本研究研究了 羊肚菌 果体（ME）及其在酒精诱导的急性肝损伤小鼠中的潜在机制。 系统分析表明，ME含有21种脂肪酸、17种氨基酸和12种矿物质。 随后，通过口服酒精14天建立小鼠急性酒精性肝损伤模型。 十四天服用ME可防止酒精诱导的丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶水平升高，并降低血清和肝组织中乙醛脱氢酶的活性。 ME似乎通过抑制肝脏中的甘油三酯、总胆固醇和高密度脂蛋白来调节脂质代谢。 ME抑制血清和/或肝组织中炎症因子的产生，包括几丁质酶-3样蛋白1（YKL 40）、白细胞介素-7（IL-7）、纤溶酶原激活物抑制剂1（PAI-1）和视黄醇结合蛋白4（RBP4）。 ME治疗通过核因子-红细胞生成素2相关因子2（Nrf-2）缓解了酒精诱导的促氧化和抗氧化信号失衡，如超氧化物歧化酶-1、超氧化物歧化酶-2、过氧化氢酶、血红素氧化酶-1、， 以及肝脏中血红素加氧酶-2的表达和kelch-like ECH-associated protein 1（Keap-1）的下调。 此外，ME降低了磷酸化核因子-κB激酶的水平 α / β ，核因子kappa-B抑制剂 α 和核因子kappa-B p65（NF- κ B p65）在肝脏中。 由此证实ME对酒精诱导的急性肝损伤具有保肝作用。 其作用机制可能与调节抗氧化和抗炎信号通路有关，部分通过调节Nrf-2和NF- κ B信号。
1.简介 由酗酒引起的酒精性肝病是慢性肝病的危险因素，在全球范围内导致大量死亡[ 1 ]. 大多数患者最初被诊断为酒精性脂肪肝（AFL），然后进一步发展为酒精性肝炎（ASH）。 慢性ASH最终会导致肝纤维化和肝硬化，在某些情况下甚至会导致急性肝衰竭（AHF）或死亡[ 2 ].
酒精滥用造成的大部分损害发生在肝脏。 大约90%的酒精在肝脏中被氧化，只有一小部分被酒精脱氢酶（ADH）和乙醛脱氢酶（ALDH）代谢，形成二氧化碳和水用于排泄[ 三 ]. 大量酒精可诱导肝脏中细胞色素P450酶的高活性，导致活性氧（ROS）过度积累，导致脂质过氧化[ 4 ]. 乙醛是酒精代谢的中间产物，通过黄嘌呤氧化酶转化为超氧物和氧自由基，破坏肝细胞的结构和功能[ 5 ， 6 ]. 在此过程中，氧化应激相关的肝脏损伤迅速发生。
核因子-红细胞体2相关因子-2（Nrf-2）是关键的细胞内抗氧化因子之一，调节氧化应激[ 7 ]. 核因子-kappa B（NF- κ B） 是一种转录因子，是炎症、免疫和细胞生存的重要调节器[ 8 ]. 在ROS介导的氧化应激过程中，活化的NF- κ B负责调节炎症细胞募集的各种基因的转录，触发一系列炎症反应[ 9 ]. 促进Nrf-2信号的激活可以调节体内的氧化还原平衡，抑制NF的激活- κ B信号转导和减轻氧化应激介导的炎症反应。
纳曲酮是一种阿片受体拮抗剂，常用于酒精滥用治疗，已被证明可减少纤维化动物模型的肝细胞损伤[ 10 ]; 然而，据报道，副作用包括焦虑、易怒、腹痛、恶心和/或呕吐[ 11 ]. 一些食用蘑菇被证明具有清除自由基和调节抗炎作用的能力，使其成为预防和/或治疗酒精性肝病的候选药物[ 12 ]. 羊肚菌 含有多种营养素，具有多种药理活性，包括抗氧化、抗炎和抗肿瘤作用[ 13 ， 14 ]. 一种从大豆子实体中分离得到的杂多糖 埃斯库伦塔支原体 能有效清除羟基和超氧自由基[ 15 ]通过阻断NF的激活发挥抗炎作用- κ B信号[ 16 ]. 同时，发酵液中的总黄酮是由 埃斯库伦塔支原体 和 鸡腿菇 通过丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路对脂多糖刺激的RAW264.7巨噬细胞显示抗炎作用[ 17 ]. 虽然培养物的保肝作用 埃斯库伦塔支原体 抗CCl菌丝体 4 以及酒精诱导的慢性肝毒性[ 18 ]，其子实体产生的保护作用以及对酒精诱导的急性肝损伤的可能作用机制之前尚未被研究。
在本研究中，我们系统地分析了 埃斯库伦塔支原体 并验证其对酒精诱导急性肝损伤小鼠的肝保护作用，然后研究与Nrf-2和NF激活相关的可能机制- κ B信号通路。
2.材料和方法 2.1. 埃斯库伦塔支原体 成分分析 这个 埃斯库伦塔支原体 2017年4月至6月，在中国云南大理采集果体。 ME在60°C下干燥，用粉碎机粉碎，通过60目筛子筛分，并储存在干燥器中以供后续实验。
2.1.1. 主要成分分析 采用苯酚-硫酸法测定了ME的主要成分，包括总糖、还原糖、蛋白质、总灰分、粗脂肪、总黄酮、总三萜、甘露醇和粗纤维[ 19 ]，3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原糖测定[ 20 ]，凯氏定氮法[ 21 ]，燃烧方法[ 22 ]、索氏提取[ 23 ]、紫外分光光度法检测、香草醛乙酸和高氯酸比色法[ 24 ]，高效液相色谱法（HPLC）[ 25 ]和酸碱处理。
2.1.2. 脂肪酸分析 将5%KOH-甲醇溶液添加到ME粉末中，置于60°C水浴中30 min，然后在60°C下与14%BF3-甲醇溶液混合3 min。然后将样品与己烷混合，并使用气相色谱-质谱仪分析脂肪酸水平（QP2010，日本岛津）。
2.1.3. 氨基酸分析 ME用6水解 摩尔/升HCl 用于22 h.真空干燥后，将样品溶解在1中 pH值为mL 2.2缓冲器。 使用自动氨基酸分析仪（日本日立L-8900）定量氨基酸含量。
2.1.4. 矿物分析 在110°C的温度和30的大气压下，用硝酸氢对ME进行预处理 30英镑的atm min.用电感耦合等离子体发射光谱法检测汞（Hg）、铅（Pb）、硒（Se）、砷（As）、镉（Cd）、锌（Zn）、铁（Fe）、锰（Mn）、铬（Cr）、钙（Ca）、铜（Cu）、钠（Na）和钾（K）的水平[ 26 ].
2.2. 动物模型和治疗 60只健康雄性C57BL/6小鼠（8周龄，18-22 g） （SCXK（LIAO）2015-0001）购自辽宁昌盛生物科技有限公司（中国辽宁）。 动物护理和实验方案由吉林大学动物伦理委员会批准（20170106）。 实验前，在温度为 具有 湿度和a 12 h光-暗循环和 随意 获得水和食物。
根据先前的研究，改进了建立酒精诱导急性肝损伤小鼠模型的方法[ 27 ， 28 ]. 将小鼠随机分为六组( /组）。 10只对照小鼠每天两次灌胃0.9%生理盐水。 另外50只小鼠灌胃酒精，剂量为13 g/kg（中国北京顺鑫农业有限公司），每天09:00，连续14天。 同一天，16:00，只接受酒精治疗的小鼠（模型组）被灌胃生理盐水，剂量为0.1 毫升/10 g.阳性对照小鼠服用水飞蓟宾（Sil），这是一种临床使用的肝脏保护剂，可以减轻酒精性肝病患者的氧化应激，并防止脂质过氧化[ 29 ]，灌胃给药60 mg/kg（天津天士力桑茨制药有限公司，中国）。 ME-处理的小鼠口服200剂量的ME 毫克/千克，400 mg/kg或800 mg/kg。 使用超细研磨机（XDW-6A，中国济南大塑微机械有限公司）将ME粉碎，并悬浮在生理盐水中。 给药前，将混合物摇匀。 在实验期间，每天对小鼠称重。 最后一次给药后，所有小鼠均禁食一晚，并从每只小鼠的尾静脉采集血样。 然后用一氧化碳对所有小鼠实施安乐死 2 吸入，取下肝脏、肾脏和脾脏进行进一步分析。
2.3. 生化参数测定 使用手持式均质机（中国北京利奥帕德科学仪器有限公司）将收集到的实验小鼠的肝脏和脾脏样品在冰上生理盐水中均质，然后在3500℃下离心取上清液 转速持续10分钟。 γ-谷氨酰转移酶（GGT）（MM-43976M1）、8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）（MM-0221M1）（江苏飞亚生物科技有限公司，中国江苏）、天冬氨酸转氨酶（AST）（CK-E90386M）、丙氨酸转氨酶， 血清和肝脏中的白细胞介素-7（IL-7）（CK-E20125M）、纤溶酶原激活物抑制剂1型（PAI-1）（CKE-93562M）和视黄醇结合蛋白4（RBP4）（CK-E20170M）； 血清、肝脏和脾脏中活性氧（ROS）（CK-E91516M）、丙二醛（MDA）（CK_E20347M）、一氧化氮（NO）（CK/E20293M）、超氧化物歧化酶（SOD）（CK-E20348M）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）（CKE-92669M）和过氧化氢酶（CAT）（CK-E92636M）的水平； 并根据制造商的说明，使用酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒检测肝脏中高密度脂蛋白（HDL）（CK-E91912M）、总胆固醇（TC）（CK-E91839M）和甘油三酯（TG）（CK-E91733）（上海源业生物技术有限公司，中国上海）的水平。
2.4. 组织病理学分析 肝脏和肾脏组织样本固定在10%( ) 福尔马林缓冲液，石蜡包埋。 石蜡切片的厚度为4 μ m至6 μ m、 每个切片用苏木精和伊红（H&E）染色进行组织学评价。 病理切片在光学显微镜下观察（日本奥林巴斯）并拍照。
2.5. Western Blot分析 在放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液（Sigma-Aldrich，美国）中对从每只小鼠采集的肝组织样品进行均质化，该缓冲液含有2%苯甲烷磺酰氟（PMSF）（Sigma-Aldrich，美国）和1%蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrick，美国）。 匀浆中的蛋白质浓度是使用双钦酸（BCA）蛋白质检测试剂盒（德国默克米利波）测定的。 40 μ g蛋白质在12%聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离并转移至0.45 μ m聚偏氟乙烯（PVDF）膜（德国米利波）。 用5%牛血清白蛋白（BSA）封闭溶液（美国西格玛）在4°C下封闭膜4 h.将堵塞的膜与一级抗体以1的稀释度孵育 : 1000抗核因子κB激酶磷（P-）抑制剂 α / β （IKK公司 α / β ，ab195907），总计-（T-）IKK α / β （ab178870），核因子κB激酶的P抑制剂 α （一） κ B α )（ab12135），T-I κ B α （ab32518），P-NF- κ B p65（ab86299），T-NF- κ B p65（ab7970）、锰超氧化物歧化酶2（SOD-2）（ab13533）、血红素氧化酶-1（HO-1）（ab137749）、血红素氧化酶-2（HO-2）（ab90492）、Nrf-2（ab137550）、kelch-like ECH-associated protein 1（Keap-1）（ab66620）、CAT（ab16731）（Abcam，Cambridge，USA）、SOD-1（bs-10216R）（Bioss，China）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（ABS16） （德国密理博）在4°C下过夜。 培养后，用含0.1%吐温20的1x TBS清洗膜五次，每次5分钟。 然后将膜与抗小鼠（IH-0031）和抗兔（IH-0011）（中国北京定国）辣根过氧化物酶结合二级抗体孵育，以检测4 h，温度为4°C。 使用Immobilon Western Chemiluminating HRP Substrate（WBKLS0500，Millipore，Germany）和凝胶成像系统（UVP，USA）对目标蛋白进行可视化。 使用ImageJ分析软件1.46版（马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院）对图像进行量化。
2.6. 统计分析 所有数据均表示为 平均值（S.E.M.）。 使用SPSS 23.0软件（IBM Corporation，Armonk，USA）通过单向方差分析和事后多重比较（Holm-Sidak检验）确定差异。 已声明统计显著性 值低于0.05。
3.结果 3.1. ME的组成 表 1 显示了ME的详细成分。它含有8.1%的总糖、2.8%的还原糖、34.8%的蛋白质、8.0%的总灰分、9.0%的粗脂肪、1.3%的总三萜、1.8%的甘露醇、0.4‰的粗纤维和0.5%的总黄酮。 检测到21种脂肪酸和17种氨基酸，其中天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸的含量高于其他氨基酸。 检测到13种矿物质，汞、铅、砷和镉的含量低于检测限。
3.2. ME对酒精性急性肝损伤小鼠的肝保护作用及其对脂质代谢的调节 ME强烈阻止了用酒精治疗的小鼠体重下降，但Sil没有阻止( ， 表 1秒 ). 单用ME治疗对健康小鼠的体重没有影响（图。 1S安 ).
酒精治疗可提高血清和肝组织AST、ALT和GGT水平，这些是损伤的重要指标，ME治疗可阻止这些升高( ， 表 2 ). Sil降低血清和肝脏中GGT的水平( ， 表 2 ). 仅ME对血清AST水平没有影响（图。 1S乙 )和ALT（图。 1秒C ).
在酒精代谢中，ALDH有助于将有害的乙醛转化为无害的乙酸[ 30 ]. ME和Sil均能防止急性酒精暴露小鼠血清和肝脏中ALDH水平的下降( ， 表 2 ). ME单独对ALDH的血清水平没有影响（图。 1秒D ).
ME和Sil可显著减轻急性酒精暴露小鼠肝细胞的松散排列，防止炎症细胞浸润和肝组织中脂肪滴的形成（图 1（a） ). 在肾脏中，ME和Sil治疗显著减轻了酒精引起的肾小球炎症浸润和肿胀（图 1（b） ).
脂质代谢，尤其是TG、TC和HDL的水平，可以作为衡量肝脏损伤程度的指标[ 31 ]. 酒精导致小鼠肝脏中TG和TC水平极高，HDL水平较低( ， 数字 1（c） – 1（e） ). 与只接受酒精治疗的小鼠相比，ME使TG和TC水平降低了51.9%( ， 图 1（c） )和>15%( ， 图 1（d） )分别将HDL水平提高了11.1%以上( ， 图 1（e） ). Sil仅能提高肝脏HDL水平( ， 图 1（e） )但不是TG或TC（图 1（c） 和 1（d） ).
3.3. ME对酒精性急性肝损伤小鼠的抗炎作用 与只接受酒精治疗的小鼠相比，ME阻止了血清和肝组织中IL-7、YKL 40和PAI-1水平的升高( ， 表 三 )并阻止肝脏中RBP4水平的降低( ， 表 三 )，但对血清中RBP4水平没有影响（表 三 ). Sil增加了肝脏中RBP4的水平，降低了IL-7、YKL 40和PAI-1的水平( ， 表 三 )，但仅降低酒精诱导急性肝损伤小鼠血清中YKL 40和PAI-1的水平( ， 表 三 ).
3.4. 抗氧化作用参与ME-介导的肝脏保护 氧化应激是由饮酒引起的肝病发展和进展的核心。 过多的ROS会氧化碳水化合物、蛋白质和DNA分子，导致肝细胞受损[ 32 ]. ME阻止了ROS、MDA、NO和8-OHdG水平的升高，并阻止了血清中SOD、GSH-Px和CAT水平的降低( ， 表 4 )，肝脏( ， 表 4 )和脾脏( ， 表 2秒 )酒精诱导的急性肝损伤小鼠。 然而，Sil未能影响酒精暴露小鼠血清和肝脏中ROS、MDA和NO的水平（表 4 ). 在脾脏中，Sil抑制了ROS和MDA的水平，提高了SOD和GSH-Px的水平( ， 表 2秒 ).
3.5. ME调节Nrf-2和NF的激活- κ 酒精处理小鼠肝脏中的B信号传导 在只饮酒小鼠的肝脏中发现Keap-1的高表达水平和Nrf-2及下游抗氧化应激因子的低表达水平( ， 图 2 ). 相比之下，ME给药强烈阻止了酒精治疗的这些反应，如Keap-1表达水平降低和Nrf-2、SOD-1、SOD-2、CAT、HO-1和HO-2水平升高所示( ， 图 2 ). Sil对Nrf-2及其下游蛋白的表达水平也有类似的影响( ， 图 2 )SOD-2除外（图 2 ).
NF公司- κ B、 一种参与炎症反应的关键调节因子，控制促炎基因的表达并调节炎症因子的产生，这些过程与酒精性肝病的发病机制密切相关[ 33 ]. 与酒精处理小鼠相比，Sil和ME显著降低下游因子IKK的磷酸化水平 α / β ，我 κ B α 和NF- κ 肝组织中的B p65( ， 图 三 ).
4.讨论 埃斯库伦塔支原体 果肉中含有21种脂肪酸、17种氨基酸和13种矿物质，表明该真菌具有营养价值。 所发现的微量重金属表明它是安全的。 如前所述，ME多糖和蛋白质可以提高抗氧化酶活性并改善免疫系统功能[ 14 ， 34 ]. 埃斯库伦塔 多糖通过抑制NF保护NR8383细胞免受PM2.5诱导的炎症- κ B激活[ 16 ]和总黄酮 埃斯库伦塔支原体 通过脂多糖刺激的RAW264.7巨噬细胞具有抗炎作用[ 17 ]. 这些营养成分为了解ME在酒精诱导急性肝损伤治疗中的保肝作用奠定了基础。 多效成分可能针对炎症和氧化应激信号通路中的许多关键分子。 这种“系统靶向性”可能会以自然的方式消除炎症和氧化应激，这意味着预期副作用更少。 此外，它有助于解释在我们大多数实验中观察到的ME的非剂量依赖性活性，这实际上是药物活性天然产物的一个共同特征[ 35 ].
过量饮酒后，AST和ALT经常升高。 当肝细胞受损时，细胞膜通透性增加，AST和ALT释放到血液中，血清转氨酶含量增加，而转氨酶是代谢过程中必不可少的酶[ 36 ]. 在肝病患者中可以检测到高水平的GGT，并被用作肝损伤的敏感指标[ 37 ]. 过量饮酒会导致乙醛在肝脏中过度积累，乙醛通过与体内各种大分子反应促进蛋白质加合物的形成，导致关键蛋白质的功能受损[ 38 ]. ALDH是酒精代谢的关键酶，它可以催化乙醛转化为乙酸，使其以CO的形式排出 2 和H 2 O（运行）[ 39 ]. ME强烈阻止酒精损伤小鼠AST、ALT、GGT和ALDH水平的病理变化。 然而，它没有影响AST/ALT的比率[ 40 ]为进一步实验提供了基础。
过度饮酒导致的肝脏炎症最终导致肝纤维化和肝功能受损[ 41 ]. 具有核转录因子激活蛋白序列的RBP4[ 42 ]，主要在肝脏合成，在急性肝病、慢性肝炎和肝硬化中可减少其表达[ 43 ]. 据报道，YKL-40在肝纤维化区域的表达增加[ 44 ]PAI-1抑制剂可以减轻这种纤维化[ 45 ]. 给药14天后，长期接触酒精的小鼠中这些细胞因子表达的病理改变被阻止，表明其具有保肝和抗炎作用。 此外，NF- κ B、 作为关键的炎症反应介质，调节先天性和适应性免疫功能的多个方面[ 46 ]. 通常，NF- κ B绑定到I κ B蛋白形成复合物，阻断NF的核定位信号- κ B.然而，当细胞受到酒精刺激时 κ B蛋白被活化的IKK磷酸化，导致NF的核定位信号- κ B暴露在外，允许运输至核[ 47 ]. 核NF- κ B介导IL-7受体的转录 α -亚单位（CD127）[ 48 ]和YKL-40[ 49 ]并调节PAI-1和RBP4的表达[ 42 ， 50 ].
氧化应激是酒精性肝病发病机制中最重要的过程之一[ 51 ]. 在本研究中，ME通过增加抗氧化酶的表达水平和降低酒精暴露小鼠的ROS、MDA和8-OHdG水平，发挥了强大的抗氧化作用。 ME可能通过调节脾脏（一个重要的免疫器官）中的氧化应激相关因子来调节免疫系统的各个方面。 活性氧是一种强氧化剂，可以破坏细胞大分子，如DNA、脂质和蛋白质，还可以促进脂质过氧化[ 52 ]. MDA是脂质过氧化的最终产物，可以反映脂质过氧化程度，从而反映肝细胞的损伤程度[ 53 ]. 8-OHdG是一种广泛接受的反映DNA氧化损伤的生物标记物[ 54 ]. 酒精会严重破坏体内的抗氧化防御酶活性。 正常情况下，SOD可以将超氧物转化为H 2 O（运行） 2 ，而CAT可以转换H 2 O（运行） 2 到H 2 O（运行）[ 55 ]. 当氧化还原失衡时，抗氧化酶的活性水平就会受损。 转录因子Nrf-2在编码抗氧化酶的一组防御基因的控制和表达中起主要作用[ 56 ]. 在正常情况下，Nrf-2在细胞质中以非活性形式与Keap-1结合。当暴露于酒精引起的氧化应激时，Nrf-1从Keap-1分离并转移到细胞核，在那里与抗氧化反应元件（ARE）相互作用。 随后，Nrf-2介导下游基因HO-1和SOD-1的表达，表明Nrf-2的细胞保护作用可能归因于这些酶的诱导[ 57 ]. 如前所述，氧化应激可通过激活NF上调炎症反应相关基因来启动或放大炎症反应- κ B信号[ 58 ]，Nrf-2可以直接抑制NF的表达- κ B类[ 59 ]. 我们目前的数据表明，ME对肝细胞的保护作用可能与其调节Nrf-2信号通路有关。
这项研究有一些局限性。 虽然我们发现ME可以调节Nrf-2和NF的激活- κ 实验模型中未使用B信号、特异性siRNA和/或相关抑制剂。 Nrf-2与NF的关系- κ B信号仍有待阐明。 如前所述，长期严重饮酒会增加肠道通透性，促进库普弗细胞的活化，进而引发肝脏炎症[ 60 ]，在本研究中未进行调查。 此外，尽管ME和Sil对小鼠急性酒精损伤具有相似的肝脏保护作用，但根据我们目前的数据，很难断定哪一种效果更好。 所有这些问题，尤其是ME-介导的肝脏保护机制对抗酒精诱导的损伤，将由我们小组进一步研究。
我们已成功证实ME在酒精诱导的急性肝损伤中的肝保护作用，并发现该作用可能与其通过调节Nrf-2和NF有利调节抗氧化抗炎信号通路的能力有关- κ B。
数据可用性 本文中包含了用于支持本研究结果的所有生成和分析数据。
利益冲突 提交人声明，不存在利益冲突。
作者的贡献 Bo Meng和Yuanzhu Zhang对这项工作做出了同等贡献。
致谢 本研究得到了国家重点研发计划（No.2018YFE0107800）、天津市科委项目（No.16JCQNJC09100和17PTSYJC0080）和天津科技大学食品营养与安全国家重点实验室开放项目（No。 SKLFNS-KF-1808）。
补充资料 综合分析见表1S、2S和图1S。 表1S：ME和Sil对实验小鼠体重的影响。 表2S：ME和Sil对酒精诱导急性肝损伤小鼠脾脏中与氧化应激相关的细胞因子的影响。 图1S:ME单独（800 mg/kg）对健康小鼠14天后的体重和血清生化指标无明显影响。 （A） 单靠ME无法影响健康小鼠的体重。 仅ME对健康小鼠的血清（B）AST、（C）ALT和（D）ALDH水平没有影响。 数据表示为 ( ) 采用单因素方差分析进行分析。 我： 埃斯库伦塔支原体 . ( 补充资料 )
