氢原子对蛋白质的性质和性质至关重要，因此氘化有可能影响蛋白质的功能。事实上，有报道称，一些氘化蛋白质显示出与蛋白质对应物不同的物理和化学性质。因此，在使用氘化蛋白时，研究活性位点周围的质子化状态非常重要。在这里，研究了氢同位素对绿色荧光蛋白（GFP）S65T/F99S/M153T/V163A变体的影响，其中脱质子化B型在pH 8.5时占主导地位。吸收光谱和荧光光谱的pH/pD依赖性表明，H中蛋白质化GFP的发色团质子化状态相同2O和D中的蛋白GFP2pH/pD为8.5时为O，而pK（K）一发色团的含量在D中变高2事实上，X射线晶体学分析显示，两个样品之间生色团的质子化状态没有明显变化，分辨率低于ngström。然而，氢OMIT图谱的详细比较表明，在发色团附近的His148的质子化状态在两个样品之间不同。这表明，在对蛋白质进行中子晶体学分析时，应仔细调整活性位点周围的质子化状态，使其与蛋白质的质子学状态相同。
