人乳头瘤病毒介导的DNA损伤传感和修复抑制驱动皮肤致癌

摘要

背景

未能建立有效的DNA损伤反应来修复紫外线诱导的环丁烷嘧啶二聚体（CPD）导致皮肤鳞状细胞癌（cSCC）的发病倾向增加。高危患者群体，如器官移植受者（OTRs），经常在暴露于紫外线的身体部位表现出现场癌变，多发性人乳头瘤病毒（HPV）相关的cSCC从该部位迅速发展，导致严重的发病率和死亡率增加。体外分子证据表明，β-乳头瘤病毒属HPV（β-PV）在加速皮肤肿瘤发生的早期阶段起着重要作用。

方法

我们通过将K14-HPV8-E6wt小鼠（紫外线治疗后发生皮肤肿瘤）与K14-CPD-光解酶动物杂交，并通过产生K14-HPV8-E6-K136N突变小鼠株，研究了紫外线诱导的β-PV E6癌蛋白驱动的皮肤肿瘤发生小鼠模型中DNA损伤的作用。通过免疫组织化学和细胞内Western印迹法在小鼠皮肤和器官型皮肤培养物中测定了紫外线照射后表达E6的原代人角质形成细胞中胸腺嘧啶二聚体（CPD标记物）和γH2AX（DNA双链断裂标记物）的水平。通过Western blots和免疫组织化学方法评估细胞株和器官型皮肤培养物中ATR/Chk1和ATM的磷酸化。

结果

K14-HPV8-E6wt小鼠紫外线照射后皮肤肿瘤的发展可以通过CPD光解酶的表达完全阻断。通过紫外线照射后表达E6蛋白的细胞中胸腺嘧啶二聚体的定量，并在保守残基处点突变，我们在蛋白的C末端部分确定了一个关键赖氨酸，用于预防DNA损伤修复和p300结合。然而，所有K14-HPV8-E6wt动物在紫外线照射下表达HPV8-E6-K136N突变体后，都会发生皮肤肿瘤，这显著阻止了紫外线照射后皮肤肿瘤的发展。CPD在过度增殖表皮K14-HPV8-E6wt皮肤中的持续存在导致γH2AX病灶的积聚。由于ATM、ATR和Chk1缺乏磷酸化，单层培养和器官型培养的E6阳性细胞的DNA损伤传感受损。

结论

我们发现，表达E6的细胞无法感知并产生修复紫外线诱导的DNA损伤的有效反应，并证明E6介导的DNA损伤修复抑制与肿瘤发生的生理相关性。这些是第一个关于HPV8致瘤性的体内机械数据，并证明病毒E6蛋白对DNA损伤修复途径的损伤是HPV驱动的皮肤致癌的关键因素。

背景

暴露于太阳紫外线B波长（UVB）是皮肤癌发生的主要风险因素。UVB通过形成潜在的诱变光产物、环丁烷嘧啶二聚体（CPD）或6-4光产物（6-4PP）来破坏DNA[1]. 转录组分析表明，CPD诱导的最显著的途径与DNA双链断裂（DSB）有关。这些结果表明，DNA复制过程中未修复的CPD转化为DSB是紫外线介导细胞毒性的主要来源[2]CPD是造成大多数DNA损伤依赖性生物效应的主要病变[三]. DNA修复机制在预防皮肤癌发展中的重要性在某些人类综合征中得到了明确证明，例如着色性干皮病（XP），其特征是DNA修复过程存在缺陷，加剧了未修复DNA损伤导致遗传不稳定的临床效应。XP的特点是严重的紫外线敏感性，导致紫外线暴露组织发生皮肤癌的风险增加10000倍[4]表明未修复的DNA损伤与癌症之间存在明确的因果关系。使用表达多孔三指虫角蛋白-14启动子（K14-CPD-PL）控制下的CPD-光解酶表明，从K14-容许细胞中快速去除CPD可显著降低紫外线处理动物皮肤癌的发病率[5–7].

除了紫外线辐射外，在医源性免疫抑制患者皮肤SCC（cSCC）的起始阶段，β-PV属的人乳头瘤病毒（HPV）（β-PV，例如HPV5和HPV8）也发挥着新的致病作用[8–10]. 这些侵袭性肿瘤出现在暴露在阳光下的皮肤区域，表现为“现场癌变”，伴随着快速发展的多种肿瘤的发展，发病率增加。

HPV8的致癌能力可以在转基因小鼠中得到证明，在人类角蛋白-14启动子的控制下表达HPV8的完整早期基因区（CER）。这些K14-HPV8-CER小鼠自发发展为乳头状瘤，特征是在数月内未经任何物理或化学致癌物治疗，出现不同程度的表皮异型增生和SCC[11]. 只表达K14启动子HPV8 E6基因（K14-HPV8-E6）的转基因小鼠也表现出较高的乳头状瘤外显率，随后发展为发育不良和鳞状细胞癌。K14-HPV8-E6转基因小鼠单次UVA/B照射加速了肿瘤的发展，因为治疗后三周内出现了乳头状瘤[12]. 在乳头状瘤发生之前，转基因表达增加，在CER的背景下，HPV8-E6特异性siRNA敲低E6 mRNA，导致乳头状瘤的发生延迟和发病率降低。这表明E6是小鼠表皮HPV8的主要癌基因，因为早期增加E6表达对于诱导乳头状瘤的形成是必要的和充分的[13]. 体外研究表明，抑制紫外线诱导的细胞凋亡[14,15]和紫外线照射后DNA损伤修复[16])代表β-PV E6蛋白的两种活性，可能导致受损细胞存活。

然而，目前，抑制凋亡和干扰DNA修复在HPV E6驱动的肿瘤发生中的不同作用尚待解决。在这项研究中，我们提供了令人信服的证据，证明在紫外线治疗的HPV8转基因小鼠中，干扰DNA修复途径对于皮肤肿瘤的发生是必要的和必须的。这些发现对人类皮肤癌的发展具有重要的临床意义。

结果和讨论

K14-HPV8-E6wt小鼠CPD修复增强可消除紫外线诱导的皮肤肿瘤形成。为了揭示HPV8-E6在体内引发皮肤肿瘤时受损DNA损伤修复的生理相关性，通过K14-HPV8-E6wt与K14-CPD-PL动物杂交，在HPV8-E6细胞中表达CPD-PL。用紫外线照射产生的小鼠。E6公司⁻/损益⁻和E6⁻/损益⁺作为对照，室友没有出现任何皮肤损伤。所有E6⁺/损益⁻在UVB治疗三周后，这些动物发生了紫外线诱导的皮肤肿瘤，这与之前在组织学上显示的乳头状瘤病和角化过度的发现一致。然而，光解酶活性的重新激活完全逆转了E6诱导的皮肤表型，导致E6的肿瘤发展受到显著和完全的抑制⁺/损益⁺紫外线照射后的小鼠（图1a个). 胸腺嘧啶二聚体（T^T，作为CPD的标记物）染色显示，未经处理的皮肤中检测不到CPD，紫外线处理的E6中存在CPD⁺/损益⁻双转基因小鼠的皮肤在光激活3天后完全修复（图1亿). 因此，通过CPD-PL消除K14-HPV8-E6wt转基因小鼠K14允许皮肤细胞中的CPD，会损害紫外线照射后乳头状瘤生长的启动。这些结果提供了第一个体内实验证据，证明修复紫外线诱导的CPD的失败是HPV8-E6介导的皮肤肿瘤发展的初始步骤。

图1

K14-HPV8-E6wt小鼠CPD修复可消除紫外线诱导的皮肤肿瘤形成。一K14-HPV8-E6wt动物（FVB/n背景）与K14-CPD-PL（FVB/n背景）交配，F1代后代接受紫外线照射。通过将动物暴露在白色荧光灯管中，CPD-PL被重新激活。图中显示了具有代表性的宏观(上部面板)和组织学(下面板，显示放大倍数)E6的皮肤图像⁻/损益⁻（n）=========================================================================11） ，E6⁻/损益⁺（n）=========================================================================11） ，E6⁺/损益⁻（n）=========================================================================11） 和E6⁺/损益⁺（n）=========================================================================7） 紫外线照射24天后采集的动物b条E6的T^T染色皮肤切片的代表性图像⁺/损益⁻（n）=========================================================================3） 和E6⁺/损益⁺（n）=========================================================================3） 紫外线处理和光活化后3天收集的小鼠（放大倍数：640×）

HPV8-E6干扰CPD修复对乳头状瘤的形成至关重要

我们之前已经证明，与HPV8密切相关的HPV5的E6表达会损害UVB诱导的CPD的修复，而HPV10、23、24、49和77的E6蛋白不具有这种活性[17]这表明特定的HPV类型可能会导致皮肤肿瘤的发生。我们现在显示，除了HPV5(第页 < 0.0001），HPV8(第页 < 0.0001）和HPV20(第页=========================================================================0.0002）E6蛋白也可以显著延迟UVB诱导的T^T修复（参见附加文件1图S1），表明这些HPV类型可能具有更大的致瘤风险。

为了进一步表征与DNA修复干扰有关的E6的活性，研究了一组表达先前表征的E6蛋白的细胞系，这些蛋白在HPV5和HPV8 E6保守残基处发生点突变。发现所有突变蛋白都稳定表达，并保留了抑制UVB诱导的细胞凋亡的能力[18]. 在测试的E6突变体中，只有K138N在干扰T ^ T修复的能力方面受到严重损害（K138N与E6wt，第页=========================================================================0.0057; K138N与对照，第页=========================================================================0.07; 学生t检验），而所有其他突变体显示出与野生型HPV5-E6蛋白类似的活性（HPV5-C6wt与对照，第页=========================================================================0.0032，学生t检验）。该数据表明，残余K138的完整性对于E6延迟T^T修复非常重要（图2a个)抑制凋亡和干扰DNA修复途径是E6的功能性分离活动。

图2

β-PV E6抑制DNA损伤修复。一使用细胞内Western分析一组HPV5-E6突变体，以检测延迟修复表型。K138N突变体完全阻断了HPV5-E6延缓UVB诱导的T^T修复的能力(n个=========================================================================一式三份；对照与HPV5-E6wt，**，第页=========================================================================0.0032; HPV5-E6wt与HPV5-C6K138N，**，第页=========================================================================0.0057; 对照组与HPV5-E6-K138N，第页=========================================================================0.07). 数据以平均值表示 ± 扫描电镜。b条代表性宏观图像(上部面板)FVB/n-wt的组织学（下面板，放大显示）(n个=========================================================================15） ，K14-HPV8-E6wt(n个=========================================================================12） 和K14-HPV8-E6K136N动物(n个=========================================================================50）紫外线照射24天后服用。c（c）显示紫外线照射后发生乳头状瘤的动物百分比的条形图

然后，我们建立了K14-HPV8-E6K136N转基因小鼠模型（HPV8-E6中的K136对应于HPV5-E6-K138），以检查这些动物中紫外线诱导的皮肤肿瘤发育是否受损。五周龄无皮肤异常的动物接受一次炎症辐射剂量的照射，该剂量的辐射已知会导致“晒伤”（凋亡）细胞的形成。紫外线治疗后，没有一只缺乏E6表达的小鼠出现皮肤损伤，皮肤完全从UVB诱导的增生中愈合。虽然所有K14-HPV8-E6wt小鼠在照射后3周内都发生了乳头状瘤，但只有22%的K14-HPV 8-E6K136N小鼠出现了皮肤肿瘤形成，但78%的E6突变小鼠的皮肤已经完全愈合（图2 b、c). E6突变小鼠的肿瘤形成可能是由于K136对T细胞修复的残余活性所致。由于E6的mRNA水平在紫外线治疗后的乳头状瘤诱导中起重要作用，我们比较了K14-HPV8-E6wt和K14-HPV8-E6K136N小鼠系中E6的表达水平。通过qRT-PCR测定刮毛皮肤活检组织RNA中的E6 mRNA。未经治疗的正常皮肤中也发现了类似的E6水平(第页=========================================================================0.5414). 紫外线照射后第3天，E6水平在两个品系中的增加程度相似，没有显示出显著差异(第页=========================================================================0.2904），表明E6表达水平的差异与观察到的小鼠皮肤表型无关（参见附加文件2：图S2）。这些发现表明，E6干扰T^T修复的能力对于紫外线照射后皮肤肿瘤的形成至关重要。

UVB照射皮肤中表达HPV8 E6的DNA损伤持续存在

我们发现E6的表达干扰了T^T修复，增强的T^T修补消除了E6的致瘤潜能，接下来我们询问CPD损伤是否持续存在，是否可以通过免疫组化在这些动物的紫外线处理皮肤中检测到。正如预期的那样，在所有受检动物的非辐照皮肤中均未检测到T^T，但在紫外线照射6小时后，很容易检测出T^T。紫外线处理一天后，所有小鼠品系之间的T ^ T水平均无差异。然而，紫外线照射三天后，在FVB/n-wt皮肤中只能检测到少量T ^ T阳性细胞，表明这些损伤得到了有效修复。与FVB/n-wt对照组相比，K14-HPV8-E6wt组皮肤中存在的T^T阳性细胞显著增多(第页 < 0.0001）和K14-HPV8-E6-K136N突变小鼠(第页=========================================================================0.0003）（图3a、b).

图3

紫外线照射K14-HPV8-E6小鼠皮肤DNA损伤的持续性。一对FVB/n-wt、K14-HPV8-E6wt和K14-HPV 8-E6K136N小鼠经紫外线处理的皮肤石蜡包埋切片进行T^T染色（放大400倍）。的代表性图像n个=========================================================================显示了每条小鼠线每个时间点4次皮肤活检。b条T ^ T阳性细胞通过每3个区域的阳性细胞计数进行定量n个=========================================================================每条鼠标线和每个时间点有4只动物。紫外线处理后第1天，在T^T阳性细胞的数量上没有观察到显著差异（FVB/n-wt与K14-HPV8-E6wt，第页=========================================================================0.1094; FVB/n-wt vs.K14-HPV8-E6-K136N，第页=========================================================================0.1769; K14-HPV8-E6wt与K14-HPV 8-E6-K136N，第页=========================================================================0.8115). 治疗三天后，K14-HPV8-E6wt小鼠皮肤中的T ^ T阳性细胞明显增多（FVB/n-wt vs.K14-HPV 8-E6w，***，第页 < 0.0001; FVB/n-wt与K14-HPV8-E6-K136N，***，第页 < 0.0001; K14-HPV8-E6wt与K14-HPV 8-E6-K136N，***，第页=========================================================================0.0003). 数据以平均值表示 ± 扫描电镜

HPV E6蛋白的表达可以绕过G1-S期细胞周期检查点[17]. 由于未修复的T ^ T可通过DNA复制叉在S期崩溃导致产生高度遗传毒性和潜在诱变性DSB，我们还分析了这三个小鼠系的皮肤中是否存在组蛋白变体H2AX（称为γH2AX）的磷酸化，这表明存在DSB。UVB/n-wt小鼠的细胞在UVB治疗三天后未检测到γH2AX，而K14-HPV8-E6wt小鼠在乳头状瘤形成的早期（3d，5d）和晚期（13d，24d）均发现γH2AX（图4). 在治疗后3、5、13和24天收集的K14-HPV8-E6K136N小鼠的皮肤活检中，约80%显示出与FVB/n-wt相当的γH2AX染色强度，而约20%显示出与K14-HPV8-E6wt相似的染色模式，该染色模式与在这些动物中发现的肿瘤率相当。这些结果表明，E6维持DNA损伤的能力及其超越正常细胞周期检查点的能力，从而允许受损细胞持续存在和复制，即使是在DNA损伤的同时，也会导致产生已知与肿瘤形成相关的高度致突变性损伤。

图4

K14-HPV8-E6小鼠紫外线处理皮肤中的DNA损伤。紫外线处理皮肤的石蜡包埋皮肤切片进行γH2AX染色（放大400倍）。的代表性图像n个=========================================================================每个时间点显示4个小鼠皮肤活检

E6-DNA损伤修复的增强与DNA损伤传感的抑制有关

癌前病变的一个关键检查点是DNA损伤反应（DDR）的激活，而DDR是抑制肿瘤细胞进展的屏障[19,20]这涉及激活ATM和ATR两种激酶及其下游效应器Chk1和Chk2，后者调节参与细胞周期控制和凋亡的多种蛋白。事实上，ATM似乎是对随机DNA DSB反应的磷酸化H2AX的主要激酶，而H2AX的ATR磷酸化与紫外线损伤或复制应激有关[21]. 为了研究E6对UVB治疗后早期DDR介导的DNA损伤传感的影响，产生了表达HPV5-E6wt、HPV5-C6K138N或HPV8-E6wd的细胞株，并用喜树碱（CPT，一种产生DSB的DNA损伤剂）处理，或用5 mJ/cm辐射²中波紫外线。虽然缺乏E6表达的对照细胞安装了一个DDR，如ATR磷酸化所示（Ser428），但HPV5或HPV8 E6蛋白的表达阻断了ATR磷酸化合（图5a级). 然而，在E6细胞中检测到低水平的pATR并不是由于E6诱导的蛋白水解，因为ATR的总水平没有受到显著影响。Chk1（Ser317）的磷酸化模式与ATR的激活相关，进一步证明E6的表达抑制了该信号通路。相反，因抑制T ^ T修复而受损的HPV5-E6K138N突变体的表达并没有改变ATR或Chk1的磷酸化模式。

图5

E6的表达抑制ATM和ATR的磷酸化。一代表性免疫印迹(n个=========================================================================3） 表明HPV5和HPV8 E6在UVB照射24小时或喜树碱治疗4小时后抑制ATR和Chk1磷酸化。通过K138处HPV5-E6突变恢复正常磷酸化模式。ATR和Chk1的总水平不受E6表达的影响。b条HPV8-E6在器官型培养物中的表达延迟了DNA修复和DNA损伤感知。用20 mJ/cm照射平行生长的表达HPV8-E6或pLXSN空载体的培养物²UVB固定前24小时。代表性免疫组织化学染色(n个=========================================================================3） 实验表明，对照细胞中ATM和ATR磷酸化，HPV8-E6表达细胞缺乏磷酸化，这与未重配对T的存在有关^∧T型

还研究了用E6表达的逆转录病毒构建物或空载体转导的原代成人角质形成细胞产生的器官型皮肤培养物中DDR的激活情况。免疫组织化学分析显示，在UVB处理24小时后，UVB治疗的E6培养物中存在T^T，而在UVB-处理的对照培养物中未检测到T^T（图5亿). 因此，原代角质形成细胞表皮层的T^T染色模式与细胞系中T^T的检测密切相关。虽然在缺乏E6表达的对照培养物的细胞核中观察到磷酸化的ATR和ATM，但在HPV8-E6培养物中未发现ATM或ATR磷酸化，这是一种与UVB照射后T ^ T检测呈负相关的染色模式。这些发现表明，虽然E6表达细胞中的DNA损伤持续存在，但它们无法感知和安装DDR，从而绕过了肿瘤形成的关键屏障。

HPV8-E6K136N导致p300结合受损

皮肤E6蛋白对p300的干扰是细胞永生化和肿瘤发生所需的特性，而失去结合p300能力的E6突变蛋白无法执行这种致瘤活性（Münch等人，2010年）。以前的研究表明，HPV8-E6与细胞转录辅激活物和组蛋白乙酰转移酶p300相互作用[22–27]缺乏氨基酸132–136的HPV8-E6蛋白的缺失突变体不再结合p300[22]. 由于K136位于HPV8-E6的p300结合域，我们分析了HPV8-E6K136N是否仍与角质形成细胞中的p300相互作用。如图所示5厘米HPV8-E6表达后，细胞总提取物中p300的水平没有改变。当HPV8-E6wt结合p300时，突变型HPV8-E6K136N几乎完全丧失了与p300复合的能力。为了排除HPV8-E6K136N的三级结构改变导致p300缺失，突变蛋白与已知细胞靶蛋白MAML1和SMAD3结合的能力[25]进行了研究。HPV8-E6中K136N的aa取代不影响与MAML1和SMAD3的结合（图6). 至少在RTS3b角质形成细胞和C33a细胞中（数据未显示），与Howie等人（2011）的研究结果相比，我们没有观察到HPV8-E6表达后p300的降解[24]在其他单元格类型中。与稳定的p300水平一致，ATR总量也没有显著影响（图5a级)，而Wallace等人（2012年）[28]观察到与p300降解相关的ATR水平降低。总之，我们的数据表明，HPV8-E6与p300结合与磷酸化ATR水平降低和DDR受损相关，而不影响p300和总ATR水平。

图6

HPV8-E6K136N损伤p300结合。用空载体Flag-8E6wt或Flag-8E6K136N的表达载体瞬时转染RTS3b细胞的提取物，用M2-Flag-琼脂糖培养。免疫共沉淀p300、MAML1和SMAD3以及10%的输入提取物用特异性抗体进行Western blot检测。通过对Flag标签的Western blot证实HPV8-E6的表达。微管蛋白表达证实蛋白质负荷相等

结论

由于β-PV是皮肤正常微生物菌群的一部分，病毒感染本身并不代表皮肤致癌的主要事件[29]. 健康人中β-PV感染的高患病率和皮肤中病毒DNA的低水平引发了β-PV如何影响人类SCC发展的问题。鉴于癌前病变中的β-PV DNA载量超过SCC中的载量，在皮肤肿瘤形成的早期，β-PV E6癌蛋白与DNA修复机制的相互作用可能会使未修复或错误修复的紫外线诱导的病变持续存在，这与E6的抗凋亡活性相结合，可以促进有害突变的产生和传播，从而推动肿瘤的发生和发展。我们的结果提供了第一个体内实验证据，即基底细胞DNA修复机制的损伤是E6启动乳头状瘤生长所必需的，CPD损伤是E6-介导肿瘤发生所必需的。E6wt对细胞周期检查点激酶和p300磷酸化的干扰可能有助于DSB的积累，并有助于缓解K14-HPV8-E6wd小鼠皮肤增生导致的细胞周期阻滞。我们的发现提供了关于HPV8致瘤性的第一个体内机制数据，并提供了直接证据支持β-PV可能通过增强紫外线的遗传毒性作用在皮肤癌早期发展中发挥作用的假设。

材料和方法

质粒

为了产生HA标记的HPV5、HPV8和HPV20 E6蛋白，通过PCR从病毒基因组中扩增出相应的ORF，并在BamHI和XhoI限制位点两侧使用特定引物。然后将PCR产物连接到pcDNA3.1-5'HA[17]. HPV5-E6基于pcDNA3.1-5'HA的突变体已在前面描述[18]. K14CreERtam-HPV8-E6（也称为K14-HPV8-E6[12])使用QuickChange定点突变试剂盒（Stratagene）和引物HPV8-E6K136N-fw:5'CGTCCCTTTCAACGTTAGAGGCTG3'和HPV8-E6K136N-bw:5'CAGCCTCTAACGTTATAGAGGGGACGCGCGCGG 3'进行pcDNA3.1-Flag-HVV8-E6，得到AAA→AAC交换产生HPV8-E6K136N。

商业抗体

本研究中使用的抗体如下：抗胸腺嘧啶二聚体（Insight Biotechnology）、（抗γH2AX、MABE205、Millipore、Schwalbach、德国）、抗pATM（ser1981，Rockland）、抗ATR（Santa Cruz）、抗-pATR（ser428，Cell Signaling）、抗Chk1（Santa Cruz），抗pChk1，FLAG-M5单克隆抗体（A2220，Sigma）、抗p300（C-20，Santa Cruz）、抗微管蛋白（YL1/2，Abcam）、抗MAML1（细胞信号传导）、抗SMAD3（Abcam）。

细胞培养、转染和western blot

HT1080细胞保存在DMEM加10%胎牛血清中，补充抗生素，在37°C，5%CO的湿化环境中²根据制造商的说明，使用FuGENE 6转染试剂（Roche）通过转染质粒DNA生成多克隆细胞系。在采集蛋白质之前，用6μM喜树碱（CPT，Sigma）处理指数生长的细胞4小时，或用5 mJ/cm2 UVB照射，使用装有F8T5灯泡的紫外线产物CL400交联剂，在312 nm处产生尖锐的发射峰，并再培养8、24或48小时。采用LiCOR Odyssey免疫荧光检测系统，采用细胞内Western方法对HT1080细胞中的T ^ T进行定量。为此，细胞随后在PBS中清洗两次，并在RT下在3.7%多聚甲醛中固定20分钟，然后使用0.1%TritonX-100在PBS内渗透10分钟。细胞在Odyssey Blocking Buffer（OBB，LiCOR）中以1:1的比例在PBS中稀释1小时，RT.使用抗胸腺二聚体抗体在1:500的OBB/PBS加0.1%吐温20中稀释，然后使用羊抗鼠IRDye™800CW在1:800的OBB加0.2%吐温20（Rockland Immunochemicals）中稀释，检测T^T。Syto60核酸染色（LiCOR）在OBB/PBS/Tween中以1:5000的稀释度进行二聚体信号的标准化。使用LiCOR Odyssey红外成像扫描仪和定量软件对细胞进行可视化和荧光定量。对于含有全细胞蛋白提取物的Western blot，粘附细胞在RIPA缓冲液中溶解。将20μg蛋白质加载到SDS-PAGE凝胶上，并按照标准程序转移到硝化纤维素膜上。人角质形成细胞系RTS3b维持在RM+培养基中[30]. 2,5 × 10⁵细胞接种在10 cm培养皿中，并转染10μg含FuGENE 6的质粒DNA。转染后两天，用PBS冲洗细胞，并在100 mM LSDB缓冲液中刮取细胞（100 mM KCL、50 mM Tris–HCl、20%甘油和0.1%NP-40、1 mM二硫苏糖醇、1 mM苯基甲基磺酰氟和1×蛋白酶抑制剂Complete。对于Co-IP实验，将提取物与偶联到琼脂糖（A2220，Sigma）的FLAG-M2抗体在4°C下孵育2小时，然后用含有不同KCl浓度的LSDB进行三次清洗。用特异性抗体免疫印迹法检测与E6结合的细胞蛋白。先前描述了表达HPV8-E6的原代人角质形成细胞的脱脂人类真皮器官型培养[31,32].

鼠标线

本研究中使用的小鼠系包括FVB/n-wt（德国苏尔兹菲尔德Charles River Laboratories）、转基因半合子FVB/n系K14-HPV8-E6wt[12]转基因半合子C57BL/6 J小鼠表达多孔三指虫hK14启动子（K14-CPD-PL[5,7]). 为了产生K14-HPV8-E6K136N系，将HPV8-E6K136N基因受人角蛋白-14（K14）启动子控制的线性化转基因微注射到受精FVB/n卵母细胞的原核中，将其植入假孕代孕妈妈体内，以产生假定的创始小鼠。如前所述，进行PCR分析以检测转基因小鼠[12]. 简单地说，使用QIAmp组织试剂盒（德国希尔登市齐根）从3周龄小鼠的尾部活检中分离出基因组DNA。用以下引物对小鼠基因组DNA样本进行PCR分析，以确定是否存在转基因：HPV8-E6-fw:ggatccttcctaagcaaatggacgg；HPV8-E6-bw:ggatccgcatcaaaaatcttgcacagtgactc；CPD-PL-fw:tgagactctccccaggac；CPD-PL-bw:caccaatgctgtttgc。PCR反应条件包括3分钟的变性步骤（95℃）和35个扩增周期（95℃，30秒；60℃，1.5分钟；72℃，1分钟）。K14-CPD-PL小鼠（C57/BL6）与FVB/n-wt动物回交5代，然后与K14-HPV8-E6wt（FVB/n）交配。

紫外线照射和小鼠皮肤的光活化

紫外线照射方案由政府动物护理办公室North-Rhine-Westphalia（Leibnizstra块e 10，45659 Recklinghausen，方案编号8.87–50.10.35.08.163）批准，并符合德国动物福利法以及德国实验动物保护条例。对于年龄（5周）和性别匹配的小鼠，用10 J/cm的剂量照射一次背部尾部皮肤²紫外线和1焦耳/厘米²4厘米上的UVB²大小区域。为了在UV处理后进行光活化，将双转基因阳性动物暴露于通过5mm玻璃过滤的4个白色荧光管（GE Lightning Polylux XL F36W/840）的光下。紫外线处理后第34天，对所有后代进行肉眼检查，以确定是否存在皮肤损伤。

免疫组织化学

对福尔马林固定、石蜡包埋的器官型培养物和小鼠皮肤的聚赖氨酸包被载玻片上的4μM切片进行了分析。切片通过在100%二甲苯中洗涤来脱蜡，通过在降低乙醇浓度的洗涤中进行再水化。然后将切片在3%过氧化氢和甲醇中培养20分钟，以抑制内源性过氧化物。通过将组织切片在微波烧杯中的10mM柠檬酸缓冲液中煮沸3分钟，然后在RT下静置15分钟来进行抗原揭开。然后将切片在PBS（v/v）中的50%马血清中封闭30分钟。一级抗体在2%马血清/PBS中稀释，并在4°C下培养过夜。应用生物素化二级抗体，并使用链霉亲和素-生物素-过氧化物酶检测系统（Vectastain ABC或M.O.M.kit，Linaris，Dossenheim，Germany），使用DAB（3,3'-二氨基联苯胺）液体底物（Biogenex，Fremont，CA，USA）对载玻片进行可视化。切片在Gills Haematoxylin中进行复染，并通过增加乙醇浓度的洗涤进行脱水，然后安装在DePeX安装介质（德国海德堡Serva）中，并使用蔡司Axiopot显微镜和成像软件进行可视化。

qRT聚合酶链式反应

如前所述进行总RNA分离、反转录和qPCR[33]. 使用RNeasy Kit从组织和细胞中分离出总RNA，并根据制造商的说明（德国希尔登市齐根市），使用无RNAse的DNAse在柱上进行DNAse消化。使用Omniscript RT Kit（德国希尔登Qiagen）和10μM随机九聚体（德国柏林TIB MOLBIOL）、1μM寡核苷酸-dT23引物（德国德伊森霍芬Sigma）以及10单位RNA酶抑制剂（德国圣利昂罗特Fermentas）逆转录1μg总RNA。QPCR使用Light-Cycler系统进行（德国曼海姆罗氏）。将目标基因的总转录数归一化为家养基因次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1（HPRT1）的总拷贝数。一个PCR反应包含2μl 1:10稀释的cDNA，总体积为20μl，1.25个单位的铂Taq聚合酶和提供的缓冲液（德国卡尔斯鲁厄的英维特罗根），4 mM MgCl2，1.6μl 1:1000稀释的SYBGreen（德国德伊森霍芬的西格玛），5%二甲基亚砜，各0.5μM正向和反向引物，500 ng/μl非乙酰化牛血清白蛋白（Fermentas，St.Leon-Rot，德国）和0.2 mM脱氧核苷酸三磷酸盐。扩增的PCR片段被克隆到pJET1.2（德国希尔登Qiagen）中，以产生绝对标准，并使用引物进行后续qPCR分析。将样品与标准质粒的10倍稀释系列一起一式两份进行分析。循环方案条件为95°C下10分钟，然后在95°C（20°C/s）下40次循环，每次15秒，在55°C（20C/s）时30秒，在72°C（20mC/s）条件下30秒。本研究中使用的引物如下：mHPRT1-fw:cctaagagcgcaagtgaa；mHPRT1-bw:ccacagagacataca；HPV8-E6-fw:ccgcaacgttgaatttaatg；HPV8-E6-bw:attgaacgtcctgtagcatatca（高压8-E6-bw）。

统计分析

所有实验至少重复三次。细胞内蛋白印迹分析和qRT-PCR的所有数据均表示为平均值 ± SEM。以免疫印迹或免疫组织化学分析图像形式呈现的数据来自一个具有代表性的实验，该实验在复制实验中定性相似。使用未配对双尾学生的吨-测试。图中的星号表示实验组的显著差异(*第页 < 0.05; **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001, ****第页 < 0.0001).