用自顶向下质谱和核磁共振波谱解析新霉素B与新霉素敏感核糖开关适配体的多个结合基序的复杂结合

摘要

由于结合化学计量学、多重结合基序、不同结合基序的不同占据率以及研究中RNA结构的变化之间的复杂相互作用，使得理解小分子与RNA的结合可能变得复杂。在这里，我们使用自然自顶向下质谱（MS）和核磁共振（NMR）光谱从实验上解决了这些因素，并更好地了解了新霉素B与酵母中设计的新霉素敏感核糖开关的40 nt适配体结构域之间的相互作用。从1:1、1:2和1:3 RNA-新霉素B复合物的碰撞活化解离数据中，除了我们之前的研究中发现的两个基序a和B外，还鉴定了核糖开关的第三个结合基序C，并为每个复合物的化学计量提供了不同结合基序的占据情况。根据MS和NMR数据，第四个新霉素B分子的结合没有特异性。有趣的是，适配体结构中的所有主要变化都可以由第一个新霉素B分子的结合引起，无论它是与基序A还是B结合，如化学计量解析质谱数据以及来自¹亚氨基质子区的核磁共振波谱。第二和第三新霉素B分子的特异性结合进一步稳定了核糖开关适配体，从而允许对新霉素B浓度的增加逐渐作出反应，这可能导致细胞调节机制的微调。

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介绍

核糖核酸（RNA）可以与包括核糖体在内的大分子组装体相互作用(1)和RNA聚合酶(2)以及自然发生的(三)和合成(4)小分子。近年来，随着研究人员越来越多地寻找靶向RNA的药物，RNA与小分子相互作用的研究越来越引起人们的兴趣(5–12). 其中氨基糖苷类是研究RNA识别的优秀模型(三,13)即使它们在中性pH下带正电荷，也会导致与带负电荷的RNA发生非特异性结合(14,15). 许多不同的实验技术，包括晶体学(16–18)，核磁共振波谱（NMR）(19–22)，等温滴定量热法（ITC）(23,24)和自然电喷雾电离（ESI）质谱（MS）(25–30)已用于RNA-氨基糖苷相互作用的研究。多配体结合(16,26,29,31–33)这些方法中的任何一种检测到的结果通常被解释为“非特定”结合的证据。这意味着RNAs通常为给定配体进化出一个单一的独特结合基序，并且1:1结合模型可用于描述RNA-与配体的相互作用。然而，最近的核磁共振(34,35)和MS(36,37)研究通过提供证据证明同一配体存在多个结合基序，而不是与RNA的“非特异性”结合，对这一观点提出了挑战。作为一个恰当的例子，我们最近鉴定了40nt适配体结构的两个不同的结合基序(36)合成的新霉素敏感核糖开关对新霉素B具有高配体特异性，并对酵母中的基因表达进行剂量依赖性调节(38,39). 然而，识别RNA的多个结合基序并确定其与小分子配体的相对占用率并非易事，到目前为止，我们只报告了对1:1复合物的自顶向下自然质谱数据的分析(36). 在这里，我们将我们的自上而下的自然质谱方法扩展到核糖开关适配体与多达四个新霉素B分子的复合物，并用来自¹亚氨基质子区的核磁共振波谱。

更具体地说，我们演示了天然ESI-MS数据如何与化学计量解析、低能碰撞活化解离（CAD）相结合(40)可用于定位带有两个（1:2）和三个（1:3）配体分子的RNA复合物的不同结合区域。结合区域是序列上彼此相邻的核苷酸延伸，配体分子与之结合。借助MC-fold|MC-Sym管道对游离RNA进行结构预测(41)然后，可以根据结合基序来解释不同的结合区域。结合基序是典型的两个不同结合区域的组合，这两个区域在序列上相距遥远，但在空间上足够近，新霉素B分子可以结合到这两个区（方案1). 此外，我们还展示了如何使用质谱数据来推导新霉素B与每个化学计量比的不同结合基序的相对占用率。接下来，我们使用¹在亚胺质子区进行核磁共振波谱，以确认游离RNA的结构预测，并在滴定实验中跟踪新霉素B结合引起的RNA结构变化。最后，结合MS和NMR实验的证据，可以更清楚地了解有多少新霉素B分子与核糖开关适配体结合，在哪里结合，以何种占有率结合，以及这如何影响核糖开关的适配体结构。

材料和方法

核糖核酸2–5（表1)质谱实验通过固相合成制备，通过HPLC纯化，并使用离心浓缩器脱盐（Vivaspin 500，MWCO 3000，Sartorius AG，德国）(42).¹⁵N-标记RNA2NMR实验的制备方法相同，但使用内部合成[1,3-¹⁵N个₂]尿苷和[1-¹⁵N] 鸟苷磷酰胺(43)在第4、7、23和32（[1-¹⁵N] G4，[1,3-¹⁵N个₂]U7，[1-¹⁵N] G23和[1,3-¹⁵N个₂]U32）。使用Implen纳米光度计（德国Implen）在260nm处通过紫外线吸收测定RNA浓度。在MS或NMR实验之前，将RNA溶液加热至90°C 2分钟，然后在冰上快速冷却。新霉素B的硫酸盐、哌啶、哌嗪、亚精胺、醋酸铵和碳酸氢铵购自Sigma-Aldrich（奥地利维也纳）。H（H）₂使用Milli-Q系统（奥地利Millipore）和CH在室温下将O纯化至18 MΩ·cm_三OH（VWR，奥地利）为HPLC-grade。

用RNA进行MS实验2–4在配备ESI源、用于离子隔离的线性四极杆、用于CAD的碰撞室和用于离子检测的ICR室的7T傅里叶变换离子回旋共振（FT-ICR）仪器（奥地利布鲁克Apex Ultra）上进行。9:1小时内含有脱盐RNA（1μM）和新霉素B（1-5μM）的溶液₂O/CH公司_三在ESI之前，将OH与50 mM碳酸氢铵和0.25 mM哌嗪（pH～7.5）以1.5μl/min的流速孵育3小时。我们选择碳酸氢盐作为ESI的缓冲液，因为它是挥发性的，在生理pH下缓冲，并且碳酸氢钠缓冲系统存在于血液、泪液和肾脏等组织中。50 mM的缓冲液浓度与我们的核磁共振实验中使用的浓度非常接近，10–100 mM浓度范围的中间范围通常用于RNA的核磁共振(44). 在测定RNA核磁共振结构的实验中1Wöhnert的帕罗莫辛和核糖霉素复合物（pdb条目2MXS和2N0J）等。(19)，ESI所用溶液中未添加二价离子；添加10mM MnCl₂RNA溶液1核糖霉素只引起核磁共振信号的谱线展宽，但化学位移没有变化(22). ESI光谱是通过线性四极杆在传输（仅射频）模式下的操作获得的。对于CAD，感兴趣的离子在四极体中分离出来，并在碰撞细胞中使用137-150、143和150-156 eV的实验室框架碰撞能量来分离（RNA+1·新霉素B-13H）¹³⁻，（RNA+2·新霉素B–13H）¹³⁻和（RNA+3·新霉素B–12H）¹²⁻离子。对于ESI和CAD，每个光谱分别增加了25–100和500次扫描。RNA MS实验5在因斯布鲁克大学生物化学研究所向我们提供的Fusion Lumos Orbitrap仪器（奥地利Thermo Scientific）上进行。Orbitrap仪器离子路由多极中用于CAD的能量进行了调整，使得c（c）和年RNA 1:1、1:2和1:3复合物的分离片段2使用新霉素B与使用FT-ICR仪器获得的结果相似（±2%）。数据缩减使用SNAP2算法（奥地利布鲁克）或FAST MS，这是我们小组由Michael Palasser编写的软件(45)以及手动检查光谱。相对离子丰度是根据光谱中相应的信号高度除以电荷数计算出来的，因为ICR探测器的响应与这个数字成正比(46). 仅考虑信噪比大于3且质量精度小于5 ppm的信号进行分析。

对于核磁共振实验，¹⁵N标记RNA2以钠盐形式冻干，溶于450μl NMR缓冲液（15mM磷酸钠、25mM NaCl、0.1%NaN_三pH 6.5，10%D₂O） 浓度为280μM，并转移到标准5 mm NMR管中。核磁共振谱是在15°C下，在配备Prodigy TCI探针的Bruker 700 MHz Avance Neo核磁共振仪上获得的。Imino质子信号分配通过2D实现¹H（H）-¹H跳跃和返回NOESY相关实验。分配程序的起点（G4、U7、G23和U32）是从特定地点确定的¹⁵通过运行¹H–¹⁵N-SOFAST HSQC脉冲序列。所有数据集均使用Topspin 4.2.0（Bruker Biospin）进行处理，并导入POKY进行共振分配。

为了预测游离RNA的结构，我们使用了MC-fold|MC-Sym管道(41)因为它是开放存取的(https://www.major.iric.ca/MC-Pipeline网站/)预测RNA的二级和三级结构，包括非标准碱基对，因为其预测能力是根据实验结构进行评估的。然而，其他程序(47,48)也可用于提供关于游离RNA结构的一般概念。

结果和讨论

在我们之前的研究中(36)，我们演示了如何使用CAD MS来识别RNA结合基序，并量化其与1:1 RNA-甘氨酸复合物配体的相对占有率。在这里，我们展示了如何将CAD MS的数据分析扩展到具有更高化学计量比（1:2和1:3）的配合物，并用核磁共振波谱的数据补充MS数据。首先研究的RNAs（方案2)是RNA2，这是新粘菌素敏感核糖开关适配体，对绿色荧光粉核糖开关活性研究中相关序列的表达(38,39)和两个为MS研究设计的RNA，其中RNA的G4•U322被U4-A32（RNA三)G3/G4/C5和G31/U32/C33被C3/U4/G5和C31/U32/G33（RNA4) (36). RNA的实验结构2–4不可用，但NMR构建RNA的结构1与巴龙霉素和核糖霉素的复合物（pdb条目分别为2MXS和2N0J）已经发表(19).

RNAs 1:1、1:2和1:3复合物的碰撞激活解离2–4产生新霉素Bc（c）和年磷酸二酯主链键断裂片段(40,49,50)（方案三)不含或不含3个新霉素B分子，我们在下文中将其称为c（c）(0),c（c）（1） ，c（c）(2),c（c）（3） 、和年(0),年（1） ，年(2),年(3). 现场特定百分比c（c）（m） 未附着或最多附着三个新霉素B分子的碎片(米=0–3）是相对于所有c（c）来自给定切割位点的片段；百分比年（m） 进行了相应的计算。新霉素B的丢失是一个较小的解离通道（<2%），因此对于每个解离位点，与所附新霉素B分子数量互补的片段百分比在实验误差范围内是相同的（图1安培–C类). 换句话说，所有新霉素B分子都被计算在内，并且可以在c（c）或年特定位点RNA主干裂解的片段。对于1:1络合物（m=1），这些是c（c）（0）和年（1） 以及c（c）（1） 和年（0），对于1:2配合物（m=2）c（c）（0）和年(2),c（c）（1） 和年（1） 以及c（c）（2） 和年（0），对于1:3复合物(米 = 3)c（c）（0）和年(3),c（c）（1） 和年(2),c（c）（2） 和年（1） 以及c（c）（3） 和年(0). 在图中1安培–C类和补充图S1和S2系列，用于补充的数据c（c）和年为了清晰起见，片段被显示为单独的符号，但我们使用这两种符号对单、双或三σ函数进行非线性最小二乘拟合，其残差表明标准偏差为～5%(补充图S1和S2系列).

通过上述标准化，100%的占用值表示完全占用的结合基序，<100%的占用率值表示部分占用的结合基序。然而，由于结合基序由结合区域组成（方案1)1:2和1:3建筑群的占用率值>100%，如下所示。占位值>100%表明，两个新霉素B分子在一小部分复合物中与一个基序结合，如果结合基序足够大和/或足够灵活，可以容纳两个新霉素B分子，则可能出现这种情况。

为了详细解释我们是如何开发自上而下的MS来鉴定RNA结合模体及其在1:2和1:3复合物中与配体的相对占据率，我们首先总结了对1:1 RNA复合物CAD数据的分析和解释2最近发表的新霉素B(36). 图1安培显示的百分比c（c）（1） 具有和互补的片段年（0）未连接新霉素B的片段与RNA切割位点。因为c（c）（0）和c（c）（1） -以及年（0）和年（1） -1:1复合物的总和为100%，绘制c（c）（0）和年（1） 在相反的轴上（右）显示相同的图片。在下文中，我们将讨论从5′到3′末端的数据。百分比c（c）（1） 和年（0）裂解位点1-5的片段为零，即c（c）₁–c（c）₅和年₃₅–年₃₉（方案三)表明新霉素B不与C1–C5结合。百分比c（c）（1） 和年（0）乙状结肠从5位增加到11位，表明新霉素B与A6–U11结合。在11–18位点的平台期后，表明新霉素B与U12–U18没有结合c（c）（1） 和年（0）在23位进一步增加到～60%，表明新霉素B与U19–G23结合。第23–30位的另一个平台和第30–37位的另外一个增加表明新霉素B与G24–U30和新霉素B分别与G31–A37没有结合。最后c（c）（1） 和年37–39位点的（0）表明新霉素B不与A38–G40结合。与1:1 RNA复合物CAD数据的比较1，我们假设序列延伸A6–U11包含两个相邻的结合区域，A6–U7（区域0）和A8–U11（区域I）(36). 此外，U19–G23和G31–A37分别被指定为结合区域II和III。将结合区域0-III映射到游离RNA的计算结构上2（图一维)揭示了两个独立的结合基序A（区域I和II）和B（区域0和III）。注意，这两个结合基序都由序列上距离较远的结合区组成，这意味着为了从给定基序区域内和区域之间的RNA主干裂解中分离片段，CAD还必须分离氨基糖苷和RNA之间的一些非共价键，使其与c（c）或互补的年碎片(36). 重要的是，每个绑定区域的过渡高度（图中用彩色矩形突出显示1安培–C类)反映了不同装订图案的相对占有率。对于1:1配合物c（c）（1） 和年（0）对于结合区I和II（发夹环-珠状基序A，紫色矩形），总计达46%±9%，而对于结合区0和III（下茎中的小沟基序B，绿色矩形），合计达54%±9%。因此在1:1的RNA复合物中2对于新霉素B，结合基序A和B几乎被同等占据。

图1B年显示了来自1:2 RNA复合物CAD的数据2用新霉素B(米 = 2). 上图显示了特定于现场的c（c）（1） 和互补年（1） 绘制为左轴上的黑色符号，以及c（c）（0）和补充年（2） 在反转的右轴上绘制为灰色符号。图中下图1B年显示的百分比c（c）（2） 和互补年（0）在左轴上绘制为黑色符号c（c）（1） 和互补年（1） 在反转的右轴上绘制为灰色符号。图中主要的S形转变1B年位置如图所示1安培这表明大多数新霉素B分子在1:2复合物中占据结合基序A和B。然而，12–16和24–29位点（蓝色矩形）的跃迁表明，一些新霉素B分子与1:1复合物以外的区域结合，我们将其分配给RNA上茎小沟中的另一个结合基序C2（图一维).

为了确定1:2复合体中不同结合基序的相对占用率，我们遵循图中的轨迹1B年其范围为0%至100%（每个对应于一个新霉素B分子），即痕量c（c）（0）和年（2） 在上面的图中以及c（c）（2） 和年（0）在图的下半部分1B年添加图中图案A（区域I和II，紫色矩形）、图案B（区域0和III，绿色矩形）和图案C（区域IV和V，蓝色矩形）的百分比值1B年表明在1:2复合体中，基序A被完全占据（100%），基序B和C分别占据到～80%和～20%。

新霉素B与RNA结合的CAD数据的三个图2在1:3的复合体中（图1摄氏度)表明跃迁位置和结合区域与1:2配合物的相同（图1B年). 为了确定不同结合基序的相对占有率，我们再次跟踪0%至100%的痕迹，即c（c）（0）和年（3） 在上面的图中，以及c（c）（3） 和年（0）在图的下半部分1摄氏度。在中间图中，两条记录道的范围均为0%至100%，但由于它们在区域IV（G13-C16）中重叠，我们可以将以下记录道合并c（c）（2） 和年（1） 在位置1–14（0–60%，实线红线）处c（c）（1） 和年（2） 位于站点14-39（60-100%，红色虚线）。添加图中图案A（区域I和II，紫色矩形）、图案B（区域0和III，绿色矩形）和图案C（区域IV和V，蓝色矩形）的百分比值1摄氏度显示在1:3的复合体中，每个图案在误差范围内都被完全占据。

数字2B型总结了RNA结合基序A、B和C的占用情况2对于所有研究的复杂化学计量。我们还研究了RNA的1:1、1:2和1:3复合物三和4用新霉素B(补充图S3和S4系列)，相应的占用率如图所示2摄氏度和D类分别是。在1:1的RNA复合物中2，结合基序A和B几乎被同等占据，新霉素B不与基序C结合。添加第二个新霉素B分子使RNA 1:2复合物中的结合基序B饱和2，将与基序B的结合从～55%增加到～80%，并导致基序C占据～20%。在1:3的RNA复合物中2，在误差范围内，所有三个图案都被完全占据。

核糖核酸三包含规范碱基对U4–A32，其中A32是结合基序B的一部分，而不是RNA的非规范碱基配对G4•U322（方案2). 在1:1的RNA复合物中三，新霉素B再次不与基序C结合，结合基序A和B分别占据约70%和约30%（图2摄氏度). 这一观察结果与新霉素B与RNA下茎结合减少一致三在没有非经典碱基对G4•U32的情况下。然而，尽管RNA基序B的亲和力降低三对于新霉素B，结合基序A在1:2和1:3复合物中没有完全占据，这表明RNA的G4•U322在某种程度上稳定了新霉素B与A基序的结合，而A基序和C基序均未完全占据RNA的1:3复合物三，结合基序B在~125%处被过度占据，表明在~125%的1:3复合物中，两个新霉素B分子与下茎结合（基序B），但它们的确切位置无法从补充图S3.

在RNA中4，我们替换了RNA下茎中的三个相邻碱基对2带CUG/CUG(51)，在原始位置重新引入一个非经典碱基对（尽管是不同的，U4•U32而不是G4•U33，图二维)由稳定的G–C碱基对构成（方案2). 与RNA相比，这种突变延长了1:1复合物中的结合区0到U4，并增加了新霉素B与所有复杂化学计量学的基序B的结合2因此，在任何RNA复合物中，模体A和模体C都没有被完全占据4在约30%的1:3复合物中，两个新霉素B分子与下茎（基序B）结合。RNA基序B的过度占据三（～125%）和4（～130%）与RNA形成鲜明对比2其中每个结合基序在误差范围内占100%。这表明RNA的异质结合模式三和4在1:3复合物的一部分（～25%和～30%）中，两个新霉素B分子与下茎结合，而在1:3的RNA复合物中发现了均匀的结合模式2.

上述来自CAD的1:1、1:2和1:3 RNAs复合物数据的主要发现2–4与新霉素B相比，（i）结合基序A仅在RNA的1:2和1:3复合物中被完全占据2其具有对核糖开关功能具有最高调节因子的序列(38)，（ii）结合基序B在RNA的1:2复合物中被过度占据三和1:3的RNA复合物三和4，（iii）用RNA中的标准碱基对U4–A32替换非标准碱基配对G4•U32三降低1:1复合物中结合基序B的占有率，但不降低1:2和1:3复合物中的占有率；（iv）结合基序C的占有率不受下茎序列突变的显著影响。因为中心结合基序A的残基是功能性核糖开关一致序列的一部分，它只在RNA中被完全占据2，而基序B在RNA中被过度占据三和4，我们认为RNA2对新霉素B结合具有最高的特异性，尽管新霉素B对RNA的总结合亲和力相同2–4在误差范围内(36).

实验测试游离RNA的结构2MC-fold|MC-Sym管道预测(41)（图一维)并观察新霉素B结合如何影响RNA的结构2，我们使用¹亚氨基质子区的核磁共振波谱。从RNA溶液中记录光谱2与0–4.5当量的新霉素B(补充图S5)，数据汇总如图所示三和4.图三显示了单个残留物相对于添加的新霉素B当量的化学位移，这立即显示了所研究的低当量（0-1当量）、中当量（约1-3当量）和高当量（约3-4.5当量）范围的明显变化，分别以浅绿色、灰蓝色和红色突出显示。到目前为止，亚胺质子光谱的最大变化是在0-1等效范围内观察到的（图4). 在没有新霉素B的情况下，亚氨基质子信号表明RNA下茎中G3、G4、U7、U30、G31、U32和上茎中G13、U14、G23、G24、U25的碱基配对2(补充图S5)与游离RNA的结构一致2MC-fold|MC-Sym管道预测(41)（图一维和4天). G13-C26和U14•U25亚氨基质子共振的观察表明，游离RNA2与NMR构建RNA相比，新霉素B结合的预结构更好1对应的碱基对没有（G9-C22）或只表现出很宽的（U10•U21）亚胺质子共振(39). 在RNA中添加0.5当量的新霉素B后，出现了5个新信号（G9、U17、U18、U22、U28）2(补充图S5,三)表明U18在发夹环中形成了碱基相互作用，并延伸了上部（U17-U22）和下部（A8-U28，G9-C27）茎；还观察到RNA通过氨基糖苷结合稳定发夹环和上茎1（缺少RNA的下茎2)在之前的核磁共振中(19)和化学探测MS(45)研究。此外，五个亚氨基质子信号（U7、U30、G23、G24、U14/U25；后两个残基产生重叠共振）表明游离形式和结合形式的RNA之间交换缓慢2关于化学位移时间刻度(补充图S5,三,4)表明高亲和力结合。重要的是，仅在新霉素B存在的情况下检测到的信号和显示出高亲和力结合证据的信号都来自RNA上部和下部的残基2（图4天)由于几何原因，很难用新霉素B与单个结合基序结合来解释。核磁共振数据进一步显示了G3、G4、G13和U32在0-1等效范围内的化学位移变化（图4A级)与新霉素B结合到两个不同的结合基序一致，如CAD MS所示（图1安培). 换句话说，核磁共振数据强烈表明RNA的1:1复合物2在体溶液中是两种不同的新霉素B与基序a或基序B结合的配合物的混合物。虽然新霉素B和基序a和B结合的1:1配合物的分数不能从补充图S5，来自CAD MS的数据（图1安培和2安培)表明图案A和B被同等占据。

在新霉素B浓度升高时，只观察到化学位移的较小变化（<0.1 ppm）（图4B、C)表明RNA结构的所有主要变化2已经被第一个新霉素B分子的结合所诱导，无论它是与基序A还是B结合。现在出现的问题是，新霉素B与基序B的结合如何对RNA的整体结构产生类似的影响2作为新霉素B与基序B的结合？换句话说，新霉素B与A基序结合如何影响RNA的结构2以及新霉素B与基序B的结合如何影响RNA的结构2在上阀杆？可能的理由是，下茎中碱基对的形成（A8–U28，G9–C27，图4A级)新霉素B与基序B结合诱导U14•U25稳定（其亚胺基质子在所有残基中显示出最大的化学位移变化，图三)反过来可以稳定RNA的上茎2同样，新霉素B与基序A的结合诱导U17–U22的形成（图4A级)并稳定上部茎中的U14•U25，从而稳定RNA的下部茎2这样，无论第一个新霉素B分子是与基序A还是B结合，U14•U25都可以作为稳定整个核糖开关适配体结构的变构接力元件。大约1-3当量范围内的化学位移变化可以解释为第二个新霉素B分子的结合，从而使基序a和B填充到图中所示的程度2安培（基序A:～100%，基序B:～80%），但不引起重大结构变化，符合Sigurdsson和Wachtweitl提出的两步结合过程(52). 最后，大约3–4.5当量时，第三个新霉素B分子主要与上柄结合（图4摄氏度)从而将所有三个图案A、B和C的占用率增加至～100%（图2安培). 综合起来，核磁共振和质谱数据表明新霉素B与RNA结合2涉及三个不相同且至少是基序A和基序B相互依赖的位点，这可以解释K（K）_D类模体A和B的值（0.4±0.6和3.1±1.5μM）通过拟合等温滴定量热法（ITC）获得(53)我们先前研究中的双站点模型数据(36).

新霉素敏感核糖开关发夹环和突起区（RNA的结合基序A）的中心作用2，数字一维和2安培)以前在基因报告检测中已经证明了调节功能(38,39). 例如，突变突起残基CUU（RNA的10–12位2在图中2安培)朝向30S核糖体亚单位16S rRNA中A位点的序列导致核糖开关功能完全丧失(39)尽管新霉素B与A位点基序具有高亲和力(K（K）_D类=4±1 nM）(23). 同样，发夹环区域和上茎（图中C16–G23）的突变2)可以使核糖开关失效(38,54). 下茎的突变研究较少，但简单地用U6–A30和A7–U29取代碱基对A6–U30和U7–A29已经将调节因子从7.5降低到5.5(38). 这些结果支持了RNA的假设2具有不止一个结合基序，分子间和分子内相互作用的复杂网络使核糖开关发挥作用。为了进一步验证这个假设，我们研究了RNA5（表1)上部茎发生单一突变（RNA中为C13而非G132)没有检测到核糖开关活性(38,39). 1:1 RNA复合物的计算机辅助设计5与新霉素B的结合表明，结合基序A和B的占有率在误差范围内与RNA相同2；在这里研究的1:1复合物中，基序C没有被占据(补充图S6). 然而，基序C（RNA）结合区IV的C13突变5)在1:3复合物中，新霉素B与基序C的结合显著减少（从～100%到～60%），这可能表明新霉素B结合基序C在核糖开关功能中可能发挥作用。

MS和NMR数据均表明最多三个新霉素B分子与核糖开关适配体RNA结合2，出现了两个一般性问题。首先，更多的新霉素B分子能与RNA结合吗2第二，核糖开关必须结合多少新霉素B分子才能发挥作用？关于第一个问题，我们记录了RNA的天然ESI MS光谱2含有多达五种当量的新霉素B(补充图S7). 在使用的最高新霉素B浓度下，我们观察到1:4的复合物，但CAD将其分解导致一个新霉素B分子丢失，我们将其解释为第四个新霉素B分子的弱而非特异性结合。进一步测试多达三种新霉素B分子与RNA的结合特异性2，我们用亚精胺（pK（K）_一10.7 ± 0.2) (55)超过新霉素B 20倍(补充图S8). 因为添加100μM亚精胺将溶液pH值增加至～9.5，并且添加CO₂将其恢复到~7.5是不切实际的（亚精胺与CO反应₂形成氨基甲酸酯）(56)，我们用100μM的ESI添加剂进行了对照实验(57)哌啶（pK（K）_一11.1 ± 0.3) (58)在相同的pH值下，亚精胺产生的离子净电荷略高于哌啶，但游离RNA的部分2其与新霉素B的复合物非常相似(补充图S8C). 与RNA数据一致1在不同的pH值下(36)，随着pH值的增加，新霉素B质子化减少，氨基糖苷与RNA结合减少2(补充图S7D和S8)，但即使在pH～9.5时，仍检测到与新霉素B的化学计量比更高的络合物。重要的是补充图S8表明亚精胺与新霉素B不竞争，因为复合物的组分与ESI添加剂哌啶所得的组分相似。此外，与RNA的三个不同的结合基序一致2由CAD MS识别（图1)，核磁共振谱中未发现第四个新霉素B分子的特异性结合迹象。因此，最多只有三个新霉素B分子与RNA结合2具有证明的特异性。关于第二个问题，核磁共振数据表明，单个新霉素B分子的结合已经诱导了RNA大部分功能结构的形成2第二个新霉素B分子的结合只是稳定了这种结构。根据核磁共振数据，第三个新霉素B分子进一步增强了RNA的适配体结构2我们假设，随着新霉素B浓度的增加，核糖开关使用结合基序A–C逐渐稳定其适配体结构。这可能为影响核糖体翻译起始扫描机制的剂量依赖性细胞反应机制提供基础。

结论

我们证明了自然自顶向下质谱结合RNA结构预测如何用于识别核糖开关适配体的多个结合基序，并相对量化其与氨基糖苷配体新霉素B在任何给定的复杂化学计量比中的占据。我们通过核磁共振波谱进一步表明，最多三个新霉素B分子的结合不是电喷雾电离的伪影，但也可以在溶液中观察到。第一个新霉素B分子的结合可以在两个不同的基序上以相似的概率发生，但在每种情况下都能稳定整个适配体结构。然而，第二和第三新霉素B分子的结合仍然是特异性的，并进一步稳定和构造控制翻译起始的适配体。在1:3复合物中，核糖开关适配体上端的一个单一突变消除了核糖开关功能，将第三配体结合基序的占有率从～100%降低到～60%，支持了所有三个新霉素B分子可能在核糖开关作用中发挥作用的假设。总的来说，这里的数据表明，具有单一结合基序的简单1:1结合模型不能充分描述新霉素B与核糖开关适配体的结合，我们推测，通常情况下，天然小分子与RNA的结合可能进化到了一种单一技术无法捕捉到的复杂程度。本地自顶向下MS、RNA结构预测和¹亚氨基质子区的核磁共振氢谱是未来研究其他RNA和配体分子以验证该假设有效性的有力方法。

数据可用性

本文的基础数据可以在文章及其在线补充材料中找到。

补充数据

补充数据可从NAR Online获取。

基金

本研究的全部或部分资金由奥地利科学基金（FWF）[向K.Br.授予DOI 10.55776/P36011；向C.K.授予10.55776/I5287、10.55776/P34370、10.55776/P32773；向R.M.授予10.55776、P31691、10.55775、F80]、TWF【向K.Ba.授予F.33309/2021】和奥地利研究促进机构FFG【858017】提供。出于开放存取的目的，作者已将CC BY公共版权许可证应用于本次提交的任何作者认可的手稿版本。

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