LEM2是一种与a型层粘连蛋白相关的新型MAN1内核膜蛋白

核膜（NE）将细胞核和细胞质隔开。它由内层（INM）和外层（ONM）核膜组成，核膜由管腔空间隔开，并在核孔复合体处周期性连接，以及靠近INM的丝状网，称为核膜(Foisner，2003年;Gruenbaum等人，2005年). 核膜存在于多细胞动物中。它由包括B型层粘连蛋白在内的V型中间丝形成，B型层粘连蛋白在所有细胞中表达，对生存能力至关重要(Vergnes等人，2004年)和A型层粘连蛋白，其表达仅限于分化细胞(Goldman等人，2002年). INM的几个完整蛋白质结合并紧密整合在椎板支架中(伯克和斯图尔特，2002年;Foisner，2001年;Gruenbaum等人，2005年). 特别是，层粘连蛋白B受体（LBR）和LAP2β与B型层粘连蛋白质特异性结合(Foisner和Gerace，1993年;Furukawa等人，1998年;Worman等人，1988年;Ye和Worman，1994年)而LAP1、emerin和nesprins已被证明主要与A型层粘连蛋白相关（由Zastrow等人，2004年).

一组层粘连蛋白在其N端共享40个氨基酸（aa）的共同结构基序，称为层粘连多肽–emerin–MAN1（LEM）结构域(蔡等人，2001;Laguri等人，2001年;Lin等人，2000年)介导与高度保守的DNA交联蛋白、屏障-自整合因子（BAF）的相互作用(蔡等人，2001;Furukawa，1999年;Lee等人，2001年;Mansharamani和Wilson，2005年;Segura Totten和Wilson，2004年;Shumaker等人，2001年). LEM域蛋白家族的创始成员包括几个选择性剪接的LAP2亚型(Berger等人，1996年;Dechat等人，2000b;Furukawa等人，1995年;Harris等人，1994年)、emerin和MAN1(Lin等人，2000年). LAP2亚型在末端N末端包含一个额外的LEM样基序，该基序与DNA相互作用(蔡等人，2001). LEM域蛋白家族的其他成员包括果蝇属-特异性蛋白质欧特芬(Ashery-Padan等人，1997年)和Bocksbeutel(Wagner等人，2004年)和未标记的秀丽隐杆线虫LEM3级(Lee等人，2000年). 一个综合数据库筛选鉴定出一个Ce-LEM3哺乳动物同源序列和三个高等真核生物中新的LEM结构域蛋白，它们被命名为LEM2、LEM4和LEM5，基于并扩展了秀丽线虫命名法(Lee和Wilson，2004年;Mansharamani和Wilson，2005年).

根据它们与BAF和DNA的相互作用，LEM域蛋白与染色质组织有关(Dechat等人，2004年;Haraguchi等人，2001年;刘等人，2003;Segura-Totten等人，2002年;Segura-Totten和Wilson，2004年;Shimi等人，2004年). Emerin和LEM2可能具有重叠和冗余功能，因为RNA干扰介导了两种蛋白质在秀丽线虫在100细胞期是胚胎致死性的，而单个基因敲除则没有或没有严重的表型(刘等人，2003). 此外，在体外发现emerin和MAN1相互结合(Mansharamani和Wilson，2005年). 最近发现的许多新的LEM域蛋白结合伙伴表明这些蛋白在不同的细胞过程中具有许多重要的功能(本特森和威尔逊，2004年;Gruenbaum等人，2005年). LAP2β和emerin结合转录抑制因子的细菌细胞较少(Holaska等人，2003年;Nili等人，2001年)和LAP2α与抑癌视网膜母细胞瘤蛋白相互作用(Markiewicz等人，2002年)，在转录调控中具有暗示功能。根据emerin可以作为核肌动蛋白的帽蛋白的观察，可以设想LEM域蛋白的其他潜在功能(Holaska等人，2004年). 有趣的是，XMAN1爪蟾人类MAN1的同源基因已被证明通过与下游调控Smads 1、5和8结合，起到了骨形态发生蛋白（BMP）信号通路的拮抗剂的作用(Osada等人，2003年). 类似地，人类MAN1可以通过结合Smads 1、2和3，而不是Smad4，通过转化生长因子β（TGF-β）和激活素来增强BMP信号和信号(Hellemans等人，2004年;Lin等人，2005年;Pan等人，2005年).

编码A型层粘连蛋白及其结合伙伴的基因突变会引起一组不同的疾病，称为“层粘连病”(伯克和斯图尔特，2002年; Gotzmann，2004年；Gruenbaum等人，2005年;Hutchison and Worman，2004年;Mounkes和Stewart，2004年). 疾病表型多样，影响骨骼肌、心脏、脂肪、骨骼、皮肤和神经组织，还包括过早老化；椎板病的潜在分子机制尚不清楚。除了在LMNA公司基因，编码LEM域蛋白的基因突变(Bione等人，1994年;埃默里，1987年;埃默里和德雷福斯，1966年;Manilal等人，1996年)和MAN1(Hellemans等人，2004年)分别引起肌肉营养不良和骨骼相关疾病。由于LMNA公司或缺乏层粘连蛋白A导致emerin在内质网（ER）的定位错误(霍尔特等人，2003年;Muchir等人，2004年;Ostlund等人，2001年;Raharjo等人，2001年;Sullivan等人，1999年;沃恩等人，2001年)，层粘连蛋白A/C或相关蛋白突变引起的层粘连蛋白A复合物的破坏可能是这些疾病的分子原因。因此，为了更深入地了解层粘连蛋白A/C复合物的功能及其与疾病的关系，鉴定和表征这些复合物的新蛋白非常重要。

在这里，我们描述并表征了一种新的人类MAN1相关LEM域蛋白LEM2。重要的是，我们证明LEM2与层粘连蛋白C结合，并且需要与A型层粘连膜结合才能正确定位NE。此外，高度过表达的LEM2在NE处形成簇和膜内陷，以及连接相邻细胞细胞核的管状结构，并将层粘连A/C和相关蛋白引入BAF。这表明LEM2对层粘连C/C复合物的组织起作用。

细胞系HeLa、COS、MDCK和C2C12，以及来自野生型或Lmna公司^–/–小鼠[美国NCI Frederick C.Stewart提供(Sullivan等人，1999年)]在37°C、含5%CO的湿空气中，在补充有10%胎牛血清（Invitrogen）、青霉素/链霉素和2 mM L-谷氨酰胺的DMEM中常规培养₂根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）进行瞬时转染。通过筛选对抗生素速溶素（30μg/ml；Invitrogen）的耐药性，克隆出稳定表达hLEM2的HeLa-（HeLa-LEM2）、COS7-（COS-LEM2）和C2C12-（C2C12-LEM2”细胞。

分别从Invitrogen和Sigma购买小鼠和兔抗V5抗体。从Upstate Biotechnologies获得兔抗磷烯-H3抗体；小鼠抗α-微管蛋白抗体和抗肌动蛋白多克隆血清来自Sigma；小鼠单克隆抗层粘连蛋白A（克隆号133A2）来自Abcam；小鼠抗NUP62来自BD Pharmingen。LAP2α的兔抗血清已在前面描述过(Vlcek等人，2002年). BAF抗血清是K.Furukawa（日本新泻大学）慷慨捐赠的(Furukawa，1999年)]. ER-markerα-calnexin的抗血清由E.Ivessa（奥地利维也纳医科大学）提供(de Virgilio等人，1998年)]. 豚鼠抗LBR抗体由H.Hermann[DKFZ，Heidelberg，Germany提供(Dreger等人，2002年)]. 小鼠抗层粘连蛋白B1单克隆抗体8D1由D.Vaux提供(Maske和Vaux，2004年)]。

从Genecopoeia（Germantown，USA）获得一个含有全长人类LEM2的cDNA克隆（#T5554），并用以下引物作为模板扩增全长人类LEM2或N末端（LEM2-NT）的cDNA：全长，5′-CACATGGCCGCTTGTCGGACCTGACTGGCGGC-3′和5′-GCATCGCTGAGTCAGAAGAGAGAGG-3′；LEM2-NT，5′-CACCATGGCCGCGCTGTCGGACTGCGGC-3′和5′-AAGCTTCGCGCCGCGCCAGGGCGCCGCTCGAGT-3′。cDNA克隆到pENTR/D-TOPO（Invitrogen）中。为了真核表达，使用LR重组反应（Invitrogen）将hLEM2和LEM2-NT穿梭到pTRACER-B中，制成Gateway^®-通过将“转换盒”（Invitrogen）插入生态RV现场。通过PCR（5′-CACCATGGCGGCGCGGCAGCAGCATTC-3′；5′-GCAGGAACTTCTTGAGAAT-3′）扩增全长人MAN1，并如上所述克隆到pTRACER-B中。表达hLEM2缺失突变体的载体是通过限制性消化和pTRACER与全长hLEM2.重新连接构建的。对于LEM2ΔCT（Δaa 378-486），我们使用Msl公司一、 对于LEM2ΔNT（Δaa 130-203）Sfo公司一、 对于LEM2-LEM（Δaa 74-503）Bss公司HII，对于LEM2ΔLEM+NT（Δaa 28-203）Sma公司我和Sfo公司所有表达结构均标记有C末端V5表位。对于LEM2-GFP构造Spe公司我-Xba公司表达全长LEM2的pTRACER载体的I片段亚克隆到Nhe公司我是peGFP-C1（Clontech）的站点。一种表达GFP标记前层粘连蛋白A的构建物(Sullivan等人，1999年)是C·斯图尔特慷慨的礼物；质粒GFP-xLaminB1Δ2+由C.Hutchison[英国达勒姆大学(Izumi等人，2000年)]。

亚细胞分级基本上按照描述进行(Dechat等人，1998年;Gotzmann等人，2000年). 简言之，细胞在低渗缓冲液中用带紧杵的搅拌均质器破碎。添加8%蔗糖后，2000年通过离心分离可溶性细胞质和不溶性核组分克在4°C下保持15分钟。在添加1%Triton X-100或200 mM NaCl或两者的组合或7 M尿素的同一缓冲液中提取含核颗粒部分，然后在15000下离心克持续10分钟；用western印迹法对上清液和颗粒组分进行分析。SDS-PAGE和免疫印迹基本上如前所述进行(Gotzmann等人，2002年;Gotzmann等人，2000年).

总RNA通过标准技术从整个小鼠胚胎（dpc 12、14、16、18）中纯化，或作为人类和小鼠组织的总RNA集合购买（Clontech）。聚乙烯（A）⁺使用mRNA分离试剂盒从总RNA中提取mRNA，并使用第一链cDNA合成试剂盒（均来自Roche）进行反向转录。结果产物的等分样品被用作模板，使用Ready-To-Go PCR珠进行特定PCR扩增（Amersham Pharmacia Biotech）。对每对引物的PCR反应条件进行了优化。根据肌动蛋白表达水平对所有cDNA进行归一化。使用iCycler实时PCR检测系统（Bio-Rad）和DNA结合染料SYBR Green I对发育阶段LEM2的表达进行实时PCR分析。使用以下两对正向和反向引物（均在5′-3′方向）进行扩增：人和小鼠肌动蛋白，ATCTGGCACACCATTAC和CAGCAGTCCAGACGCAGG；人类LEM2、GCCGGCCTGTCGGACCTGGAACT和GGCGCAGCTTGCGGTAGAG；小鼠LEM2、AAGCGAGTATGGGACCGTGCTGTG和AGGTGACCCGGCTGAAGAGTTG。

使用TOPO技术（Invitrogen）将全长hLEM2和hLEM2的N-末端片段（LEM2-NT；aa 46-195）亚克隆到pET102载体骨架中。其他地方描述了层粘连蛋白C片段（头部，aa 1-171；杆，aa 171-319；尾部，aa 319-572）和全长LAP2α的表达质粒(Dechat等人，2000a). 在有[³⁵S] -蛋氨酸使用TNT^®根据制造商的说明进行快速耦合转录/翻译（Promega）。重组层粘连蛋白C片段和LAP2α通过SDS-PAGE分离并转移到硝酸纤维素上。蛋白质用PonceauS染色，并在覆盖缓冲液（10 mM Hepes，pH 7.4，50 mM NaCl，5 mM MgCl）中培养印迹₂，2 mM EGTA，0.1%Triton X-100，1 mM DTT）3小时，用5%脱脂牛奶在覆盖缓冲液中封闭，并用含有³⁵用1%脱脂牛奶和1 mM苯甲基磺酰基氟化物（PMSF）以1:50的比例在覆盖缓冲液中稀释的S标记蛋白质在4°C下过夜。在磷酸盐缓冲液/Tween（PBST）中进行大量洗涤后，通过放射自显影术检测结合蛋白。

细胞生长在聚-L-赖氨酸涂层玻璃盖玻片上，在-20°C的甲醇中固定3分钟，或在4%多聚甲醛中固定10分钟，并用0.5%Triton X-100在PBS中渗透5分钟。用40μg/ml洋地黄素（Calbiochem）在PBS中在冰上提取固定细胞的洋地黄碱3分钟。细胞在PBS中的0.5%明胶中封闭15分钟，与一级抗体孵育45分钟，用与得克萨斯红（Jackson ImmunoResearch）或Alexa Fluor 488（Molecular Probes）结合的适当二级抗体清洗并探测45分钟。DNA用Hoechst染色5分钟，样品安装在Mowiol（Fluka）。用共聚焦激光扫描显微镜（LSM510和Axiovert 100；蔡司）拍摄样品的共聚焦图像。使用软件LSM-Image-Browser（Zeiss）和Adobe Photoshop分析并调整数字图像的亮度和对比度。

将生长在玻璃盖玻片上的细胞固定在3%戊二醛中0.15 M Sorensen缓冲液（pH 7.4）中1小时，并在1%OsO中培养₄在Sorensen’s中放置1小时，并随着乙醇浓度的增加而脱水。随后将样品“扁平”嵌入环氧树脂（琼脂100）中。使用LEICA Ultracut S超薄切片机切割60-80 nm的薄片，该切片机安装在铜栅上，与醋酸铀酰和柠檬酸铅进行对比，并在60 kV的JEOL JEM-1210电子显微镜中进行检查。图像是使用Mega View III数码相机和分析软件（捷克共和国普拉哈市SIS）采集的。

NCBI-BLAST进行了cDNA序列比对、基因组连续序列比对和数据库搜索(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast网站/)和ClustalW(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)(汤普森等人，1994年). 使用ENSEMBL基因组浏览器进行基因组分析(http://www.ensembl.org（英语）/; 桑格研究所）。使用GENSCAN基因预测软件计算hLEM2小鼠同源序列[http://genes.mit.edu/GENSCAN.html(Burge和Karlin，1997年)]. 使用SMART进行蛋白质基序和模式搜索[http://smart.embl-heidelberg.de/(Letunic等人，2004年;Schultz等人，1998年)]，客户尽职调查(网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/; NCBI）和PSORT II(http://psort.nibb.ac.jp/form2.html). 使用膜蛋白拓扑数据库计算跨膜结构域[http://blanco.biomol.uci.edu/mptopo网站/(Jayasinghe等人，2001年)]TMHMM 2.0预测软件[http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM网站/(Krogh等人，2001年)]、SOSUI系统(http://sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/)和DAS-TM滤波算法(Cserzo等人，2004年). 使用eSHADOW进行系统发生树预测[http://eshadow.dcode.org/(Ovcharenko等人，2004年)]并使用Phylodendron软件进行可视化(http://iubio.bio.indiana.edu/treeapp/).

对新型哺乳动物LEM域蛋白的数据库搜索显示，人类（Acc.No.：NP_851853）和小鼠（Acc.No.：AAT71319）LEM2分别显示83%和87%的aa序列整体一致性和相似性(图1A). LEM2中的LEM结构域位于分子的N末端（aa 1-42；图1A，红框），并显示97%的人和小鼠序列一致性。人类LEM2（hLEM2）中的LEM结构域与最初在hMAN1、hLAP2和hEmerin中描述的LEM域关系更密切(Lin等人，2000年)而不是LAP2中的LEM-like基序(图1C). 然而，这些蛋白质中LEM和LEM样结构域内的五个残基被严格保守(图1C，红色），其中两个（P和Y）已被证明对LAP2中与BAF的相互作用至关重要(Shumaker等人，2001年). hLEM2多肽包含503 aa（预测分子量56 kDa），并且是高度碱性的（pI=9.2），主要是由于高度碱性的N末端（aa 1-209，pI=11.3）。hLEM2在aa 209-231和aa 372-394之间包含两个预测的跨膜结构域(图1A，蓝色）和MAN1-Src1p C终端（MSC）域(Mans等人，2004年)aa 435-493之间（绿色）。编码hLEM2的基因被注释到染色体6p21.31上，包括9个外显子和8个内含子，跨越约18kb（数据未显示）。这个柠檬2小鼠的基因被分配到染色体17A3.3的合成区。

我们在秀丽线虫(图1A)、老鼠、鸡和狗（数据未显示）。hLEM2的整体域组织与hMAN1和其他MAN1同源物（例如。爪蟾XMAN1），但LEM2缺乏MAN1型蛋白质C末端发现的RNA再认识基序(图1，RRM域，黄色）。除了LEM结构域外，hLEM2和hMAN1在其N末端（第一个预测跨膜结构域的上游）和跨膜结构区之间的区域（分别为11%和27%的同源性）中的保守性较差，而在这些蛋白质的C末端MSC结构域中检测到高度同源性（87%）(图1A). 因此，我们认为MAN1和LEM2在以MSC结构域存在为特征的LEM结构域蛋白中包含一个亚家族。有趣的是，Ce-LEM2，最初称为Ce-MAN1(Lee等人，2000年)，在N末端和跨膜结构域之间的区域与hLEM2比与hMAN1更同源，并且也缺乏MAN1的C末端RNA识别基序。因此，我们同意Ce-LEM2编码的蛋白质与人类LEM2同源(Mansharamani和Wilson，2005年)，而不是最初认为的MAN1(Lee等人，2000年). 相比之下果蝇（dmCG3167，图1A)似乎是MAN1而不是LEM2直系血统。

系统发育分析使我们推测LEM2和MAN1在进化中有共同的祖先(图1B). 有趣的是，在酵母Src1p相关蛋白中还检测到与预测祖先相关的结构域组织。Src1p包含一个N末端SAP结构域，根据结构标准，该结构域可能与LEM结构域、两个跨膜结构域和保守的C末端MSC结构域相似(图1B)(Mans等人，2004年). 因此，LEM基序可能来自SAP基序，包含SAP/LEM和MSC结构域的蛋白质可能代表进化上保守的LEM2蛋白家族。此外，一组MAN1型蛋白质可能是从LEM2祖先进化而来的，其特征是存在额外的C末端RRM结构域（黄色）。

在确认LEM2为LEM蛋白家族的新成员后，我们希望分析该蛋白的表达模式和生化特性。半定量RT-PCR分析显示，LEM2在所有测试的人类和小鼠组织中普遍表达，其水平相当(图1D). 此外，LEM2转录物在小鼠发育的后期也可检测到（dpc 12、14、16、18；数据未显示）。这些数据与之前报道的Ce-LEM2的普遍表达一致(格伦鲍姆等人，2002年).

为了确定LEM2蛋白的亚细胞定位，我们在各种细胞类型中稳定表达了V5标记的hLEM2。稳定HeLa克隆的共焦免疫荧光显微镜显示，表达的LEM2仅定位于NE，导致核外周出现典型的边缘样染色(图2A). 在COS7和MDCK细胞以及人和小鼠原代皮肤成纤维细胞中获得了相同的数据（数据未显示）。为了区分LEM2在INM和ONM中的定位，我们用洋地黄素渗透细胞，选择性地破坏质膜，保持NE膜完整(Adam等人，1990年). hLEM2的C末端V5标签和核质蛋白LAP2α的抗体未检测到细胞核内地高辛处理的间期细胞中的蛋白质；相比之下，有丝分裂细胞的核膜被破坏，在细胞质中可以看到LEM2-V5和LAP2α（箭头所示，图2B). 细胞质中洋地黄处理间期细胞的弱LEM2染色可能代表内质网中LEM2-V5的一小部分。由于NE中的LEM2不能用于洋地黄治疗间期细胞中的抗体，我们得出结论，LEM2 C末端位于核质中，这意味着hLEM2是INM的组成部分。

为了测试hLEM2是否真的是一种跨膜蛋白和核膜的组成部分，在含有尿素或非离子洗涤剂的缓冲液中提取稳定HeLa克隆的分离细胞核，以及hLEM2和特征良好的INM蛋白LAP2β的分布(Foisner和Gerace，1993年)用免疫印迹法分析可溶性和不溶性组分(图2C). 观察到的M（M）_对60×10的LEM2-V5^三接近计算值M（M）_对(58×10^三). 与LAP2β类似，LEM2在含有200 mM盐或Triton X-100和低盐浓度（50 mM）或8M尿素的缓冲液中仍然不溶。只有使用洗涤剂和中等盐浓度缓冲液（1%Triton/200 mM NaCl）进行处理，才能溶解大部分LEM2(图2C). 因此，根据这些生化标准，LEM2是INM的跨膜蛋白，与核骨架-板层网络相关，类似于LAP2β。为了支持这一模型，Schirmer和Gerace用消减蛋白质组学方法检测了大鼠核膜部分的LEM2（NP_666187.1）(Schirmer等人，2003年).

在有丝分裂期间，当细胞核在姐妹染色单体分离后解体并重新组装时，LEM2的行为与其他含LEM域的膜蛋白类似。从前期到中期，通过磷酸化组蛋白H3的存在进行鉴定(Juan等人，1998年)，核膜逐渐解体，LEM2扩散到细胞质中，并在细胞质中保留到末期(图3A). 类似于emerin和LAP2β(Dechat等人，2004年;Haraguchi等人，2001年)，LEM2仅在组装的后期，即LAP2α在染色质相关的核心区域积累和LBR在解聚染色体的外围区域检测到后，才重新变大为NE(图3B). 总之，基于其在间期核中的亚细胞定位、有丝分裂期间的动态行为及其生化特性，LEM2与LEM结构域家族的其他完整核膜蛋白没有区别。

提取研究表明hLEM2与薄层核骨架支架有关（见上文）。此外，在秀丽线虫，Ce-LEM2以层粘连依赖的方式定位于NE(刘等人，2003)在哺乳动物中，LEM域蛋白emerin需要A型层粘连蛋白来靶向NE(Sullivan等人，1999年;沃恩等人，2001年). 为了探讨hLEM2的NE定位是否也依赖于A型层粘连蛋白，我们分析了hLEM2在MEFs中的定位。在野生型MEF中，LEM2-V5优先定位于NE(图4A); 然而，在Lmna公司^–/–MEF、LEM2-V5分布在整个ER(图4B). GFP-laminA在Lmna公司^–/–定位于东北部的MEF恢复了hLEM2-V5在东北部主要呈轮辋状的定位(图4C)表明层粘连蛋白A是LEM2在INM的滞留所必需的。为了进一步测试这个模型，我们通过引入无头细胞来干扰内源性A型层粘连蛋白在表达LEM2-V5的HeLa细胞中的分布爪蟾层粘连蛋白突变体，GFP-xLaminB1Δ2+，积聚在核质聚集物中，导致内源性A型层粘连从外周层重新分布到这些聚集物(Dechat等人，2000a;Izumi等人，2000年). 在含有突变层粘连核聚集体的细胞中，hLEM2的很大一部分定位于推测的内质网(图4D然而，在未转染细胞中，hLEM2主要定位于NE。由于突变的层粘连蛋白明显导致了这些细胞内源性层粘连a/C的定位错误(图4E)这一发现与NE层粘连蛋白A/C的缺失破坏了LEM2在INM的锚定并导致其扩散到内质网的假设一致。

为了测试hLEM2是否与A型层粘连蛋白相关，我们进行了印迹覆盖分析。³⁵将S标记的全长hLEM2（FL）或N末端hLEM2-片段（NT）或LAP2α覆盖在包含层粘连C头部、杆或尾部结构域的固定化GST标记层粘连C片段上，并覆盖在固定化LAP2(Dechat等人，2000a). 与已知的层粘连蛋白C结合蛋白LAP2α类似，hLEM2强烈结合到层粘连C的C末端(图4F，车道3）。含有层粘连蛋白C头部（第1道）或杆（第2道）或LAP2α（第4道）或仅含GST（第5道）的层粘连蛋白质C片段没有结合背景水平以上的hLEM2。hLEM2的N末端也与层粘连C的C末端结合，尽管这种相互作用比全长LEM2弱(图4F). 总之，我们的数据强烈支持a型层粘连蛋白通过直接相互作用在NE靶向和稳定hLEM2中的作用。

为了确定负责NE靶向和保留的hLEM2结构域，我们研究了带有C末端V5标记的hLEM1片段在HeLa细胞中的定位。而缺少C末端的片段，包括MSC和第二跨膜区(图5，LEM2ΔCT），仍然定位于NE的连续边缘，几乎缺失完整N末端的碎片不再保留在NE，主要定位于ER（LEM2△LEM+NT）。这表明N末端对于LEM2的NE保留是必不可少的。由于LEM2片段在靠近第一跨膜结构域（LEM2ΔNT）的N末端缺失了一个～70aa区域（aa 130-203），其行为类似于野生型蛋白质，我们得出结论，潜在的N末端核滞留信号位于位置130的上游。为了测试N末端保留信号是否足以用于LEM2靶向，我们表达了不含跨膜结构域的N末端和C末端（LEM2-NT）。该片段定位于细胞核，但未在NE聚集。因此，N末端足以用于核靶向，但不用于靶向INM。后一个过程需要额外的跨膜区域。这一观察结果与先前的研究一致，这些研究表明，INM蛋白定位于核外周需要跨膜结构域和介导与核成分结合的保留信号(霍尔默和沃曼，2001年). 为了测试保留信号是否位于LEM结构域内，LEM结构区可以通过与染色质蛋白BAF结合在INM中保留LEM2，我们表达了包含整个LEM基序（LEM2-LEM）的LEM2的N末端74 aa片段。然而，LEM2-LEM定位于整个细胞，表明LEM2的LEM域不足以进行核保留。基于我们观察到的LEM2的NE靶向依赖于A型层粘连蛋白的存在，我们推断LEM2 N末端的保留结构域可能介导与层粘连蛋白A/C复合物的结合。为了测试这种可能性，我们在Lmna公司^–/–MEF公司。与野生型HeLa细胞相比，LEM2-NT在层粘连A缺陷细胞的细胞核中没有积累(图5，右下面板）。综合所有数据，LEM2靶向NE需要跨膜结构域和位于残基74-130之间的N末端保留信号，该信号介导与层粘连a/C复合物的结合。

hLEM2-V5在多个细胞系中的低到中度稳定表达导致该蛋白在核外周平滑连续分布，这是完整INM蛋白的典型特征（参见图2A). 如果该蛋白在稳定细胞系（如HeLa和C2C12成肌细胞）中高水平表达（异位与内源性LEM mRNA之比>2(图6A). 然而，在共焦显微镜下通过这些细胞的z堆或光学xz切片中，所有LEM2结构都位于核外围(图6B)和透射电子显微镜分析了这些细胞中大量指状的核膜侵入(图6C). LEM2斑块通常沿整个东北方向以规则的模式排列，并且大小不同(图6A、B). 洋地黄素提取细胞中LEM2斑块未染色（数据未显示，另请参阅图2)，表明它们位于INM。

为了测试这些LEM2簇的形成是否会影响其他INM或层蛋白的分布，我们通过双重免疫荧光显微镜分析了转染细胞和未转染细胞中各种NE蛋白的定位。层粘蛋白B1（数据未显示）和层粘蛋白B结合伙伴LBR(图7)在LEM2集群中没有显著积累。相比之下，LEM2斑块中的A型层粘连蛋白部分富集，尽管它们仍然局限于整个NE(图7，箭头）。此外，emerin与层粘连蛋白A相互作用(Clements等人，2000年;Holaska等人，2003年)和BAF，可能与LEM2和/或emerin的LEM域相关，显示了东北部LEM2集群的最显著重组(图7). 因此，我们得出结论，高表达的LEM2聚集在INM的斑块中，并招募A型层粘连蛋白和A型层粘蛋白结合蛋白，而B型层粘着蛋白及其相互作用伙伴（LBR）没有受到影响。这些结果表明，LEM2与层粘连蛋白A/C结构相关，并支持上述NE处LEM2的层粘连A/C依赖性稳定和保留模型。有趣的是，过度表达的hMAN1-V5并没有在斑块中积累，但MAN1-V和LEM2-GFP的共同表达导致这两种蛋白在簇中积累，表明LEM2也可以招募MAN1。

与未转染的对照细胞不同，大量（高达10%）LEM2过度表达的细胞在相邻细胞的细胞核之间包含管状结构。这些结构也包含LEM2，长达30μm，经常起源于东北部的LEM2斑块(图8B，箭头）。肌动蛋白对这些细胞的双重染色(图8A)研究表明，小管连接发生在完成胞质分裂的单个细胞之间。此外，管状结构似乎是稳定的，可以维持很长时间，因为我们检测到多达四个相互连接的细胞(图8F). 关于这些管状结构的生物成因，它们很可能是在末期和G1的NE组装期间形成的。含LEM2的管状结构在末期从染色质上的LEM2斑块延伸，在进展到G1期时长度增加(图8E，箭头）。相邻细胞之间管状连接的形成显然不影响细胞周期的进展和随后的细胞分裂。连接的间期细胞含有磷甾酮3，这是细胞分裂的标志(图8C)晚期/G1期的细胞对与大型间期细胞相关(图8D)表明具有管状连接的细胞可以正常分裂。

使用不同叶片蛋白抗体的双重免疫荧光显微镜显示，与NE的LEM2相关斑块相似(图7)细胞核之间的管状结构还包括层粘连蛋白A、emerin和BAF(图9)而层粘连蛋白B1和LBR几乎或根本无法检测到(图9). 由于细胞核之间的结构包含几个核膜蛋白，它们很可能代表与相连细胞核的NE连续的膜结构。然而，核孔(图9，NUP62）和ER蛋白α-calnexin缺失。此外，微管蛋白等细胞骨架蛋白(图9)或肌动蛋白(图8)在连接小管中未检测到。我们认为，A型层粘连蛋白和层粘连A相关蛋白向过度表达的LEM2的募集导致NE异常，导致从染色质附着的核膜延伸出的额外膜片的形成。

在本研究中，我们对LEM域蛋白家族的一个新成员进行了表征，并根据先前建议的命名法将其命名为LEM2(Lee等人，2000年). 广泛的计算分析将LEM2和MAN1定义为一个具有共同结构域的亚家族，由一个N端LEM基序、两个跨膜结构域和一个高度保守的C端MSC结构域组成。MAN1与LEM2蛋白的不同之处在于在末端C末端存在额外的RRM结构域。根据这些标准，Ce-LEM2，它以前被描述为秀丽线虫(Lee等人，2000年)，是LEM2型蛋白质。有趣的是，LEM结构域的结构分析表明与细菌蛋白质中发现的结构域具有同源性，表明进化中有一个共同的祖先(Mans等人，2004年). 根据这一假设，在酵母蛋白Src1p中发现的螺旋延伸螺旋基序可能代表LEM结构域和高度相关的SAP基序的共同祖先(Aravind和Koonin，2000年). 因此，酵母Src1p可能代表一种祖先的LEM2型蛋白质，因为它含有一个LEM/SAP结构域、两个预测的跨膜区域和C末端MSC结构域。此外，酵母Src1p也可能与LEM2/MAN1蛋白共享一些功能，因为GFP标记的Src1b定位于酵母核膜，可能参与姐妹染色单体分离(Rodriguez-Navarro等人，2002年).

我们的研究表明，LEM2定位于INM，是一种真正的层蛋白，其特征是在用洗涤剂和高盐处理细胞核后与不溶性层蛋白结构共分馏(Foisner和Gerace，1993年). 不幸的是，我们生产抗N末端肽抗体的努力仍然失败，因此哺乳动物LEM2的特征依赖于异位表达数据。有趣的是，我们发现LEM2需要核外周的A型层粘连蛋白来靶向NE。缺乏A型层粘连或内源性层粘连A结构的破坏导致LEM2在内质网的定位错误。因此，LEM2可以被视为A型层黏连相关蛋白。我们的体外结合数据显示，体外翻译的LEM2与层粘连蛋白C的相互作用表明这些蛋白质直接相互作用，这与Ce-LEM2和人类MAN1的各种研究一致。首先，Ce-LEM2是迄今为止唯一一种通过生物化学和遗传学方法分析的LEM2型蛋白，其NE定位也需要层粘连蛋白，并且在印迹覆盖分析中已显示通过N末端与Ce层粘连蛋白相互作用（Ce-LEM2；aa 1-333）(刘等人，2003). 其次，发现MAN1的N末端在体外与A型和B型层粘连蛋白的球状尾结构域相互作用(Mansharamani和Wilson，2005年). 与这些发现一致，我们还发现，介导LEM2在NE中的层粘连蛋白A依赖性保留的结构域定位于LEM2 N末端的约60个残基。emerin也有类似的行为，它在体外与A型层粘连蛋白结合(Clements等人，2000年;Holaska等人，2003年)NE定位需要A型层粘连蛋白(Sullivan等人，1999年;沃恩等人，2001年).

LEM2的高水平过度表达导致NE处斑块中的蛋白质积累，并形成NE内陷，这种效应在过度表达的人类MAN1中未观察到。有趣的是，与层粘连B1和LBR不同，层粘连A、emerin和BAF也重组为这些结构，这表明LEM2在NE成分子集的结构组织中发挥作用。由于NE蛋白的这一亚群主要包括以前在A型层粘连蛋白复合体中检测到的蛋白质，我们建议LEM2参与NE内A型层黏连蛋白的组织。鉴于emerin和BAF似乎比A型层粘连蛋白更有效地被招募到这些斑块状结构中，很容易推测这些蛋白质可能以高亲和力直接与LEM2结合。而BAF与LEM2的结合可能由LEM结构域和C末端区介导(刘等人，2003)最近证实，emerin和MAN1之间的相互作用可能通过LEM2中与MAN1相关的区域介导emerin的结合(Mansharamani等人，2005年). 有趣的是，LEM2结构似乎与含有层粘连B的蛋白质复合物不同。以前的研究表明，过表达的GFP标记的LBR(Ellenberg等人，1997年)以及内源性LBR，在东北部的“微域”中积累(Makatsori等人，2004年). 这些观察结果表明，NE可能组织在不同的亚结构域中，每个亚结构域都包含INM和层蛋白的特定子集。

除了LEM2贴片外，我们还观察到相邻细胞细胞核相互连接的管状结构，其中含有LEM2、层粘连蛋白A、埃默林、MAN1和BAF，但很少含有层粘连蛋白B和LBR。目前，这些膜状核间连接是如何形成的分子细节尚不清楚。对活细胞中出现的这些结构的分析表明，它们是在染色质的LEM2补丁的末期形成的，但我们没有看到Ce-LEM2–Ce-emerin双缺陷或Ce-BAF缺陷蠕虫中描述的后期桥(刘等人，2003). 尽管我们在大约20%的这些结构中检测到少量染色质，但我们从未发现磷酸化组蛋白H3，如C.秀丽。过量的LEM2可能会在NE后中期重组过程中干扰A型层粘连蛋白和/或相关蛋白的组装，如emerin和BAF。可以推测，LEM2过度表达细胞中的核间桥也是由姐妹染色单体分离后核膜组装缺陷引起的，尽管没有观察到功能性NPC插入这些桥中。有趣的是，连接的细胞保持复制能力，并正常地重新进入有丝分裂。总之，LEM2过度表达后观察到的表型暗示了该蛋白在细胞周期中膜组装和动态NE组织中的功能。

LEM2的特性也使该蛋白成为参与椎板病型疾病的有趣候选蛋白(伯克和斯图尔特，2002年; 戈兹曼，2004年；Gruenbaum等人，2005年;Hutchison and Worman，2004年;Mounkes和Stewart，2004年). 首先，发现LEM2与A型层粘连蛋白复合物相关。与疾病相关的突变LMNA公司基因可能破坏这种复合体在细胞核和染色质组织中的潜在功能。第二，当层粘连蛋白A丢失时，LEM2的行为与emerin完全相同，这意味着这些蛋白质在脊椎动物中的功能重叠。emerin的As突变被发现导致Emery-Dreifuss肌营养不良（EDMD）(Bione等人，1994年;埃默里，1987年;埃默里和德雷福斯，1966年;Manilal等人，1996年)LEM2可能与类似疾病有关。在这种情况下，值得注意的是，只有40%的临床诊断的EDMD病例与层粘连蛋白A或emerin的突变有关，而60%的病例可能是由其他NE成分的突变引起的，这些NE成分具有与层粘着蛋白A/C和emerin类似的功能。第三，MAN1的突变最近与骨斑点病有关，以骨密度增加为特征的Buschke-Ollendorf综合征和骨质疏松症(Hellemans等人，2004年). 然而，这些疾病中检测到的至少一些临床表型可能与最近确定的MAN1作为BMP、TGF-β或激活素介导的通路拮抗剂的作用有关（Lin等人，2004；Lin等人，2005年;Osada等人，2003年;Pan等人，2005年). 到目前为止，我们还无法检测到LEM2的类似拮抗信号活动（我们尚未公布的数据），很可能是因为LEM2缺乏C末端RRM基序，已知该基序可介导与R-Smads的结合(Osada等人，2003年;Pan等人，2005年). 然而，MAN1的信号依赖性功能也可能有助于疾病表型，在这种情况下，人们还可以预期LEM2缺失的临床症状。

我们感谢K.Furukawa（日本新泻大学）、E.Ivessa（奥地利维也纳医科大学）、H.Hermann（德国海德堡DKFZ）、D.Vaux（英国牛津威廉·邓恩爵士病理学院）和C.Stewart（美国NCI-Frederick）慷慨捐赠试剂。这项工作得到了奥地利科学研究基金会（FWF，P15312）对R.F.的研究资助，以及“Hochschuljubila¨umsstiftung der Stadt Wien”对J.G.的HSJ-2资助。