胞因子生成的影响，这一机制可能解释了所发现的异质性。

墨西哥女性CRP与糖尿病发病率呈正相关，但男性无此相关(5)事实上，可能是由于吸烟和肥胖的调节作用。在这份报告中，48%的男性吸烟，而女性只有20%。女性的平均BMI为28.6 kg/m²而男性的BMI只有26.8 kg/m².

我们观察到炎症标记物与非裔美国人的糖尿病无关，这与美国国家健康和营养检查调查（NHANES）I队列中的非裔美国人没有白细胞计数糖尿病关联的报道一致(9). 据我们所知，糖尿病与其他炎症标记物之间的关系以前在非裔美国人中还没有研究过。与白人相比，非裔美国人的炎症评分无显著性差异。他们的白细胞计数也低于白人(35，36)这表明全身炎症负荷的特征可能因种族而异。非裔美国人的代谢综合征成分也有显著不同，高血压和糖尿病较多，但血脂异常较少(37). 在IRAS中，他们的胰岛素敏感性略低于西班牙裔和非西班牙族白人。IRAS还发现，胰岛素敏感性和颈动脉内膜中层厚度之间的相关性因种族而异——白人中存在正相关性，而非裔美国人中存在负相关性(38). 同样，在非裔美国人中，胰岛素敏感性和血压之间的联系被证明较弱(39). 尽管缺乏炎症事件糖尿病协会，但非裔美国人的糖尿病患病率和发病率高于白人。所有这些差异的基础仍然无法解释，我们发现白人和非裔美国人之间糖尿病因果关系可能存在差异，需要进一步调查。

无论对炎症标记物糖尿病在不同人群亚群中的变异性有何解释，所描述的异质性都很大，这表明并非所有低度全身炎症状态的来源都会增加糖尿病的风险。

我们研究的潜在局限值得评论。虽然急性期蛋白在长期储存中似乎是稳定的，但这种储存可能导致一个或多个标记物的降解。此外，由于我们的分析是基于空腹样本，我们可能还没有完全了解餐后期间炎症的影响(27). 如果是这样，我们的发现可能低估了真实关联的强度。由于受试者没有返回进行随访或没有可供测量的样本，选择偏差可能会影响我们的结果。然而，我们几乎没有先验的理由相信，在那些失去随访或没有可用样本的患者中，炎症因素与糖尿病发病之间的联系应该更强或更弱。此外，应考虑反向因果关系，因为最近的研究表明，高血糖通过产生氧化应激，本身就是促炎性的(40). 虽然更大的炎症评分可能仅仅反映了更大的胰岛素抵抗，从而导致基线时更大的餐后血糖，从而更容易患糖尿病，但这种解释不能解释我们报告的炎症和糖尿病相关性的异质性。最后一个限制是，流行病学研究在评估相关变量（如肥胖、炎症、血糖和胰岛素抵抗）的独立影响方面通常受到限制，尤其是当它们出现不同的测量误差时。

总之，这些发现提供了进一步的证据，表明低度全身炎症先于并预测成人糖尿病的发展，至少在白人非吸烟者中是如此。与胰腺自身免疫无关的肥胖患者的相关性更强，表明所讨论的结果确实是2型糖尿病。这些发现支持了糖尿病是一种炎症和代谢疾病过程的假设。相关性的其他异质性表明，并非所有低度炎症来源都会同样增加糖尿病风险。

本研究得到了国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所拨款5R01-DK56918-03的支持；以及国家心脏、肺和血液研究所合同N01-HC-55015、N01-HC-5016、N01-HC-55018、N01-HC-55019、N01--HC-55020、N01-H-55021和N01-HC55022。B.B.D.和M.I.S.获得了CNPq（巴西国家研究委员会）卓越中心的支持。

作者感谢ARIC研究的工作人员和参与者的重要贡献。