摘要

目标。探讨丹参酮ⅡA（TanIIA）对食管癌细胞的作用机制。方法。用不同浓度的TanIIA处理两种人食管癌细胞系（EC-1细胞和ECa-109细胞）。用CCK-8测定细胞增殖，计算克隆形成效率，测定细胞周期和凋亡，用Western blotting测定细胞周期及凋亡相关基因表达的变化。结果。CCK-8和集落形成试验表明，TanIIA抑制人食管癌细胞的细胞增殖（IC50低于1 μ（g/mL） h.Hoechst 33258和流式细胞术显示，TanIIA诱导两种食管癌细胞系的凋亡。流式细胞术显示TanIIA使细胞周期阻滞在S期和G2/M期。Western blotting分析表明，经1.3处理后，Akt1及其磷酸化被抑制，Bax/Bcl-2比值增加，caspase-9和caspase-3均被激活 μ48℃下的TanIIA（g/mL） h.同时，p53和p21蛋白水平升高，而细胞周期蛋白B1、CDC2和CDC2磷酸化受到抑制。结论。TanIIA抑制食管癌细胞的生长，并以时间依赖和浓度依赖的方式诱导凋亡，可能是通过影响细胞周期和凋亡相关的信号通路。

1.简介

食管癌是世界上第六大癌症相关死亡原因[1]. 中国中北部地区是中国食管癌发病率最高的地区；90%的病例是鳞状细胞癌[2]. 尽管食管癌的治疗（手术、化疗和/或放射治疗）发展迅速，但晚期癌症患者的预后并未改善。同时，副作用和多药耐药性限制了化疗药物和放射治疗的剂量[三,4]. 因此，确定一种副作用较少的食管癌治疗方法将有助于临床应用或作为辅助试剂。

丹参酮IIA（TanIIA，C₁₉H（H）₁₈O（运行）_三; 图1)是一种中药，从丹参邦格（丹参），用于临床治疗心血管疾病。TanIIA可以保护心肌细胞免受氧化应激和炎症，广泛用于冠心病、心绞痛和其他心血管疾病[5,6]. 近年来，越来越多的研究关注TanIIA的抗癌作用。目前的证据表明，TanIIA是多种肿瘤细胞的抗癌药物，包括白血病、乳腺癌、胃癌和肝癌[7——9]. 虽然已在许多肿瘤细胞中观察到其抗癌作用，但TanIIA对食管癌的作用及其分子机制尚未见报道。因此，在本研究中，我们评估了TanIIA对食管癌细胞（EC-1和ECa-109细胞）的作用和分子机制在体外.

图1 

丹参酮IIA（TanIIA）的化学结构。

2.材料和方法

2.1. 化学品和试剂

TanIIA（纯度>98%，NM_20100205）购自浙江省药物管制研究所（中国浙江）。RPMI-1640、胎牛血清（FBS）、青霉素、胰酶和链霉素购自Hyclone（Logan，USA）。所有兔多克隆抗体和HRP结合二级抗体均购自美国加利福尼亚州Abcam。

2.2. 细胞系与培养

人食管癌细胞株EC-1和ECa-109由郑州大学第一附属医院慷慨提供。将细胞保存在含有10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640中的烧瓶中，100 μg/mL青霉素和100 μg/mL链霉素，37°C，5%CO增湿空气中₂.

2.3. 细胞增殖试验

5 × 10^三将EC-1和ECa-109细胞/孔接种在96个培养皿中24小时 用药前h。以不同浓度（0.3、0.6、1.3、2.5和5.0）添加丹参酮IIA μg/mL），每个浓度使用五个孔。丹参酮IIA治疗24、48和72天后 h、 10个 μ将L细胞计数试剂盒8（CCK-8）试剂（日本Dojindo实验室）添加到每个孔中，并在37°C下培养2.5 h.在450℃下测量吸光度 nm，使用分光光度计（Thermo，美国）。每个实验重复三次。

2.4. 菌落形成分析

3 × 10^三EC-1和ECa-109细胞/孔接种在6孔板中24小时 用药前h。添加不同浓度的丹参酮IIA（0.6和1.3 μg/mL），每个浓度使用三个孔。丹参酮IIA治疗48天后 h、 丢弃处理培养基，用1×PBS冲洗细胞，并与含有10%FBS的培养基交换。所有细胞在湿润CO中培养₂在37°C的环境下放置5天。倒出培养基，用1×PBS清洗每个孔两次。细胞用Giemsa（75%乙醇）染色10 对菌落（>50个细胞/菌落）进行计数。

2.5. 细胞凋亡检测

用0.6和1.3处理EC-1和ECa-109细胞后，用Hoechst 33258检测细胞凋亡 μ48克/毫升丹参酮IIA h、 分别是。48岁之后 h、 细胞用1×PBS洗涤三次，并用1 μ30克/毫升Hoechst 33258核染料（中国Beyotime） 37°C时最小值。通过荧光显微镜（Nikon Ti-S，Japan）获得图像。

2.6。流式细胞术分析

流式细胞术分析细胞在细胞周期和凋亡中的分布。简单地说，EC-1和ECa-109细胞用0.6和1.3处理 μ48克/毫升丹参酮IIA h.48小时后 培养h后，用胰酶消化法收集细胞，用1×PBS冰镇洗涤两次，悬浮在70%乙醇中，并在4°C下保存过夜。用Cycle Test Plus（Becton Dickinson，USA）和Annexin V-FITC/PI（Signalway Antibody，USA）对细胞进行染色。使用FCM（BD-FACSCalibur，美国）检测细胞周期分布和凋亡细胞，并使用cell Quest软件（Becton Dickinson，美国）进行分析。

2.7. Western印迹分析

用RIPA和PMSF缓冲液提取总蛋白，并使用双钦酸（BCA）蛋白检测试剂盒（中国贝尤泰姆）进行定量。总共40个 μg蛋白质进行12%SDS-PAGE电泳。SDS-PAGE后，将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脱脂奶粉（OXOID，UK）堵塞膜2 h，然后在4°C下与一级抗体孵育过夜。用1×TBST冲洗三次后，用二级抗体（HRP-共轭1 : 1000）在室温下2次 h.再次用1×TBST洗涤三次后，通过增强化学发光（ECL）检测特异性免疫反应带的强度。Akt1抗体（ab32505；1 : 500），磷酸-Akt1（pS473，ab81283；1 : 500），p53（ab32389；1 : 500），Bax（ab32505；1 : 1000），Bcl-2（ab32124；1 : 250），蛋白酶-9（ab32539；1 : 500），劈开的纸箱-9（ab133520；1 : 500），半胱氨酸蛋白酶-3（ab32351；1 : 500），caspase-3活性（ab32042；1 : 500），第21页（ab109520；1 : 500），CDC2（ab133327；1 : 1000），磷酸化CDC2（Py15，ab133463，1 : 1000），细胞周期蛋白B1（ab32053；1 : 1000）和β-微管蛋白（ab108342；1 : 1000）来自Abcam。

2.8. 统计分析

数据以平均数±标准差表示。为了检查各组之间的差异，使用SPSS 13软件（SPSS Inc.，芝加哥，伊利诺伊州，美国）进行了单向方差分析（ANOVA）。被认为表明存在统计学上的显著差异。

3.结果

3.1、。TanIIA阻断G2期至M期转化抑制食管癌细胞增殖

我们将EC-1和ECa-109细胞暴露于不同浓度（0.3、0.6、1.3、2.5和5.0） μ（g/mL）24小时的TanIIA h、 48个 h、 和72 h.细胞活力与时间和浓度有关()（图2（a）和2（c）). 根据CCK-8分析的结果，我们选择使用0.6和1.3 μ用于48个EC-1和ECa-109细胞的g/mL TanIIA h.菌落形成也以浓度依赖的方式减少（图2（b）和2（d）). TanIIA的IC50为48 h为0.75 μEC-1细胞中的g/mL和0.93 μECa-109细胞中分别为g/mL。我们使用流式细胞术评估TanIIA（0.6和1.3）治疗后的细胞周期状态 μ（g/mL）在EC-1和ECa-109细胞上 h.TanIIA诱导EC-1和ECa-109细胞系S和G2/M期细胞周期停滞，并增加S和G2-M期细胞数量。1.3对EC-1和ECa-109细胞的处理 μ48℃下的TanIIA（g/mL） h显著增加了S期细胞百分比[分别为（46.44±2.26）%和（40.84±6.41）%]，而对照组[分别为（28.55±0.34）%和（33.89±1.98）%；]（图5). G2/M期细胞百分比也较对照组增加[（14.11±1.56）%和（15.16±3.44）%][（9.51±2.03）%和[8.99±1.62）%；]. 用0.6处理EC-1和ECa-109细胞 μg/mL TanIIA在48 小时。

（a）

（b）

（c）

（d）

（a）
（b）
（c）
（d）

图2 

TanIIA以时间和浓度依赖的方式抑制食管癌细胞的生长。（a） EC-1细胞；（c） ECa-109细胞。细胞以5×10的速度接种到96周板上三细胞/孔，并以0.3、0.6、1.3、2.5和5.0的浓度进行处理 μ24、48小时用g/mL TanIIA h、 和72 h、 分别是。通过CCK-8分析测定细胞活力。结果由独立实验进行，一式三份。（b） EC-1细胞；（d） ECa-109细胞。细胞以3000个/孔的速度接种到6孔板上，并以0.6和1.3的浓度处理 μ48克/毫升TanIIA h，分别维持5天。用甲醇和乙酸固定菌落形成（3 : 1） 用Giemsa染色。数据表示平均值±SD*与控制相比。

3.2. TanIIA诱导食管癌细胞凋亡

采用两种方法评估TanIIA治疗后的细胞凋亡（0.6和1.3 μ（g/mL）EC-1和ECa-109细胞24小时 h和48 h： Hoechst和Annexin V-FITC/PI染色。在Hoechst 33258染色中，对照组EC-1和ECa-109细胞的核形态正常（图三). 变化相对较少24 用TanIIA治疗后h。相比之下，48 用TanIIA处理后h，EC-1和ECa-109细胞均观察到显著的核浓缩和形态学变化，如染色质浓缩和断裂。在FACS分析的Annexin V-FITC/PI双重染色中，Annexin-V-FITC-PI双重阳性细胞增加48 以浓度依赖的方式用TanIIA处理后h（图4). 1.3处理EC-1和ECa-109细胞的凋亡率 μg/mL的TanIIA分别为（40.21±2.64）%和（60.62±3.81）%，与对照组相比显著升高[分别为（5.68±0.42）%、（5.08±1.06）%]()。

图3 

TanIIA在24小时诱导食管癌细胞凋亡 h和48 h.（a），（b））EC-1细胞：（a）24 h；（b） 在48 h；（c），（d））ECa-109细胞：（c）24 h；（d） 在48 h.用荧光显微镜（×100）分析24和48小时Hoechst-33258染色的细胞的核形态 h，浓度为0.6和1.3 μg/mL TanIIA。白色箭头指出了凋亡的尸体。

图4 

48岁时TanIIA诱导食管癌细胞凋亡率 h.（a）EC-1细胞；（b） ECa-109细胞。48岁时通过Annexin V-FITC/PI染色分析细胞凋亡 h，浓度为0.6和1.3 μg/mL TanIIA。数据表示平均值±SD*与控制相比。

图5 

TanIIA治疗食管癌细胞的细胞周期分析。（a） EC-1细胞；（b） ECa-109细胞。用0.6和1.3浓度处理细胞 μ48克/毫升TanIIA h、 分别是。收获对照细胞和处理过的细胞，并进行流式细胞术分析。TanIIA处理后，S期和G2/M期细胞增多，G0/G1期细胞减少。数据表示平均值±SD*与控制相比。

3.3. TanIIA通过Akt1/Bax/Bcl-2/Caspase-9/Caspase-3途径诱导细胞凋亡，通过p53/p21/CDC2和Cyclin B1复合途径诱导S和G2/M细胞阻滞

我们使用Western blotting分析来了解TanIIA诱导凋亡和阻止S期和G2/M期细胞周期的机制。我们检测了48例TanIIA治疗后线粒体依赖的凋亡信号通路 在EC-1和ECa-109细胞系中，发现Akt1及其磷酸化蛋白的表达受到抑制，Bax/Bcl-2比值的表达增加（图6). Bax诱导线粒体损伤并激活caspase-9以形成全酶复合物（图6). Caspase-3被复合物激活，然后在凋亡中裂解许多关键蛋白（图6)。

图6 

TanIIA通过Akt/Bax/Bcl-2/caspase-9/caspase-3途径诱导食管癌细胞凋亡，并通过p53/p21/CDC2和cyclin B1复合途径阻滞S期和G2/M期细胞周期。制备总细胞裂解物并用BCA蛋白检测试剂盒进行定量。用Akt1、磷酸-Akt1、p53、Bax、Bcl-2、procaspase-9、cleaved-caspase-9、caspase-3、caspase-3 active、p21、CDC2、磷酸-CDC2、cyclin B1和β-微管蛋白抗体检测Western blot。通过三次独立实验显示了一个具有代表性的印迹。

TanIIA还增加了p53蛋白水平，这控制了细胞周期中p21的表达（图6). p21与DNA聚合酶辅助因子相互作用，降低CDC2的表达并抑制其磷酸化，防止CDC2/细胞周期蛋白B1复合物的形成（图6). 我们的结果表明，TanIIA治疗增加了p53和p21的蛋白表达，降低了CDC2、p-CDC2和细胞周期蛋白B1的表达。

4.讨论

丹参酮IIA（TanIIA）是一种被证实对心血管疾病具有抗氧化和抗炎作用的中药。据报道，它对许多癌细胞也有抑制作用在体外在本研究中，我们发现TanIIA以时间依赖和浓度依赖的方式抑制EC-1和ECa-109细胞中的细胞增殖和集落形成。TanIIA还通过线粒体依赖的凋亡信号通路诱导细胞凋亡，并将细胞周期阻滞在S期和G2/M期。

TanIIA对细胞周期分布的影响因肿瘤细胞类型而异，可能在肿瘤细胞中具有复杂的机制[10]. 在以前的研究中，有两种类型的细胞周期分布被报道。在一种类型中，TanIIA部分阻止了肿瘤细胞（包括胃癌细胞、乳腺癌细胞和人脑胶质瘤细胞）G0/G1期的细胞周期[11——14]. 在第二种类型中，肿瘤细胞，如人宫颈癌细胞和前列腺癌细胞，被阻滞在S期和/或G2/M期[15——17]. 在本研究中，我们发现TanIIA在48 h.Western blotting分析表明，TanIIA增加了p53蛋白和p21蛋白水平。同时，TanIIA下调了CDC2蛋白水平和细胞周期蛋白B1蛋白水平，并抑制了Py15处的CDC2磷酸化。p53作为一种肿瘤抑制因子，导致基因转录在多个位点触发细胞周期阻滞体内[18]. 此外，人类hepG2细胞和卵巢癌细胞中的p53阻止细胞周期进入G2/M期[19,20]. P21（命名为CDKN1A或WAF1）是一种重要的中间产物，p53通过该中间产物调节其作为细胞增殖抑制剂的作用，以应对DNA损伤；其过度表达在细胞周期阻滞中起着关键作用[21,22]. CDC2是Ser/Thr蛋白激酶家族的成员。CDC2激酶与细胞周期蛋白B1共同调节S期和G2/M期的细胞周期进程，形成CDC2-cyclin B1复合物，也称为成熟促进因子（MPF）[19,23,24]. MPF的激活是通过CDC2在酪氨酸15的去磷酸化来控制的[25]. TanIIA降低酪氨酸15处CDC2的磷酸化；然后p-CDC2（pY15）降低CDC2-cyclin B1复合物的表达，并将细胞周期阻滞在S期和G2/M期。需要进一步研究TanIIA下调CDC2水平的机制。基于我们目前的研究，我们假设了与p21表达的关系。因此，TanIIA可能通过p53/p21/CDC2和cyclin B1复合信号通路诱导EC-1和ECa-109细胞中的S和G2/M细胞阻滞（图7)。

图7 

TanIIA诱导细胞凋亡和阻滞细胞周期的分子机制模型。TanIIA通过线粒体损伤诱导caspase-9活性，抑制Akt及其磷酸化，进而增加Bax/Bcl比率水平的表达。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3被这种复合物激活并导致细胞凋亡。同时，TanIIA激活了p53，这反过来又增加了p21的表达。p21与一些DNA聚合酶辅助因子相互作用，降低CDC2的表达并抑制其磷酸化，从而阻止CDC2/cyclin B1复合物的形成。

在本研究中，根据Hoechst 33258染色和Annexin V-FITC/PI双重染色的结果，我们发现TanIIA在48 h以浓度依赖的方式。由于线粒体依赖性凋亡信号通路是一条经典的通路，我们通过Western blotting分析研究了Akt1、Bcl-2、Bax、caspase-9和caspase-3激活的表达水平。结果表明，TanIIA降低了Akt1的表达，并抑制了pS473处的Akt1磷酸化。Akt1是一种Ser/Thr蛋白激酶，在细胞凋亡、糖原合成和细胞生长中起关键作用。它通过磷酸化和钝化包括caspase-9在内的几个靶点来抑制凋亡[26]. 因此，TanIIA可能通过抑制Akt1的磷酸化来诱导细胞凋亡。

Akt1还抑制Bcl-2家族的凋亡蛋白，如Bax。Bcl-2是一种存在于线粒体外壁的抗凋亡蛋白。相反，Bax是一种促凋亡分子，通过结合Bcl-2和抑制Bcl-2的抗凋亡功能来促进凋亡[27——30]. TanIIA在食管癌细胞中的治疗增加了Bax蛋白水平的表达。它还降低了Bcl-2蛋白的表达水平，Bax/Bcl-2比率的变化表明TanIIA对细胞凋亡的影响。

据报道，大多数药物通过内在死亡信号途径诱导细胞凋亡。Bcl-2家族参与这一过程，caspase-9也在这一途径中起关键作用[31]. 在我们的研究中，蛋白酶-9和裂解半胱天冬酶-9的表达增加。caspase-9的激活被认为是caspase激活级联反应中最早的事件[32]. 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3是半胱氨酸蛋白酶的凋亡执行功能组的成员，可裂解凋亡中的许多关键蛋白[7,33,34]. 我们发现，TanIIA可以增加caspase-3的激活并诱导细胞凋亡。这表明TanIIA可能通过Akt/Bax/Bcl-2/caspase-9/caspase-3信号通路作用，诱导EC-1和ECa-109细胞凋亡（图7)。

总之，我们的结果表明，TanIIA可以抑制食管癌细胞的增殖，阻止细胞周期，并诱导其凋亡。TanIIA诱导的凋亡可能通过Akt1/Bax/Bcl-2/caspase-9/caspase-3途径，诱导的S和G2/M细胞阻滞可能通过p53/p21/CDC2和cyclin B1复合信号途径。因此，TanIIA可能是治疗食管癌的潜在抗癌药物。

利益冲突

作者声明，本论文的出版不存在利益冲突。

确认

本研究在浙江省胸肿瘤（肺和食管）诊疗技术重点实验室完成。