背景 上皮-间充质转化（EMT）被认为在慢性肾脏疾病的进展中起着重要作用，并有助于细胞外基质蛋白的沉积和与糖尿病肾病相关的肾纤维化。 方法 我们研究了Nrf2-HO-1信号转导对高糖（HG-）诱导的正常人肾小管上皮细胞（即HK2细胞）EMT的影响。 总之，我们用HG和莱菔硫烷（SFN）作为Nrf2激活剂处理HK2细胞。 EMT通过上皮标记物E-cadherin和间充质标记物如波形蛋白和纤维连接蛋白的表达活性进行评估。 结果 HK2细胞暴露于HG（60 mM）激活了波形蛋白和纤维连接蛋白的表达，但降低了E-cadherin。SFN处理HK2细胞可导致HG诱导的Nrf2-HO-1激活的EMT标记物的衰减。 我们发现SFN降低了HG诱导的活性氧（ROS）生成、丝氨酸473处PI3K/Akt的磷酸化以及丝氨酸/苏氨酸激酶糖原合成酶激酶-3的抑制磷酸化 β （克数-3 β )丝氨酸9。 随后，这些信号导致蜗牛1转录因子的下调和E-cadherin的恢复。 结论 本研究表明，Nrf2-HO-1信号通过调节ROS介导的PI3K/Akt/GSK-3在EMT调节中起抑制作用 β 活动，突出Nrf2-HO-1和GSK-3 β 作为糖尿病肾病的潜在治疗靶点。
1.简介 糖尿病肾病（DN）不仅是糖尿病患者最严重的并发症之一，也是慢性肾脏疾病的主要病因。 与DN相关的各种组织病理学病变统称为纤维化[ 1 ， 2 ]。 肾纤维化的特征是肾小球硬化、肾小管萎缩、肾小管周围毛细血管丧失、肾间质纤维化和慢性炎症。 不同的损伤，如高血糖、上皮损伤、持续炎症或进行性血管丢失，都可能导致纤维化[ 三 ].
了解肾纤维化对DN治疗的发展至关重要。 肾纤维化的发病机制是肾肌成纤维细胞的异常激活和生长以及细胞外基质蛋白的显著积累[ 1 ， 4 ， 5 ]。 肾纤维化似乎有特殊的途径，因为系膜细胞、促红细胞生成素生成细胞和肾小管上皮细胞仅存在于肾脏中，共同参与肾纤维化的形成。 在调节这种病理进展的系统中，EMT被认为在进行性肾纤维化和随后的肾功能恶化中发挥着关键作用[ 1 ， 2 ， 4 ， 6 – 8 ]。 EMT的特点是上皮细胞、优先是足细胞和近端小管细胞获得间充质特性，并被认为是DN中肌成纤维细胞的重要来源。 HO-1型[ 9 ， 10 ]，槽口[ 8 ， 11 ]、表皮生长因子受体[ 12 ]，转化生长因子- β 1（TGF- β ) [ 7 ， 13 ]，重量[ 5 ， 8 ]和刺猬[ 14 ]信号传导不仅是关键的调节分子，而且是治疗EMT和肾纤维化的靶点。
核因子红系衍生的2-相关因子2（Nrf2）是一种氧化还原敏感的转录因子，通过抗氧化反应元件（ARE）调节一些抗氧化酶的表达[ 15 ， 16 ]。 在氧化和亲电应激条件下，Nrf2和Kelch-like ECH-associated protein 1（Keap1）复合体通过修饰Keap1的半胱氨酸残基被破坏，导致细胞核内ARE应答基因的激活。 萝卜硫烷（1-异硫氰酸盐-4-甲基亚磺酰基丁烷（SFN））是Nrf2的激活剂，可诱导Keap1的半胱氨酸巯基发生修饰，从而使Nrf2发生核转移[ 17 ， 18 ]。 一些研究表明，SFN减轻了DM相关的心脏和内皮损伤[ 19 – 23 ]。 Shang等人[ 24 ]宣布SFN降低GSK-3 β 大鼠系膜细胞磷酸化及GSK-3改善实验性DN β /Fyn/Nrf2信号通路。 然而，SFN减弱高葡萄糖诱导的EMT的机制尚不清楚。
为了确定Nrf2-HO-1对糖尿病肾病的影响，在人肾近曲小管细胞中诱导EMT，并研究其在EMT调节中的生物学作用。
2.材料和方法 2.1. 细胞系与治疗 永生化人近端肾小管HK2细胞系（目录号22190）购自美国ATCC。 细胞保存在补充有10%胎牛血清和1%抗菌药物的培养基中（英国佩斯利Gibco）。 在细胞生长到亚融合状态后，同时用不同浓度的D-葡萄糖（5 毫米，60 mM）用于1、2、4、8、24、48和72 h、 分别是。 SFN治疗在0.63 μ 1米 D-葡萄糖刺激前h。
2.2. 抗体和Western Blot分析 初级抗体抗- β -catenin、抗Akt、抗磷酸化Akt和抗GSK-3 β ，抗磷-GSK-3 β 抗钉-1、抗栓和抗扭均来自Cell Signaling Technology（Beverly）。 抗E-钙粘蛋白、抗纤维连接蛋白和抗波形蛋白抗体购自Dako（Glostrup，丹麦）。 细胞在冰上用细胞裂解缓冲液裂解30 用SDS-PAGE在10%或12%聚丙烯酰胺凝胶上溶解细胞裂解液，并转移到PVDF膜上。 膜与适当的一级抗体孵育2 室温下h。
2.3. 增长研究 HK2细胞以 每孔置于6孔板中，培养三天，然后用不同浓度的葡萄糖处理。 然后对细胞进行胰蛋白酶化，用0.4%的台盼蓝（Invitrogen）染色，并每天使用血细胞仪（Fisher Scientific，Allentown，PA，USA）进行计数。
2.4. 细胞内活性氧的测量 使用ROS特异性荧光探针5-（和6-）氯甲基-2通过流式细胞术检测细胞内ROS水平 ， 7 - 二氯二氢荧光素二乙酸酯，乙酰酯（DCF-DA）（C6827）。 最后，使用Cytomics FC 500流式细胞仪（佛罗里达州迈阿密Beckman Coulter）和Cytomic RXP和MultiCycler软件进行细胞内ROS水平及其分析。
2.5. Ad-HO-1基因质粒载体的构建及转染 使用以下HO-1基因特异性引物集进行PCR：50-ATG AAT TCA TGG AGC GTC CGC AAC CCG-30（正义）和50-ATC TCG AGT CAC ATG GCA TAA AGC CC-30（反义）。 通过EcoRI和XhoI将HO-1基因插入pcDNA3载体（Invitrogen，CA，USA）中，并使用KpnI和EcoRI标记HA表位。简而言之，通过KpnI和XbaI酶从pcDNA3/HA-HO-1中切出HA标记的HO-1基因，并插入pAdTrack CMV中。 在HEK293细胞中扩增重组病毒质粒。 将HK2细胞置于6孔培养板中，在37°C下培养24小时，细胞密度约为 . 当细胞达到80%到90%的融合时，将腺病毒添加到每个孔中( ， 1.3 μ L Ad-HO-1）。
2.6. 统计分析 数据显示为 属于 除非另有说明，否则采用Student检验对两组进行比较。 概率值( ) 被认为具有统计学意义。
3.结果 3.1. HG对正常HK2细胞EMT的诱导作用 我们观察到HG（60 mM/L D-葡萄糖）处理。 HK2细胞在正常条件下呈圆形至卵圆形生长，用HG连续刺激3天后转化为具有肌纤维母细胞样表型的纺锤形细胞（图 1（a） ). 为了通过HG评估EMT的病理机制，我们观察了波形蛋白、E-钙粘蛋白和纤维连接蛋白的表达模式。 将HK2细胞暴露于HG 12~72小时可抑制特征性上皮粘附分子E-钙粘蛋白的蛋白表达，并增加肌成纤维细胞间充质标志物纤连蛋白和波形蛋白的表达（图 1（b） ). L-葡萄糖没有改变这些表型，这表明不是高渗压而是HG本身诱导了HK2细胞的EMT。 为了确定HG对HK2细胞的细胞活性（毒性），我们进行了台盼蓝排斥试验。 台盼蓝阳性细胞的数量随HG浓度的增加而增加（图 1（c） ).
3.2. PI3K/Akt和GSK-3的参与 β HG诱导HK2细胞EMT的信号传导 为了研究HG诱导EMT过程的分子机制，我们评估了HG处理不同时间后HK2细胞中PI3K/Akt信号的活性。 HG诱导PI3K/Akt快速活化和GSK-3磷酸化抑制增强 β HK2细胞中的活性（图 2（a） ). 接下来，我们试图调查GSK-3是否 β HG诱导的活性涉及EMT相关基因的调节过程，如蜗牛-1、蛞蝓、扭曲和 β -连环蛋白。 正如预期的那样，HG处理HK2细胞会增加蜗牛-1，但不会增加蛞蝓和扭曲，然后增加 β -catenin表达（图 2（b） ). HK2细胞暴露于HG降低了Nrf2的蛋白表达。 这些结果表明PI3K/Akt/GSK-3 β 信号传导诱导蜗牛-1和 β -转位到细胞核的连环蛋白活性与T细胞特异性转录因子（TCF）的转录因子相互作用，参与HG诱导的HK2细胞EMT过程。
3.3. Nrf2-HO-1对HG-诱导的HK2细胞EMT的抑制作用 我们假设Nrf2通路可能与HG诱导的EMT过程相关，因为我们之前观察到HO-1或HO-1激动剂减弱了人间皮细胞中HG诱导EMT。 HK2细胞基本表达HO-1，如图所示 3（a） 用Nrf2激活剂SFN和HO-1腺病毒处理HK2细胞，以阐明HG诱导的EMT信号通路的调节作用。 SFN增加Nrf2-HO-1蛋白水平，显著逆转HG诱导的PI3K/Akt蛋白活性和GSK-3磷酸化抑制 β 导致蜗牛-1和 β -catenin对HG的反应（图 3（a） ). 此外，通过Western blotting（图 3（b） ). 通过HO-1腺病毒转染的HO-1过度表达逆转了HG诱导的E-cadherin减少以及波形蛋白和纤维连接蛋白表达增加（图 3（c） ). HO-1腺病毒转染诱导的反应与SFN相似（图 3（d） ). 图 3（e） 表明SFN刺激HO-1的表达。 HO-1腺病毒转染的HK2细胞显示出保留良好的圆形至卵圆形细胞形态，但Mock-HO-1对照显示出纺锤形细胞。
3.4. 活性氧参与HG-诱导的HK2细胞EMT 为了研究ROS如何参与HG诱导的肾小管上皮细胞EMT过程，我们使用DCF测量了细胞内ROS水平。 当我们处理HK2细胞中的HG时，DCF敏感的细胞内ROS水平升高，伴随着HG诱导的PI3K/Akt激活。 但用Nrf2活化剂SFN预处理12小时可阻止活性氧的增加，从而降低PI3K/Akt/GSK-3的活化 β 信令和EMT（图 4（a） 和 4（b） ). 这一结果表明，ROS可能是HG诱导的EMT中重要的初始事件。
4.讨论 糖尿病肾病是糖尿病的一种长期并发症，目前是慢性肾脏疾病的最常见病因。 最近的研究表明，炎症过程与糖尿病肾病的发生和发展有关[ 25 ， 26 ]。 大量刺激，包括高血糖、糖基化终产物和活性氧诱导功能和结构改变[ 三 ]。 在这项研究中，我们证实HG增加了DCF敏感的细胞内ROS水平，随后激活了HK2细胞中的PI3K/Akt。 这一结果表明，ROS可能作为HG诱导的EMT和肾纤维化的初始事件而起重要作用。
EMT是一个涉及与糖尿病肾病相关的组织重塑的转分化过程，其中转录程序的转换可由多种信号通路诱导，包括受体酪氨酸激酶、TGF- β 和Wnt。 当HG在HK2细胞中被处理时，HG介导的ROS对PI3K和Akt的磷酸化激活诱导GSK-3的抑制性磷酸化 β 参与EMT相关信号通路。 这一结果表明ROS介导的PI3K/Akt/GSK-3 β 信号转导可能影响细胞功能障碍和肾小管细胞的二次适应。 因此，阻断活性氧产生源的有效药物可能有希望保护肾脏免受氧化损伤，并防止随后的肾纤维化进展。 氧化应激增加可能是由于伴随或不足的抗氧化途径中ROS的过度生成所致。 我们观察到用HG处理HK2细胞时，细胞内Nrf2减少。 Nrf2蛋白表达降低的原因可能是细胞溶质Nrf2的表达在HG浓度下降低，同时立方形细胞数量减少。 SFN处理的HK2细胞中胞浆Nrf2的表达增加，导致上皮表型的重新获得（数据未显示）。 用Nrf2激活剂处理也阻断了ROS的增加，从而降低了HG诱导的PI3K/Akt信号通路的激活和GSK-3的抑制性磷酸化 β Nrf2和血红素氧合酶-1（HO-1）是Nrf2的下游靶基因，在清除活性氧和减轻氧化应激中起着重要作用。 在证实Nrf2-HO-1信号转导对HG诱导的EMT的治疗作用的实验中，用HO-1过表达腺病毒载体预处理可逆转HG诱导E-cadherin的减少和波形蛋白或纤维连接蛋白表达的增加。 在这里，HO-1的异位过度表达显示了HG诱导的间充质表型细胞中细胞形态表型的改变，细胞间的接触松动。 结果表明，Nrf2-HO-1通路可减弱HG诱导的细胞内ROS并阻止EMT的进展。
GSK-3 β 是一种普遍表达的丝氨酸/苏氨酸激酶，是维持上皮结构所必需的[ 27 ]并且可以被包括Wnt在内的各种信号机制失活[ 28 ]，脂激酶PI3K/Akt[ 29 ]和细胞外信号调节激酶1/2（ERK-1/2）MAPK[ 30 ]路径。 此外，GSK-3 β 活性可通过氧化应激和过度细胞外物质沉积进行调节，并参与DN的发病机制[ 31 – 33 ]。 在我们的研究中，我们观察到GSK-3的调节 β SFN活性降低了EMT调节基因Snail-1和 β -HG诱导的HK2细胞EMT实验模型中catenin的表达。 因此，HG处理的HK2细胞显示E-cadherin表达恢复，间充质标志物表达降低。 该结果表明GSK-3 β / β -Nrf2-HO-1的连环蛋白调节活性将为肾纤维化和DN的治疗提供新的策略。
总之，本研究证明Nrf2-HO-1系统通过抑制PI3K/Akt/GSK-3对肾小管细胞发挥抗EMT作用 β 信号通路。 我们发现SFN降低HG诱导的细胞内ROS水平，抑制PI3K-Akt的磷酸化，然后调节GSK-3 β / β -catenin活动。 因此，这些信号活动导致蜗牛1转录因子的下调和E-cadherin的恢复。因此，我们的结果表明，Nrf2-HO-1信号的治疗靶向性可减轻糖尿病肾病相关肾纤维化的进展， PI3K/Akt/GSK-3表明 β 通路。
5.结论 5.1. 优势 综上所述，我们发现SFN治疗HK2细胞可以改善HG诱导的实验性糖尿病肾病中EMT标记物的变化，并增加HO-1的表达。 我们的研究结果表明，Nrf2-HO-1通过调节PI3K/Akt/GSK-3在HG诱导的EMT的调节中起着关键作用 β 活动，强调Nrf2-HO-1是糖尿病肾病的潜在治疗靶点。
5.2. 限制 需要进一步研究以阐明糖尿病肾病的信号机制。
缩写 电子病历： 上皮-间充质转化 公称直径： 糖尿病肾病 编号2： 核因子红细胞衍生2相关因子2 ROS公司： 活性氧物种 SFN： 萝卜硫烷 HO-1： 血红素加氧酶1 香港2: 人类肾脏2。
数据可用性 用于支持本研究结果的数据可根据要求从通讯作者处获得。
利益冲突 作者声明，他们没有相互竞争的利益。
作者的贡献 JH Shin分析了数据并准备了手稿。 KM Kim、JU Jeong、JM Shin和JH Shin收集了数据。 金建华和KT Bang审查并批准了最终手稿。
致谢 该研究于2015年得到大韩民国Eulji大学的资助。
