细胞内压力的动态不稳定性驱动基于气泡的运动

在对不同细胞类型和不同环境进行广泛研究的基础上，提出了两种不同的细胞运动模式（间充质运动和变形虫运动）(Friedl和Wolf，2003年;Sahai，2007年). 这些模式在许多方面都不同：细胞形态、细胞-底物粘附的组织和动力学、肌动球蛋白收缩机制的定位和活性，以及施加在二维（2D）和三维（3D）底物上的力的分布(布雷，2001年;Mierke等人，2008年). 据报道，一些细胞可以在这些模式之间进行转换(Friedl和Wolf，2003年;Friedl，2004年)运动模式强烈影响迁移效率(卡拉格等人，2006年). 因此，细胞很可能通过选择不同的策略来优化其运动能力，这可能是其分子“机械”状态和环境的函数。这种优化可能与转移侵袭、淋巴结或靶组织中的白细胞迁移以及胚胎发育期间的细胞运动有关，在胚胎发育期间，细胞会相继遇到不同的3D环境(Hugues等人，2004年;Raz和Reichman-Fried，2006年). 例如，在免疫监测和炎症反应期间，白细胞在血液、粘液、上皮和淋巴循环系统等环境中移动(Hugues等人，2004年). 我们学习了溶组织内阿米巴(呃)细胞，阿米巴病（痢疾）的病原体(斯坦利，2003年). 这种病原体侵入并最终破坏宿主肠道并产生肝脓肿时，会穿过各种环境（肠组织层、门静脉和肝脏微循环）(斯坦利，2001). 鉴于此，本工作的目的是阐明呃细胞运动并详细阐述了变形虫行为模型，特别关注内部静水压力的作用。

在之前使用体内双光子成像的工作中，我们观察到呃感染过程中肝脏的迁移伴随着质膜球形突起的剧烈循环产生(Coudrier等人，2005年). 在体外，这些突起可以收缩或变得稳定，从而维持细胞对局部环境的探索数小时(Coudray等人，2005年). 在缺乏外部引导的细胞运动的情况下，突起方向之间没有相关性，可以观察到对基质的有效随机探索。然而，适当的趋化梯度确实可以定向并稳定特定方向的突起(Blazquez等人，2006年;Zaki等人，2006年). 众所周知，肌球蛋白II对呃体外运动(Arhets等人，1998年)和体内(Coudrier等人，2005年). 在目前的工作中，我们证明了呃细胞突起是水泡(Keller等人，2002年;Fackler和Grosse，2008年;Charras和Paluch，2008年). 通过研究其产生的机制，我们进一步表明，气泡在生理环境中直接驱动细胞运动。我们的观察表明呃细胞可以作为研究变形虫一般运动的有价值的原型。

感染者呃需要在几何、机械和生物化学特性不同的环境中进行有效的运动。在初始报告中(Coudray等人，2005年)，我们观察到感染过程的效率（在动物模型中通过实验测量）、体内细胞运动和细胞突起的活跃生成之间有很强的相关性。这里，我们显示这些突起是球形的，因此与参与间充质迁移的跛足足和丝状足非常不同。如3D肝实质所示，2D和3D中的凸出物生成同样活跃(补充材料电影1)和裸玻璃上(补充材料电影2). 这表明与细胞接触的微环境对突起活性的影响有限。为了进一步评估细胞-底物接触的作用，在两种不同密度的液体（Percoll溶液和培养基）之间的界面加载阿米巴。在这种流体环境中，细胞继续活跃地产生圆形突起(补充材料电影3). 类似地，当细胞仅仅通过培养基沉积时，仍然可以观察到活跃的突起，一旦与底物接触，突起就会持续存在(补充材料电影4). 这些结果清楚地表明，突起活动是阿米巴细胞固有的，不是由细胞-底物粘附诱导的。

因为呃细胞没有专门的细胞器在液体中运动（例如鞭毛或纤毛），它们只能通过与固体基质相互作用实现相对于环境的净运动。虽然在漂浮或沉积细胞中没有观察到净运动(补充材料电影3和4)后者一接触到基底就开始移动，这表明其具有传递动量的能力。

为了进一步研究细胞-基底接触及其在前伸活动中的作用，我们将传统相控成像与使用反射干涉对比显微镜（RICM）观察粘附模式相结合(图1;补充材料电影5和图S3）。引人注目的是呃细胞与其接触表面截然不同；这与成纤维细胞和大多数黏附细胞形成对比，黏附强烈决定了细胞的轮廓。尽管紧密接触的区域扩大了（由连续的暗RICM信号区显示），但突起的产生导致不连续的接触区远离紧密接触区(图1B). 这一观察结果表明，突起是作为可以在远程位置接触基板的高架结构产生的。这与液体环境中3D突起的观察结果一致(补充材料电影3)和之前的电子显微镜照片(Gonzalez-Robles和Martinez-Palomo，1983年)这表明突起在细胞表面周围被触发（在所有三个维度中的典型尺寸为20μm）。

最初的不连续接触要么形核，要么发展成较大的表面（最终与主区桥接(补充材料图S3)或在突出物缩回时消失。因此，突出动力学与粘附接触的动态扩展相耦合。相控显微镜下观察到的细胞边界总是延伸到黑暗的RICM区域之外，这表明存在“悬垂”类型的几何形状（如图所示图1D). 有趣的是，凸出区域的悬挑比收缩区域大得多。这种明显的不对称性可以解释为接触角的差异，这可能是由于质膜和相关皮层在收缩区被剥离。

为了进一步研究呃细胞，需要注意的是，细胞-玻璃粘附力（原则上可能导致广泛接触面积和相当平坦的形态）主要由皮层内的收缩诱导力和弹性力控制。如上所述，这些力可能会在2D和3D中驱动细胞变形。然而，粘附力足够强，可以产生有效接触和观察到的运动所需的动量传递。原则上，粘附相互作用在分子水平上没有特异性，尽管有特异性粘附受体的表面表达(Coudray等人，2005年). 事实上，在疏水性大于或小于裸玻璃的基底上观察到了类似的运动行为(补充材料图S1和S2). 这些观察结果表明，过度粘附可能会抑制呃其他地方报道的细胞突起(Friedl等人，2001年).

接下来，我们通过呃细胞在玻璃表面移动。前一节中的结果表明，粘附不会直接干扰导致突起产生的细胞内过程，这可以被视为独立于与底物接触的操作。相控视频显微镜观察显示，细胞边界在两个不同的时间尺度上发生变形：缓慢（10–30秒）整体变化(补充材料电影6)和快速（0.1–5秒）本地更改(补充材料电影7). 缓慢的整体变形呈现出恒定的相控模式，表明细胞皮层结构是固定的。相比之下，快速变形是与相位控制信号中的主要变化局部对应的突出物；这表明皮层结构发生了强烈的改变。有趣的是，肌球蛋白抑制产生了阻止快速变形和持续缓慢变形的条件(补充材料图S4C，E）；运动性大大降低，这表明快速突起是必不可少的，而缓慢的变形实际上并不影响运动性。使用15 Hz帧速率的时间推移视频分析(图2)表明突出物以极高的速度膨胀。事实上，在膨胀的最初几百毫秒内，通常可以观察到高达10-20μm/s的速度。

一个简单的缩放参数（见材料和方法）导致压差δ之间的简单方程P（P），流体速度v（v）、胞浆粘度η、网目尺寸ξ和厚度小时皮层：δP（P）≈η甚高频ξ^–2.量级估计（η=10⁻³帕秒，v（v）=10μm/秒，ξ=30–100 nm和小时=1μm）表明约1–10 Pa的压差足以解释观察到的速度。

在突起产生开始时，细胞膜移离最初的细胞边界，而与后者相关的对比物则不移动。前进的锋面可以很宽（宽度为5-10μm），并且显示出均匀的曲率，与其起源的边界相比，对比度要弱得多(补充材料电影7). 这一观察表明，质膜不再由皮层细胞骨架支撑。同时，与初始轮廓相关的对比度在几秒钟内保持不变，表明皮层本身也保持不变。此外，突起内部最初显示出一个均匀、无结构的背景信号，与其余胞浆的粒度形成强烈对比。然而，几秒钟后，最初的皮层开始逐渐消失，细胞器侵入突起(补充材料电影8).

这组观察结果表明，质膜在肌动蛋白皮层结构不变的时间尺度上（通常不到0.1秒）突然从下层皮层分离。这个观察结果与肌动蛋白聚合前沿通常要慢得多（大约0.1μm/s）的事实相一致(波拉德，1986年;Theriot等人，1992年)比这里测得的波前速度还要大。此外，观察到的速度与其他非聚合驱动的“爆炸”过程类似，例如木卫二十九顶体过程(Tilney和Inoue，1985年). 我们的观察强烈表明呃细胞突起是真正的泡状物，其球状、无膜下结构和内表面玻璃样外观都表明了这一点。通过膜分离产生的突起类似于通过细胞骨架-膜连接的蛋白水解裂解形成凋亡泡(Mills等人，1998年;Mills等人，1999年). 与坏死性水泡不同，呃气泡在本质上是高度动态的；细胞迅速膨胀后，胞浆侵入，细胞膜和新皮质逐渐结合。这些事件以循环的方式发生。

在分子水平上，肌动蛋白皮层（见于相位对比和F-肌动蛋白荧光的平行延时视频；图3)显示快速分离，初始结构的荧光没有变化。然而，4秒钟后，荧光减弱，气泡边缘变成荧光（表明F-actin的积累）。

沿初始皮层和气泡边缘的F-actin动力学时间进程(图4A)显示为一系列的波形图(图4B、C)和随着时间的推移而集成(图4D，E). 这些半定量数据表明，解聚和远端复聚的典型时间相似（大约5-10秒）。这与F-actin皮层不断翻转的概念是一致的，在质膜上解聚和聚合速率之间的平衡可能导致在没有破坏的情况下形成稳定的皮层(图4F)以及在分离的情况下同时崩塌/重新聚合。

上述观察结果概括于图5A.气泡通过在不同时间尺度上发生的三个示意性转变来驱动细胞的净运动。从初始状态（a）开始，质膜与细胞骨架分离（通常在0.1秒内）。从第二状态（b）开始，细胞骨架逐渐解聚并在泡膜（c）下重新聚合。在5-10秒内，“旧”皮层消失，新皮层完全成熟（d）。在这种情况下，收缩力会使细胞变形，最终导致新的分离。

大多数细胞运动的研究都集中在肌动蛋白聚合起主导作用的情况下。在这些情况下，膜具有辅助作用，主要包括模板化肌动蛋白聚合，同时保持与皮层的连接。在这里，考虑到这种分离，我们必须重新考虑细胞膜和细胞骨架对连接体施加的力(图5B)以及它们与收缩活动的关系。

质膜受到(图5B，蓝色箭头）至来自外部流体的静水压力(π_提取)和内部介质（π_整数). 它还受到单个链环施加的力，链环的表面密度产生有效压力（π_链接). 考虑到链环的机械平衡（即只要它们保持牢固），这个压力也等于皮质施加在链环上的收缩压力（π_c（c）). 后者由皮层收缩张力（γ_c（c）)和曲率。

膜分离后(图5B′)，必须考虑一组不同的力。连接器压力（π_链接)在膜上，其相对的细胞骨架对应物消失。这种变化对应于细胞膜上相同大小的有效向外压力，以及细胞骨架上的有效向内压力。我们还认为，通过皮层的向外流体动力通量导致粘性阻力（对应于皮层上的向外压力，π_水力). 膜断裂意味着大量非共价键（几平方微米）的局部断裂，在个体水平上以有限的开/关速率为特征。当受到压力时，关闭率随压力呈指数增加(贝尔，1978年)预计在临界压力π以上会出现“雪崩效应”*_链接这将直接取决于键的密度和结合能。

如下文所述，由于在突起产生和再吸收过程中未观察到水流入，因此忽略了膜上渗透压的变化。原则上，应考虑两个额外的力。首先，膜受到表面张力的作用，表面张力可以（与曲率一起）减缓或阻止泡扩张。我们的观察表明，气泡在凹面区域通常表现出较大的波前速度（数据未显示）。这方面已经在一份理论出版物中得到考虑(Brugues等人，2010年)但在本文给出的实验中不容易考虑。其次，细胞与基质的接触在膜上产生表面力，主要防止局部气泡的形成。这些力不会阻碍无接触区的气泡。

在上述力学分析的基础上，我们提出了一个循环模型(图5C)在这种情况下，皮层收缩使跨质膜的内部压差增大到超过临界分离压力（π*_链接)链接器分布可以承受的。当膜从细胞骨架上分离时，它突然被π向前推进*_链接皮层在-π的作用下相应地向内退缩*_链接.同时，过剩内压π_整数在当地放松。其次，π的局部压降_整数在整个细胞内传播并导致小幅度的细胞溶质运动。当气泡通过肌动蛋白聚合和收缩而稳定时，压力再次升高，直到下一个分离转变。因此，由此产生的周期基本上以细胞内压力不稳定为特征。根据我们的模型，气泡形成事件之间的时间由收缩应力累积速率以及连接体的抗拉强度和密度决定。如果这些生物控制参数保持不变，则产生的不稳定性将是周期性的。我们研究了该模型的两个关键预测：收缩性和压力的各自作用，以及周期性。

我们首先确定气泡形成对内外压差的外部扰动的敏感程度。使用微量吸管抽吸(补充材料电影9)，我们观察到暴露于低外部压力（~-500Pa）下的膜区表现出活跃的气泡，而细胞的另一端停止形成气泡。这强烈表明内外压差是触发膜分离的关键参数。与之前的几份报告一致(Arhets等人，1998年;Paluch等人，2005年;Charras等人，2005年)发现ML-7和Y27632对肌动球蛋白收缩的抑制可以阻止水泡的形成(补充材料图S4B，D）。为了阐明收缩和压力增加的各自作用（两者似乎都是起泡所必需的），我们设计了一个实验，在该实验中，内外压差被抵消，而收缩机制保持不变。

众所周知，电穿孔可以瞬时渗透细胞膜，因此可以与微量移液管结合使用，在亚细胞尺度上随意消除静水压差，并且具有良好的时间分辨率。呃细胞与微量移液管尖端紧密接触。电阻约为25–30 MΩ。在这种情况下，细胞产生气泡，这些气泡在电脉冲序列开始时立即消失（参见补充材料电影10). 只要脉冲保持不变，细胞就会收缩(图6和补充材料图S5). 脉冲一停止，几秒钟内又恢复了气泡。此外，当向培养基中添加两种肌动球蛋白抑制剂（ML-7和Y27632）中的任何一种时，电穿孔诱导的收缩都不存在（参见补充材料电影11). 综上所述，这些结果表明，当静水压差被抵消时，收缩机制不受电穿孔的影响，但不能单独诱发气泡。同时，一种正常的膜不渗透染料（碘化丙啶）渗入细胞表明形成了微孔。有趣的是，染料通过单一渗透点系统地流入（见补充材料电影12)位于微量吸管外部。事实上，正如碘化丙啶实验所揭示的那样，电穿孔效应（参见补充材料电影12)是在一个点上形成孔，内质物质立即从孔中渗出，几秒钟后，染料通过孔进入，然后在整个细胞内平衡(补充材料图12). 孔隙的作用是至少局部地消除收缩引起的压差。电穿孔诱导的局部压力松弛紧接着是对气泡抑制的整体效应，这一事实强烈表明，膜破裂和气泡产生于膜上的直接压力和连接物破裂，并且局部压降立即在整个细胞中传播。

假设收缩速率、连接体强度和密度恒定且均匀，我们的模型预测气泡将周期性产生。在玻璃上的细胞中，气泡一个接一个地出现。没有时间重叠(补充材料图S6)也不是一个定义明确的时期。事实上，这些气泡在持续时间和大小上是异质的(补充材料图S7)而且随时间的波动很大，无法区分有统计意义的周期。根据我们的模型，这种时间上的不规则性表明控制参数在时间上不是恒定的和/或在空间上不是均匀的。最简单的解释是连接体上的局部压力（π_c（c）)取决于局部膜曲率，即π_c（c）=2γ_c（c）/R（右）(图5B). 曲率在呃单元格(图2). 有趣的是，在微吸管抽吸实验中，当细胞被迫采用更规则的形状时，会出现明显的周期性(图7). 周期（8±2秒，n个=46气泡）与上述测量的聚合/解聚反应相匹配。这清楚地表明，气泡频率波动受几何效应控制，并且控制参数是恒定的。我们的微移液器实验在皮质不稳定的各种动力学模式的详细理论分析中得到了广泛的描述(Brugues等人，2010年).

凋亡细胞中观察到有气泡形成(Mills等人，1998年;Sebbagh等人，2005年;Leverrier和Ridley，2001年;Sebbagh等人，2001年)，迁移单元格(Blaser等人，2006年;吉田和索尔达蒂，2006年)，非迁移单元格(Keller和Eggli，1998年;Gutjahr等人，2005年;Charras等人，2005年;Paluch等人，2005年)并在细胞中完全粘附在平坦的基底上(Norman等人，2010年). 然而，之前报道的唯一一种运动完全由气泡驱动的情况是斑马鱼的原始生殖细胞（PGC）迁移(Blaser等人，2006年;Raz和Reichman-Fried，2006年). 当前工作的关键信息是呃细胞迁移（与PGC一样）完全由气泡驱动，至少在本文研究的情况下是这样。然而，与斑马鱼PGC（在体外是不动的）不同，呃细胞在体外和体内都表现出基于气泡的运动能力，因此似乎构成了一个独特的模型，可以在相对正常的生理环境下研究气泡的形成机制及其与运动能力的关系。我们利用这一独特的特征，利用RICM定性地阐明滤泡形成和收缩、细胞-基质接触动力学和净细胞运动之间的关系。

体内感染相关的当前数据和我们之前的观察呃细胞运动性(Coudray等人，2005年)总之，与众所周知的间充质迁移模式相比，基于blebbing的细胞运动是有效的。我们观察到气泡前沿速度极高：比间充质细胞的平均速度高出两个数量级(布雷，2001年). 然而，这些速度是瞬时的，并不直接反映平均运动速度。鉴于此呃细胞泡是各向同性产生的，并导致随机运动(补充材料电影13)，均方位移更好地反映了运动的效率(补充材料图S8)，通常在0.1–10μm的数量级²/第二。最显著的特征之一呃基于气泡的运动是非常高的气泡频率，这使得细胞每分钟可以多次改变方向。

在循环的初始状态(图5Aa)电池处于静态状态，不断增加的应力不会转化为显著变形。内压是均匀的，如果连接体分布和曲率是均匀的话，则分离概率应该是均匀的。然而，应该记住，膜细胞骨架界面上的连接子可能是动态的(Coscoy等人，2002年); 因此，密度波动可以触发破裂压力π的局部变化_链接在一些报告中，大脑皮层的崩溃被视为第一个事件。然而，这种情况仅见于非生理学情况(Keller和Eggli，1998年;Paluch等人，2005年).

在我们目前的模型中，我们决定忽略渗透力在膜破裂和肿胀中的可能作用。渗透力确实被认为是膜膨胀的原因(奥斯特和佩雷森，1987年)由于内外水流量。在目前的情况下，没有看到这样的向内流动。相反，整个细胞的肿胀伴随着一股微小但可检测到的水流，水流向气泡，然后充满气泡(补充材料图S9). 顺便说一句，这一观察结果有力地表明，膜分离时诱导的局部静水压降会立即传播到整个细胞。这种传播均匀地释放了链路上的压力，并抑制了其他地方新气泡的形成。这个假设与我们的观察结果一致(补充材料图S6)（一般来说）新的气泡只有在前一个气泡“成熟”回到起点后才会出现。斑马鱼PGC中也存在这种相互滤泡排斥现象(Blaser等人，2006年)]可能是观测到的扩散系数相对较高的原因。

我们的数据强烈表明，收缩性对内部静水压力起着总体控制作用，并且该压力保持一致。因此，仅收缩活动的局部增加不太可能产生持续的局部压力增加，从而触发局部气泡的形成。这与抑制气泡形成的实验解释相矛盾(Charras等人，2005年)通过局部收缩抑制。这些观察结果促使Charras及其同事假设，细胞骨架可以表现出多孔弹性行为，其中细胞骨架的水力阻力和弹性导致局部压力变化的传播时间相对较长（穿过细胞10秒）。显然情况并非如此呃细胞，因为内外压差的局部弛豫立即抵消了整个细胞的起泡，这表明局部静水压跳跃几乎在瞬间得到了缓解。此外，我们观察到皮层在气泡时明显向内移动(补充材料图S10). 这种反冲可以通过分离过程中发生的两个对抗压力的相互作用来解释：压力π的损失_链接施加在细胞骨架上，向外的压力π_水力由于向外流动引起的流体动力阻力。因此，皮层的反冲表明连接体压力超过了粘性阻力，因此可以忽略细胞骨架-膜连接处的孔弹性效应。此外，观察到气泡出现后会立即在整个细胞内出现微小但可检测到的颗粒流(补充材料图S9)也是一个强烈的迹象，表明气泡引起的局部静水压降几乎在瞬间传播到整个细胞。

我们的发现是，肌球蛋白活性通过整体内部静水压以非局部方式驱动水泡的形成，这也应考虑到一份报告显示斑马鱼PGC中的水泡与钙离子载体蛋白的热点共定位，从而与局部钙增加和伴随的收缩相一致(Blaser等人，2006年). 在这些实验中，收缩是产生气泡的必要条件，但并不一定决定气泡的位置。这些气泡可能是由钙脉冲或收缩诱导的皮层异质性触发的连接体密度局部降低所致。这些先前的观察结果与我们关于均匀静水压力的假设相一致，但需要更详细的实验来区分控制气泡位置的可能机制。

我们的模型基于三个关键参数：（1）压力（由于肌动球蛋白收缩和弯曲）建立的速度，（2）临界分离压力（由膜-细胞骨架连接物抵抗）和（3）肌动蛋白皮质的周转率。压力增加的速度取决于机械酶活性水平和皮层密度。因此，在结构稳定的皮层存在的情况下，达到分离压力所需的时间预计与收缩率的倒数成反比。然而，肌动蛋白皮层远不是一个静态结构(Pantaloni等人，2001年;波拉德和鲍里西，2003年)而且，其营业额肯定会干扰压力的积聚。事实上，每一次微丝在周转过程中丢失，累积的压力就会消失，并从网络压力中减去。因此，人们期望拉伸应力达到由收缩率和肌动蛋白周转率调节的稳态水平。如果分离速度快于应力饱和速度，则无法达到该稳态。在这种情况下，收缩速率和聚合速率（以及临界分离压力）之间的动力学竞争应导致不同的动力学模式，无论有无分离(补充材料图S11). 虽然已经对这些动态模式进行了定量的理论研究(Brugues等人，2010年)，这里开发的定性模型应该有助于我们理解气泡是如何通过生物化学控制的。

我们的RICM实验表明呃细胞甚至粘附在一个裸露的玻璃片上，这可能是由于寄生虫分子粘附机制的相对非特异性。如果气泡要在粘弹性环境中产生运动，则连续传递到基底的净动量之和（首先是气泡发射期间，然后是成熟/收缩步骤期间）必须为非零。在气泡发射过程中，施加在气泡上的反作用力要么来自液相中的粘性阻力，要么来自膜与基质之间的摩擦。这两种力都可以通过细胞的其余部分粘附到基底上而有效抵消，这一点可以从质心在这一阶段确实向前移动这一事实中看出。随着气泡的成熟，皮层聚合以及与粘附受体的连接形成了相当均匀的固体摩擦。因此，在进一步收缩时，预计质心不会移动。定性地说，气泡的液相结构打破了摩擦力在空间和时间上的对称性，从而为净运动提供动力。

除了化学信号外，外部机械因素还可以通过限制气泡在不受接触压力限制的方向（例如细胞外微环境中的孔洞）的释放，来指导基于气泡的运动。原则上，任何干扰收缩引起的应变的因素（例如粘附到刚性基质上）都可能限制内压的积聚，从而抑制基于气泡的运动。

我们在此提出，气泡驱动运动的使用取决于收缩活动和微环境弹性顺应性之间的平衡（前提是细胞粘附力足以耦合这些力）。除了细胞内对运动的控制(Lammermann和Sixt，2009年)我们认为，通过周围环境的变化（即粘附性、几何形状和弹性顺应性），可以促使细胞在滤泡驱动和间充质运动模式之间切换。这是一个很有吸引力的概念，可以帮助我们了解细胞如何在各种“软”和“硬”微环境中优化迁移策略，并增强我们对胚胎发生、寄生虫感染、肿瘤发生和免疫细胞迁移过程中细胞行为的知识(Hugues等人，2004年;Coudray等人，2005年;Raz和Reichman-Fried，2006年;Beadle等人，2008年).

溶组织内阿米巴HM1-IMSS系统(钻石，1961年)实验前，野生型菌株在TY-SS3培养基中生长并重新悬浮。对于非粘附条件下的实验，将细胞悬浮在低密度培养基（培养基）和高密度培养基之间的界面（Percoll，Sigma），用氯化钙校正，以获得细胞培养物的通常渗透压（300 mOsm）。电穿孔实验期间用于检查膜完整性的碘化丙锭（Sigma）稀释至2μg/ml。肌球蛋白活性在50μM时被ml-7（Sigma-）抑制，在40μM时则被Y-27632（Sigma/）抑制。肌动蛋白在200 nM下被茉莉花苷（Interchim）稳定（解聚抑制）。为了保持厌氧条件，使用前在药物溶液中注入氮气至少30分钟。由于不同的细胞会表现出截然不同的行为，因此以比较的方式进行药物实验，即在用药前后使用相同的细胞。因此，尽管观察室内注射药物会导致液体流动，但单个细胞必须保持在观察区内。为此，通过玻璃珠（Polysciences）将薄金属网格（100μm网格大小，Saulas）保持在观察室地板上方400μm，从而保护细胞免受流动。

用于将膨胀速度与驱动膨胀速度的压力联系起来的标度参数如下：压力梯度（通过皮层）和粘性应力之间的斯托克斯方程为δP（P）=ηξv（v），其中δP（P）是压差，v（v）流体速度，η胞浆粘度，ξ筛孔尺寸。压力梯度通过δ与通过皮层的压差耦合P/h（P/h）=δP（P），其中小时是皮层的厚度。皮层内的速度梯度由皮层网格大小η决定v（v）=v（v）ξ⁻²因此，压差和速度之间的关系为δP（P）=η甚高频ξ⁻².η=10时⁻³帕秒，v（v）=10μm/s，ξ=30–100 nm，以及小时=1μm，驱动气泡的压力值为1–10 Pa。

使用LifeAct肽（MGVADLIKFESISKEE）通过荧光视频显微镜观察肌动蛋白细胞骨架(Riedl等人，2008年)通过七肽（GDPPVAT）与GFP融合。这是通过PCR扩增实现的，使用两个寡核苷酸构建，通过互补区域（带下划线的核苷酸）5′-AT相互杂交GGTACC公司ATGGGAGTTGCTGATCTTATAAAATT公司CGAATCAATTTCAAAAGAAGAAG公司-3′和5′-ATGGTACC公司-AGTAGCAACTGGTGGATCTC公司CTTCTTCTTTTGAATTGATTCG公司-3′. 当杂交和扩增后，双链片段包含肌动蛋白结合肽和连接区，两侧有两个千磅/平方英寸用于直接克隆到pNeo-GFP载体的I位点（粗体核苷酸）。

大多数观察都是使用倒置的IX-70奥林巴斯显微镜，使用“开放”配置的LaCon POCmini观察室进行的。用培养基完全填充该室并将其关闭，以在数小时内保持厌氧条件。使用火线AVT Guppy F-080B CCD摄像机和BTV Pro采集软件，以15 Hz帧速率拍摄相控观察电影。凸出物在3D中扩展，但我们选择使用2D宽场成像来维持高采集率。因为我们使用了低倍成像，所以景深足够大，可以捕捉到所有突出物。使用带有Micro-Manager软件的CoolSNAP HQ2（Roper Scientific）CCD相机进行荧光成像。使用自制的LabView程序，通过顺序照明（亮场LED与HBO汞灯交替）准同步获得荧光和相位对比度（或RICM/相位对比度）。

将样品室组装成两个干净的玻璃盖玻片，用真空油脂粘合，并用指甲油固定在1mm厚的铝支架上。充满细胞和培养基后，用矿物油密封腔室，以防止水分蒸发并限制氧气进入。该室放置在倒置显微镜（Axiovert 200，蔡司）台上，配备60×Olympus UPlanFl浸没式油物镜（1.25 NA）和0.8 NA空气冷凝器。温度由目标周围的自制水循环调节，流体温度由恒温循环器调节。将自制微操作器夹在显微镜上，将尖端直径约为10μm的微吸管连接到移动水箱。相控图像由模拟CCD相机（XC-ST70CE，索尼）采集。使用800A Axoporator进行基于微量移液管的电穿孔。使用交变极性脉冲串以避免永久电流偏置和水解。电穿孔条件由脉冲振幅定义(V（V）₀)、脉冲持续时间（τ）、脉冲重复频率(（f）)和列车持续时间(T型). 这些参数的典型值为：V（V）₀±6 V，τ1 ms，（f）100 Hz，以及T型10秒。微量吸管的典型电阻为20 MΩ。

一些Matlab例程是专门为图像分析开发的。由于细胞边界的对比度结构随时间而变化，特别是对于相位对比度成像，使用恒定参数（阈值、梯度等）不够准确。相反，我们开发了一种嵌入到直接处理电影的程序中的自相关算法。的荧光图像图4无法使用自相关方法进行处理，边缘是逐帧手动确定的。Kymograph的构造如下：对于每个时间点，我们表示通过在轮廓上平均获得的荧光强度的平均径向分布。

作者想感谢Elisabeth Labruyere和Christophe Zimmer（巴黎巴斯德研究所）就呃和图像分析，Christian Weber负责准备LifeAct构建，Sylvie Syan负责寄生虫培养，Isabel Llano和Jeremie Barral在电穿孔实验中提供帮助，Vincent Semetey与Pia Streicher一起帮助进行表面处理，Gil Toombes负责批判性阅读手稿。B.M.和F.A.是CNRS的GdR CellTiss的成员。B.M.得到了来自法国地区的博士研究金的支持。这项工作得到了ANR（N.G.和F.A.，P.N.和P.S.）、居里研究所和法国地区的资助。