在陶（Tau）进行性核上麻痹基因

我们描述了两种覆盖人类的扩展单倍型陶基因。在总共约200名无血缘关系的白人个体中，跨基因多态性之间存在完全不平衡（涵盖约100 kb的DNA）。这表明这两个单倍型的建立是一个古老的事件，要么重组在这个区域被抑制，要么重组基因被选择对抗。此外，我们发现更常见的单倍型（H1）在进行性核上性麻痹（PSP）患者中明显过度表达，扩展了早期关于内含子二核苷酸多态性与PSP之间关联的报道。

介绍

进行性核上性麻痹（PSP）是继帕金森病（PD）之后退行性帕金森综合征的第二大常见病因(1). 除了帕金森综合征外，临床症状还包括早期姿势不稳和核上凝视麻痹(2). 神经病理学上，PSP的特征是大量的神经纤颤缠结（NFT）和由过度磷酸化Tau蛋白组成的神经丝。PSP中观察到的缠结在分布和组成上与阿尔茨海默病（AD）相关的缠结不同。在PSP中，缠结主要局限于皮层下区域，存在于神经元和胶质细胞中，而在AD中，它们更为广泛，主要为皮层，仅限于神经元。在超微结构水平上，构成PSP中缠结的细丝是直的，而成对螺旋细丝（PHF）是AD中缠结最丰富的物种(三,4).

成人大脑中Tau有六种主要的蛋白质亚型(图1). 这些基因由外显子2、3和10的选择性剪接产生(5). 外显子9-12编码四个微管结合结构域，它们是31或32个残基的不完全重复(6). 外显子10的选择性剪接产生具有四个（外显子10+；‘4-重复Tau’）或三个（外显子10-；‘3-重复Tau'）微管结合域的亚型(7). PSP中观察到的由直丝构成的NFT仅包含4重复Tau亚型，而AD中发现的由PHF组成的NFT包含所有六种主要Tau亚型态（4重复和3重复）(4).

中的突变陶最近发现该基因与17号染色体连锁的额颞叶痴呆伴帕金森综合征有关（FTDP-17）(8–10). 在这种情况下，我们最近发现陶外显子10增加该外显子并入陶信使核糖核酸(9)从而增加4重复Tau亚型的比例(10). 在受累家庭中，这种增加与4重复Tau NFT的形成有关，并导致额颞叶痴呆。这一观察结果表明，对这种选择性剪接事件的控制是至关重要的，而失调会导致缠结形成和神经退化(9–11).

PSP的遗传学直到最近才被详细研究，因为该病通常被认为是散发性的。然而，康拉德等。(12)证明了一个多态性二核苷酸标记之间的关联，该标记位于陶基因和PSP。这一初步结果随后被至少四项其他研究证实(13–16). 在每种情况下，PSP组中最常见的等位基因（a0）和基因型（a0a0）都有过多表达。然而，由于二核苷酸多态性的性质，人们认为这种变异在疾病过程中不太可能具有生物学意义，但实际上与其他多态性不平衡(12). 基因突变的鉴定陶影响外显子10选择性剪接并导致FTDP-17发育的基因(9,10)由此推测，二核苷酸多态性（在外显子9和10之间）的位置可能很重要，这表明如果多态性本身在功能上不相关，那么关键变异就在附近。

在对陶在FTDP-17病例中，我们和其他人发现了一系列散布在该基因中的多态性(8,9). 在这里，我们研究了这些多态性之间的不平衡程度及其与PSP的相关性，以此作为确定PSP遗传易感性的确切机制的一个步骤陶轨迹。

结果

tau基因中扩展单倍型的鉴定

中编码区和侧翼内含子序列的序列分析陶基因，主要存在于FTDP-17家族(8,9)，在外显子1、2、3、9（三种多态性）、11和13中鉴定了一系列单核苷酸多态性（SNP）(表1)在对照组和患者中都存在。这些多态性的发生分析(表2)结果显示，他们之间完全不平衡（P<1 X 10⁻¹⁰⁰). 因此，有两种扩展的单倍型（指定为H1和H2）覆盖了整个陶基因（～100kb；图2). 在测试的任何无关患者和对照个体（总数>200）中，我们没有在这些单倍型中发现单一重组事件。无重组事件陶在这一大组无关个体中的基因强烈暗示着这些单倍型是在受试白种人的历史早期建立的。一种罕见的SNP（SNP 9iii in表1和2)外显子9中仅存在于更常见的H1单倍型上，这表明它是由该单倍型建立后的独立突变事件引起的。此外，二核苷酸多态性（a0），先前已经证明与PSP相关，也与两个扩展单倍型遗传：二核苷酸多态等位基因a0（11重复）、a1（12重复）和a2（13重复）与H1单倍型继承，而a3（14重复）和a 4（15重复）等位基因以H2单倍型遗传。鉴于a0和a3是最常见的等位基因（在我们的对照个体中分别为70.5%和23%；表3)当扩展单倍型建立时，似乎很可能出现a0和a3，a1、a2和a4是由随后的滑移事件引起的(图2). 这一观察进一步证明了这两种单倍型的保存和古老性。

扩展的关联陶PSP单倍型

我们测试了每种多态性（SNP和二核苷酸）以及与PSP相关的扩展单倍型。本分析共采用65例PSP患者（平均年龄65.3岁）；18例为尸检确诊病例，其余病例符合国家神经疾病和中风研究所（NINDS）的PSP标准。高加索老年人对照(n个=135，平均年龄63岁）用于比较。

最初的分析集中在二核苷酸TG重复序列多态性上，该多态性之前已被证明与PSP相关。与对照组相比，PSP患者中最常见的等位基因（a0）和基因型（a0a0）明显过度表达(表3). 一部分案例(n个=24）在本研究中，以前曾被用于证明这种多态性与PSP的关联(14); 因此，这一观察是意料之中的。

此外，每种多态性都显示出与PSP相关的证据，即与对照组相比，该组中最常见的等位基因（H1）和基因型（H1H1）明显过度表达(表2). 由于这些SNP在该人群中都处于完全不平衡状态，我们还分析了每个扩展单倍型与PSP之间的关联数据(表4). 同样，PSP与最常见的单倍型[H1，χ²= 14.58,P（P）=0.00013，1自由度（df）]和基因型[H1H1，χ²= 13.85,P（P）=0.00098，2 df）。发展PSP与H1H1基因型遗传的比值比计算为4.08[8.79>CI（95%）>1.89]。

的序列分析陶在PSP情况下

在关联研究中使用的60例PSP病例中，对外显子9-13进行了测序，其中13例经尸检证实。这些外显子被分析为陶与FTDP-17相关的基因在该区域被发现。在60例已测序的PSP病例中，未发现错义或外显子10 5′剪接位点突变，表明典型PSP并非由FTDP-17家族中观察到的类似突变引起。在27例PSP病例中（其中6例经尸检证实）陶基因分析；同样，没有发现突变。

除了对编码外显子进行测序外，我们还检测了陶外显子10。进行此分析的原因是，我们认为外显子10周围的区域最可能是生物相关遗传变异的候选区域。这是因为PSP中的缠结由4重复Tau亚型组成，当在FTDP-17家族中观察到类似内含物时，它们与外显子10的错义或剪接位点突变有关(4,9,11,17,18).

内含子侧翼序列分析陶第10外显子显示存在缺失，位于第10外显子上游的−951和−713核苷酸之间。这238 bp的缺失是作为不太常见的H2扩展单倍型的一部分遗传的，因此与PSP呈负相关。

讨论

我们在陶并发现这些基因是在完全不平衡的条件下相互遗传的，具有二核苷酸多态性。这些多态性共同定义了两种扩展的单倍型，它们至少包含整个单倍型陶基因（外显子1-13；～100kb），并且在本研究中检测的所有无关个体中通过重组保持不间断。这些数据清楚地表明，这两种单倍型是在高加索人口历史早期建立的。事实上，自两个单倍型（点突变和二核苷酸多态性滑移）建立以来，其他多态性明显是由独立的突变事件而非重组引起的。事实上，在整个陶该基因表明，该染色体区域必须存在重组抑制，或针对重组等位基因的选择。

我们的关联研究表明，与对照组相比，pSp病例中更常见的（H1）单倍型和基因型有显著的过度表达。因此，早先的报告(12–16)第9外显子和第10外显子之间的二核苷酸多态性（a0）与最常见的等位基因的关联反映了这种关联与更广泛的单倍型。事实上，仅仅使用关联研究的结果，就不可能确定直接影响PSP发生风险的生物学相关多态性的位置，因为扩展单倍型包含所有的陶基因分析。

从生物学的角度来看，有三种可能性可以解释陶PSP：（i）就Tau蛋白的表达而言，这两种单倍型之间可能存在关键差异；（ii）两种同源蛋白的剪接可能存在差异；或（iii）H1背景发生了致病但非编码的突变。事实上，PSP患者的大脑中含有由四个微管结合重复序列的Tau亚型组成的NFT(4)提示受PSP影响的大脑区域可能存在外显子10选择性剪接的中断。因此，在PSP发病机制中发挥作用的最佳候选因素似乎是影响选择性剪接的遗传变异陶外显子10。为了寻找这种变异性，我们将1 kb测序到外显子10两侧的每个内含子，并定位238 bp的缺失。缺失区的存在或不存在可能以神经元特异性的方式影响外显子10的选择性剪接，从而影响发展PSP的风险。显然，需要进一步研究，如剪接分析，以确定陶第10外显子选择性剪接在PSP发生发展中的作用，以及这种缺失的意义（如果有的话）。

基因多态性的关联陶PSP表明Tau功能障碍可能对该疾病的发展至关重要。然而，Tau功能障碍是否是PSP发病机制中的主要病变，或者是否需要先发生其他始发事件，以及在PSP发病过程中Tau功能障碍的变异性仍有待确定陶基因只是影响特定神经元和胶质细胞对这种最初的损伤的敏感性。

材料和方法

确定患者

本研究中使用的所有患者均为白人。根据NINDS制定的指南，诊断出患者可能患有PSP(2). 据报道，这些标准的最佳特异性为100%(2). 18例患者的神经病理结果也符合PSP（NINDS标准）。

PCR和序列分析

陶（Tau）外显子(1–5,7,9–13)用设计用于侧翼内含子序列的引物从个体基因组DNA中扩增(8,9,19). 外显子4A、6和8在人类中基本上不存在陶脑mRNA，因此未进行分析(19). 在50 ml反应混合物中使用25毫微克DNA，其中每个引物含有20 pmol，0.2 mM dNTPs，1 U Taq Gold聚合酶（加州福斯特市珀金埃尔默），1.5 mM MgCl₂，75 mM三氯化氢，pH 9.0，20 mM（NH₄)₂SO公司₄和0.01%吐温-20。外显子9的扩增需要添加5%的二甲基亚砜。在Hybaid Touchdown热循环器中进行无油放大（英国剑桥Hybai德）。条件是35个循环，94°C 30 s，60至50°C着陆退火30 s，72°C 45 s，最终延伸72°C 10 min。使用Qiaquick PCR纯化试剂盒（Qiagen，Chatsworth，CA）纯化所有产品。使用Big Dye试剂盒（Perkin Elmer）和相关PCR引物对每个外显子的100 ng产物进行双向测序。在ABI377自动测序仪上进行测序，并使用Factura和Sequence Navigator软件（Perkin Elmer）进行处理。

基因分型和多态性分析

以前报道的多态性(8,9)通过PCR扩增进行分析，然后用诊断性限制性内切酶（PCR-RFLP）对产物进行消化。对于多态性9i和11，多态性位点没有改变酶识别位点，设计一个错配引物来创建一个可用于基因分型的人工位点(表1). 在PSP序列中，通过序列分析确定外显子9和11的基因型。通过在琼脂糖凝胶上观察PCR产物来确定内含子238 bp缺失的存在。PCR条件如前所述，使用引物序列GGAAGCGTTCTCACTGATCG（正义）和AGGAGTCTGGCTTTCAGTCTC（反义）。所有样本均采用四标记正向引物PCR进行内含子二核苷酸重复序列多态性的基因分型，然后使用Genotyper软件（Perkin Elmer）对ABI377进行分析。多态性的频率如所示表2和三.基因座之间的连锁不平衡由“估计单倍型频率”程序确定(20).

致谢

作者承认哈佛智库提供了样本。感谢Eileen McGowan博士对数据的有益讨论。这项工作得到了NINDS RO1基金（NS37143-01）对M.H.、梅奥基金会（M.H.，J.H.和D.D.）、PSP协会（D.D.）的资助，以及H.T.Roxel对D.D.的纪念基金和史密斯学者计划的支持。

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