背景和目标积累的证据表明PPARγ在肝纤维化和肝星状细胞（HSC）活化的调节中起着独特的作用。本研究旨在调查PPAR的作用γ低氧诱导的肝纤维化及其可能机制。方法用于CCl4诱导的肝纤维化模型的大鼠每天暴露于缺氧8小时。用或不用PPAR治疗暴露于低氧环境的大鼠γ激动剂罗格列酮。8周后取肝切片进行HE和天狼星红染色。HSC暴露于有或无罗格列酮的缺氧环境中，并表达PPARγ以及两种纤维化标志物，α-采用免疫印迹和免疫荧光染色检测SMA和结蛋白。接下来，PPAR的级别γ,α-使用PI3K/AKT和cGMP激活剂或抑制剂检测SMA、结蛋白、PKG和cGMP活性。结果低氧促进肝纤维化和HSC活化的诱导和进展。同时，罗格列酮显著拮抗缺氧诱导的效应。sGC/cGMP/PKG信号转导促进PPAR的抑制作用γ关于缺氧诱导的HSC活化。此外，PI3K/AKT信号或PDE5阻断了PPAR的上述反应γ。结论.sGC/cGMP/PKG和PI3K/AKT信号作用于PPARγ协同减弱低氧诱导的HSC活化。
1.简介
纤维化是肝脏损伤的常见反应，其特征是产生和沉积细胞外基质（ECM）[1]. 过度纤维化是一系列肝脏疾病的特征，如慢性肝炎、酒精中毒引起的肝损伤和肝脏自身免疫性疾病[2]. 在这一病理过程中，肝星状细胞（HSC）是肝纤维化的主要执行者。HSC激活增加胶原蛋白和其他ECM成分的表达和分泌。它还刺激肝脏微环境细胞，如巨噬细胞、内皮细胞和炎症细胞，从而以自分泌或旁分泌的方式促进纤维生成[三,4]. 因此，了解HSC活化的分子机制对肝纤维化的诊断和治疗至关重要。
过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）γ是一种基本的核受体，调节脂质代谢、胰岛素敏感性和脂肪沉积。它在肝脏生理代谢中起着极其重要的作用[5]. 然而，越来越多的研究表明PPARγ是HSC激活和表型改变的关键介体，从而维持HSC处于静止期[6,7]. 最近，氧化应激被认为与HSC活化和肝纤维化有关[8]. 大量出版物也报道了暴露于缺氧的HSC可以通过HIF1激活α及其下游靶基因或信号通路[9–11]. 基于这些证据，我们假设PPAR的影响γHSC是缺氧在肝纤维化形成中作用的机制。事实上，PPARγ已发现在几种疾病中受缺氧调节。Wang等人报道，缺氧通过HIF-1介导的PPAR抑制降低UCP2γ导致非小细胞肺癌化疗耐药[12]. Jiang等人发现缺氧抑制PKG-PPARγ大鼠远端肺动脉平滑肌细胞和远端肺动脉的轴[13]. 然而，尚不清楚这些细胞事件是否与肝纤维化的发病机制及其关键作用机制有关。因此，我们执行了体内和在体外实验来检验上述假设。
2.材料和方法
2.1. 动物和实验方案
本研究在35只雄性SD大鼠上进行，体重200-250 g来自上海SLAC实验动物有限公司（中国上海），被关在普通笼子里，位于22±2°C的动物室中，并保持14小时的光照/10小时的黑暗周期。将大鼠随机分为4组，如下：第一组()作为对照，保持在标准的常压室（FiO20.21). 第二组()将40%CCl4（CCl4和橄榄油的混合物）注入大鼠的标准常压室（FiO20.21). 第III组()在常压缺氧室（FiO）向大鼠注射40%CCl4混合物20.07）每天缺氧8小时。第四组()以与第三组相同的方式建模（40%四氯化碳混合物注射加缺氧暴露），但用PPAR治疗γ激动剂罗格列酮（RSG）。RSG被添加到液体饮食中，每日摄入10 mg/kg体重，用于喂食。
8周后处死所有大鼠，从腹主动脉采集血液。分离血清并将其储存在−80°C下，以测量透明质酸（HA）、层粘连蛋白（LN）、III型前胶原N末端肽（PIIINP）和IV型胶原（CIV）。然后，立即切除肝脏。肝脏的一部分用于提取蛋白质进行蛋白质印迹。将肝脏的另一部分固定在4%多聚甲醛中，包埋在石蜡中，并切成切片（5 μm厚）用于HE和天狼星红染色。动物护理和程序由中国江苏大学医学伦理委员会批准。
2.2. 试剂
8-Br-cGMP、Rp-8-Br-PET-cGMPS、LY294002、罗格列酮和扎普司特购自Sigma-Aldrich。740 Y-P由研发系统提供。将LY294002、罗格列酮和扎普司特溶解在二甲基亚砜中（最终浓度0.2%）。其他药物使用蒸馏水制备。
2.3. 血清参数检查
根据制造商的说明，使用ELISA试剂盒（中国武汉Elabscience）检测HA、LN、PIIINP和CIV的血清水平。
2.4. HE和天狼星红色染色
将组织切片固定在4%多聚甲醛中，用石蜡包埋，并使用标准技术进行切片。切片进行HE和天狼星红染色。根据改良的Scheuer纤维化评分系统，每个样本均由两名病理学家独立评估并评分，以进行盲法评估[14,15]. 纤维化阶段评分分为五个阶段（0-4）：0：无，1：3区窦周纤维化；2：3区窦周纤维化加门脉纤维化；3：窦周纤维化和门脉纤维化，加上桥接性纤维化；肝硬化。
2.5. 细胞培养
大鼠HSC-T6细胞系是柯爱武博士（中国复旦大学中山医院肝癌研究所）赠送的礼物。细胞保存在含有10%胎牛血清（美国Hyclone）、青霉素（100 IU/ml）和链霉素（100 IU/ml）（美国Amresco）。细胞在37°C的5%CO2增湿环境中培养。
2.6. 细胞总cGMP的测定
收集HSC-T6细胞的上清液，并将其储存在−80°C下。根据制造商的建议，使用竞争性ELISA分析（美国开曼化学公司）测量cGMP的总水平。
2.7. PKG活性的测量
根据ELISA试剂盒（CycLex，Japan）的方案测量每个样品中PKG的活性，包括PKG-I和PKG-II，其中磷酸化抗体可以鉴定PKG底物上苏氨酸（Thr 68/119）残基的磷酸化。
2.8. 免疫荧光染色
如前所述进行免疫荧光染色分析[15]. 细胞与抗α-SMA（ab5694）和结蛋白（ab15200）（1 : 50稀释度；Abcam，美国）。用PBS（5）清洗细胞三次 min），然后在黑暗中孵育1 室温下用Alexa Fluor 488和550结合的山羊抗鼠二级抗体（1 : 200稀释；ab150157和ab150083，Abcam，美国）。细胞核用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色（Sigma-Aldrich，美国）。使用蔡司LSM 510 META共焦显微镜，使用20x/0.5获得图像 w和40x/1.2 w目标。
2.9. 蛋白质印迹分析
Western blot分析如我们之前的报告所述[16]. 本研究中使用的主要抗体如下：PPARγ（ab209350）（1 : 1,500),α-SMA（ab5694）、结蛋白（ab15200）、AKT（ab8805）、磷酸-AKT（ab81283）、PI3K p110β（ab151549），PDE5（ab14672）（1 : 1,000; 美国ABcam）和PI3K p110α(#4249) (1 : 1,200; 细胞信号技术，美国）。GAPDH的一级抗体稀释为1 : 1000–1500（美国圣克鲁斯）。次级HRP结合抗体在1 : 2,500. 使用ECL系统（Beyotime Biotechnology，中国）检测印迹。使用LI-COR Odyssey扫描仪（LICOR）分析印迹上的条带强度。
2.10. 统计分析
所有统计分析均使用SPSS 17.0软件进行。数据表示为平均值±SE，使用学生的t吨-测试和方差分析。数据为平均值±标准偏差。Western blot、ELISA、PKG活性和cGMP分析采用单向方差分析。这个采用Fisher精确检验分析各组间纤维化程度的差异。的值被认为具有统计学意义。
3.结果
3.1. PPAR低表达γ与缺氧诱导的肝纤维化相关
与之前的研究一致，我们发现缺氧可以促进肝纤维化的进展（表1和2和图1). 同时，PPARγ激动剂罗格列酮（RSG）显著拮抗低氧诱导的肝纤维化发展。低氧导致血清标志物（HA、LN、PIIINP和C IV）增加，但纤维化组织学分级也升高。然而，PPAR的激活γ改善了这种效果（表1和2和图1). 检查PPAR的可能相关性γPPAR表达水平与肝纤维化的相关性γ和其他两种纤维化标志物，α-测量SMA和结蛋白。如图所示1（b）-1（c）、PPARγ与α-SMA和结蛋白表达(第页= −0.78613,P（P）<0.001，以及第页= −0.83517,P（P）=0.017）。这些结果表明PPARγ与低氧诱导的肝纤维化有关。
3.2、。PPAR（购电协议）γ对抗缺氧应激引起的HSC活化
众所周知，HSC是诱导肝纤维化的重要效应器。以前，我们证明缺氧通过调节PPAR促进肝纤维化γ体外试验为了阐明HSC是否是这一过程的调节剂，HSC暴露于低氧应激下，不同时间氧浓度从21%降至7%。与对照组相比，PPARγ蛋白水平显著降低，呈时间依赖性，同时两个纤维化标志物的表达明显增加，α-SMA和结蛋白（图2（a）). 同时，根据我们的观察，缺氧暴露6小时后，这一趋势达到了平台。这些结果表明，缺氧应激的早期可能导致HSC活化。
然后α-在存在或不存在PPAR的情况下，对缺氧暴露的HSC中的SMA和结蛋白进行分析γ激动剂，罗格列酮（RSG，50 nM），通过免疫印迹和免疫荧光法。正如预期的那样，单纯接触HSC的低氧暴露导致显著的PPARγ下调和α-SMA和结蛋白升高，而缺氧和RSG联合治疗逆转了这些影响（图2（b）)，表示PPARγ对抗缺氧应激引起的HSC活化。
3.3、。PI3K/AKT信号参与低氧诱导PPARγ低表达
PI3K/AKT信号通路是细胞调节氧化应激效应并诱导HSC活化和增殖依赖于HIF-1的重要机制α对缺氧的反应。在这里，我们分析了PI3K/AKT信号是否与PPAR相关γ抑制低氧诱导的HSC激活。结果表明，当AKT磷酸化显著增强时，低氧诱导的HSC激活（图3（c）). LY294002对PI3K的抑制作用（20 μM） 明确反对上述激活。同时，PPARγ表情也恢复了（图3（c）和3（d）). 类似地，用740 Y-P（25 μ在RSG（50）存在的情况下暴露于缺氧的HSC（g/ml） nM）显著降低PPARγ表达，同时α-SMA和desmin（图3（a）和3（b）). 这些结果表明PI3K/AKT信号传导阻断了PPAR的抑制作用γ低氧诱导HSC活化。
3.4. sGC/cGMP/PKG和PI3K/AKT信号的相互作用调节PPARγ减弱缺氧诱导的HSC激活
根据以前的研究，sGC/cGMP/PKG有助于肝硬化的治疗。此外，该信号还调节缺氧应激诱导的各种细胞事件。为了研究sGC/cGMP/PKG信号在PPAR和PI3K/AKT信号调节的HSC低氧反应中的潜在作用，将HSC孵育90小时 有或没有8-Br-cGMP（1）的缺氧条件下min mM）被广泛用作sGC/cGMP/PKG激动剂，在Rp-8-Br-cGMP存在或不存在的情况下（20 μM） sGC/cGMP/PKG拮抗剂。我们发现，缺氧条件下共处理的8-Br-cGMP显示PI3K p110蛋白水平显著降低α，PI3K p110β与缺氧组相比，磷酸化AKT。由于这种下降，PPARγ表达增加。此外，正如我们推测的那样，α-SMA和结蛋白水平也降低。8-Br-cGMP诱导的效应被Rp-8-Br-cGM的加入所阻断（图4（a）). 这些结果表明sGC/cGMP/PKG直接抑制PI3K/AKT信号传导，另一方面增加PPARγ，最终影响低氧诱导的HSC激活。
为了进一步证实上述发现，我们使用5型磷酸二酯酶（PDE5）的特异性抑制剂扎普司特抑制cGMP水解，并观察其对PPAR的后续影响γPI3K/AKT信号转导对低氧诱导的HSC激活的影响。结果表明，缺氧环境显著提高了HSC中cGMP和PKG的活性（图4（c）-4（d）). PDE5抑制恢复了cGMP和PKG活性（图4（c）-4（d）)随后PPAR增加γ表达和抑制HSC激活（表达减少α-SMA和结蛋白）（图4（b）). 这些数据表明sGC/cGMP/PKG和PI3K/AKT信号协同作用于PPARγ后者抑制低氧诱导的HSC激活。
4.讨论
PPAR（购电协议）γ，作为转录因子，控制基因转录和细胞分化在体外和体内并在抑制HSC活化和维持活化HSC向静止细胞的形态和生化逆转方面发挥关键作用[17–19]. 目前的证据表明，缺氧是肝纤维化和HSC活化发展的常见刺激因素[20,21]. 事实上，缺氧能够连接多种信号。它不仅影响HSC的激活，还作用于多种其他细胞，如正弦细胞、肝细胞、脂肪细胞和肝旁巨噬细胞（Kuppfer细胞）[1,22–24]. 其次，低氧诱导的肝纤维化结构改变加剧了缺氧环境，从而加速了肝纤维化的病理进展。
然而，对于PPAR的影响知之甚少γ低氧应激下HSC活化与肝纤维化。阐明HSC活化与PPAR之间的相互关系和分子机制γ在缺氧环境中，我们设计了两个实验在体外和体内为此，通过将CCl4模型大鼠暴露于缺氧环境中，我们验证了缺氧应激促进肝纤维化的假设。值得注意的是，PPAR的表达γ被缺氧抑制。此外，两种纤维化标志物的表达，α-SMA和结蛋白显著增加。进一步探讨PPAR的影响γ缺氧时，RSG，PPARγ低氧暴露组加入激动剂。正如预期的那样，随着PPAR的增加，缺氧诱导的肝纤维化得到改善γ级别。HSC实验也证实了这些结果体内。我们的研究结果证实PPARγ通过抑制HSC活化对抗缺氧应激引起的肝纤维化。
然而，PPAR的潜在机制γ介导的低氧诱导HSC活化有待进一步研究。最近的研究表明AKT信号和PPARγ具有相互抑制作用[25–27]但这一理论仍有争议。Kilter等人建议PPARγ在缺氧/复氧过程中促进心肌细胞AKT磷酸化[28]. 然而，另一项独立研究发现，PPARγ通过抑制PI3K/AKT信号抑制内皮细胞迁移[29]. 我们目前的研究表明，PI3K/AKT信号传导阻断了PPAR的抑制作用γ低氧诱导的HSC激活。接下来，使用cGMP类似物和拮抗剂，结果表明sGC/cGMP/PKG直接抑制PI3K/AKT信号传导，增加PPARγ表达，最终影响低氧诱导的HSC激活。相反，抑制PDE5和抵抗cGMP水解可恢复cGMP和PKG活性，随后PPAR增加γ表达和抑制HSC激活。
鉴于缺氧和胰岛素抵抗在肝纤维化中的协同作用，先前的研究表明缺氧导致PPAR降低γ表达，然后抑制IR转录，导致IGF-1和后续信号的阻断。TZD恢复PPAR时γ，IR激活直接或间接发生，启动IGF-1/PI3K信号[30]. 然而，我们发现缺氧环境诱导了PI3K信号，导致PPAR降低γ表达，表明在这个过程中存在复杂的负反馈机制。
基于这些数据，我们推测sGC/cGMP对PKG激活起作用，激活PPARγ，减弱低氧诱导的HSC激活和肝纤维化。另一方面，缺氧通过诱导PI3K/AKT信号传导或激活PDE5至cGMP水解直接或间接抑制PPAR的表达，这最终有利于低氧诱导的HSC活化。我们的发现可能为肝脏纤维化的机制提供新的见解。确定在缺氧和PPAR同时存在的组织中是否存在相同的信号是很有意思的γ存在于肥胖的脂肪组织中[31,32]. 有必要进行新的研究，以探讨新的治疗工具的潜力，从而抵消导致纤维化的病理生理过程。
披露
张庆慧和向世浩是第一作者。
利益冲突
提交人声明，不存在利益冲突。
作者的贡献
张庆辉构思并设计了实验；张庆辉和向世浩进行了实验；刘庆谦和陶谷分析了数据；姚永良贡献了试剂和材料；张庆辉写了手稿；陆晓杰支持修订稿中的补充测试，并为修订稿提供语言服务。张清辉和项世豪是同等的贡献者。
鸣谢
这项工作得到了上海市科学技术委员会基金（批准号：16411972700）的支持。
