最终报告摘要-GENODISC（椎间盘退变相关病理学：靶向治疗和修复的新生物标记物和诊断） 执行摘要：背痛是全世界多年残疾患者的主要原因，给欧洲国家带来了巨大的经济和社会负担，约占GDP的1.5%。其发病机制尚不清楚；诊断和治疗是主观的，对于相同的症状，不同国家的手术率相差25倍。背痛与椎间盘退变密切相关，因此椎间盘是研究这种疾病的重点，尽管许多椎间盘变性患者没有症状。Genodisc项目的目的是通过研究椎间盘退行性变相关疾病患者而非普通人群来研究背痛和椎间盘退化之间的关系。目的是改善与剧烈背痛相关的疾病的表型，以提高治疗质量，进一步了解退行性变，制定预防措施并研究修复的可能性。为了提高对这些疾病的诊断，来自不同欧盟国家的五个大型脊柱专科中心的临床医生定义了主要临床表型，并对2573名慢性背痛患者的临床表型进行了表征。表型是指MRI评分和生活方式、合并症、残疾和疼痛以及结果问卷的答案。这些信息都收集在一个中央数据库中，可用于与联合体成员合作进行的关联研究。椎间盘退变主要来源于遗传，因此从所有患者身上采集了DNA。通过联合GWAS研究确定了与椎间盘突出症相关的新基因，随着技术的发展，DNA将被保存以供未来研究。项目背景和目标：2.1项目背景概述背痛是一个巨大的临床、社会和经济问题；事实上，最近一项关于全球疾病负担的大型国际研究发现，这种疾病是导致世界长期残疾的主要原因[1]。在工业化国家，仅腰痛的成本就相当于冠状动脉疾病或抑郁症的成本，约占国民生产总值的1.5%。在欧洲，这种疾病是最常见和最昂贵的临床问题之一，但对原发问题的诊断可能比任何其他疾病都要差。目前，大约85%的主要脊柱病例没有明确的诊断，也没有临床共识的适应症或治疗方法。手术是目前唯一的医疗干预手段，即使没有明确的诊断，也可以将患者的症状与病理变化联系起来。不同中心之间的手术率差异高达20倍。这是所有外科手术中最大的变异系数[2]，意味着大量患者要么治疗过度，要么治疗不足。因此，诊断和分层是改善临床状况的关键问题之一。另一个关键问题是提高对背痛因果途径的理解；这种理解对于制定预防和治疗的基本策略是必要的。背痛与椎间盘退变密切相关，可能由椎间盘本身引起。椎间盘约占脊柱长度的三分之一，承载着载荷，充当着脊柱的关节，一个或多个椎间盘的退变对其他结构造成了不适当的载荷，例如，也可能是疼痛的来源。因此，椎间盘退变的原因、其对脊柱力学的影响以及该组织的预防和再生方法是背痛研究的主要焦点。椎间盘退化的时间早于体内任何其他组织，但其原因尚不清楚。双胞胎和家族研究表明椎间盘退变与基因高度相关[3]。关联研究和GWAS已经确定了几个潜在的候选基因[4]，但大多数结果尚未被复制。重要的是，在所研究的多态性中，每种多态性的影响都很小。这表明椎间盘退变既复杂又多基因。退化可能涉及多种相互作用的遗传和环境决定因素。然而，椎间盘退变通常是无症状的。很大一部分人的椎间盘退化甚至脱垂，但仍然没有疼痛和症状[5；6]。椎间盘退变导致一人而非另一人腰痛的特征尚未确定。重要的是要确定不同的治疗方法是否可以针对某些疾病，并确定哪些患者将受益于生物治疗。了解多态性如何导致退化将有助于确定预防途径，并有助于发现成功修复的潜力是否由基因决定。2.2研究的主要目标该项目的总体目标是通过开发更清晰的客观表型来改善与椎间盘退变相关的疾病的治疗，以此作为改善不同腰痛疾病的诊断和分层的途径。改进诊断将有助于更好地进行针对性治疗，更快地治疗急性病，有助于防止慢性病的发展。它还将有助于制定预防方案，并有助于了解这些疾病的生物学和生物力学基础，这将有助于基理疗法的发展。诊断本项目将通过以下方式满足改进诊断的需要：选择定义明确的表型。我们将确定并制定方案，以选择适合调查椎间盘退变及其相关疾病的人群。开发更清晰的诊断工具。我们将使用建模分析来帮助开发明确的诊断工具，如生物标记物和成像参数。测试新的诊断标准。为评估维修可能性而开发的诊断工具将在项目的最后阶段进行评估预防本项目旨在通过以下方式确定预防途径：识别与椎间盘退行性变相关疾病相关的基因。我们将对精心挑选的患者群体进行联合基因组筛查，并使用微阵列分析来更好地识别与特定病理相关的基因。揭示病理途径。我们将通过实验研究可能改变椎间盘及其细胞功能的特定途径。设计预防策略：我们将设计锻炼计划以提高躯干肌肉力量，并测试对年轻人背部疼痛的影响修理该项目将通过以下方式提高“修复”方面的研究现状：通过建模学习。我们将使用计算机和实验模型来展示组织基质和脊柱单元的功能如何随着疾病而改变，并确定不同治疗方法何时可以针对某些疾病。制定维修策略。通过对患者进行基因分型和仔细的诊断和评估，将有可能制定策略，以确定哪些患者将受益于生物治疗和椎间盘内退化基质的成功修复。诊断措施的参与将决定可选择哪些患者进行治疗。项目成果：主要科技成果和前景已作为可交付成果报告。根据项目的主要目标，科技成果总结如下。诊断3.1表型Genodisk的重点是与疼痛和残疾相关的不同的椎间盘相关病理。这些临床表现包括腰椎间盘突出症伴神经根病、腰椎管狭窄症伴神经源性跛行和腰椎滑脱。MR成像上看到的多层面终板缺陷，如Schmorl结节，是另一个值得关注的明显表现型。这里的目的是定义明确的临床表型；这对于成功识别相关遗传多态性、功能性遗传途径、生物力学分析和诊断至关重要。Genodisc鉴定的不同临床表型如下所示。表型鉴定主要选择是“因背痛或脊柱问题寻求二级护理的患者”。在收集期结束时，当收到所有备份数据（如MRI）时，患者将被分配到适当的临床组。特定群体中的患者将尽可能同质化。成像对于每一位入选研究的患者，都会获得并分析“内部”临床MRI，包括T1和T2序列。受试者的核磁共振成像仪以DICOM格式存储在CD上，并由埃德蒙顿的UH合作伙伴和奥斯维斯特里的Keele合作伙伴进行评估。问卷和病史为每个合作伙伴完成了以下三份最终确定的多中心表格（见可交付成果2.1）-诊断表（包括参与者的症状和分类数据）-参与者调查（包括家族史问题）3.2建模数据库体外数据库利用迄今为止在第四中心（德国乌尔姆）测试的所有脊柱标本的柔韧性数据，创建了一个脊柱体外实验数据库，该数据库提供了建模数据。选择203个节段（来自111名供体），这些节段在±7.5Nm的纯力矩载荷下进行了柔韧性测试，并且可以获得射线照片。该数据库用于研究椎间盘退变对腰椎旋转稳定性的影响。例如，椎间盘退变的放射学程度、运动范围和中性区符合统计模型，该模型考虑了脊柱水平的影响。平均估计值显示，屈/伸（3.1°，p小于0.05）和侧弯（3.4°，p<0.05）的运动范围从0级持续减小到3级。只有在轴向旋转时，运动范围才趋于不断增加。中性区也受到类似的影响，但受退化程度的影响较小。这表明椎间盘退变的早期阶段并不一定会导致不稳定，这与先前的假设相反。这些结果[8]可能与定义动态稳定程序的指示有关。它们还用于验证FEM计算。3.3针式渗透计聚集蛋白聚糖是椎间盘的主要大分子成分之一，聚集蛋白聚糖的丢失是椎间盘变性的首要症状之一。恢复聚集蛋白聚糖，从而恢复椎间盘高度和膨胀，是生物治疗的主要目标。因此，人们付出了很多努力来衡量它，但收效甚微。通过关注聚集蛋白聚糖渗透特性引起的膨胀压力，我们开发了一种针式渗透压计，可用于测量组织样品中的膨胀压力。这是一种潜在的非破坏性诊断工具，用于确定组织外植体和组织工程构建物实验以及病理组织中膨胀压力的变化。针式渗透压计的设计和设置。渗透压计的设计基于这样一个前提，即穿过半渗透膜的膨胀压力差异反映在液体进出探头的流量中。为此，使用配有6kDa半渗透聚醚砜膜的微透析探针作为针式渗透压计。测量方法是用已知溶液（盐水或5%PEG）填充探针，并测量流体界面的移动速率，代表流量。3.4数据库数据库内容的屏幕截图如可交付成果D6.1所示。所有Genodisc合作伙伴都可以使用该数据库以及存储在光盘上的匿名MRI。预防3.5衰老表型正常细胞具有有限的复制能力，即它们只能进行有限数量的细胞分裂，分裂后它们仍保持代谢活性，但无法增殖；一种称为体外衰老或复制性衰老的现象。除连续传代培养外，细胞暴露于氧化应激、辐射、炎性细胞因子、各种化学物质甚至某些致癌基因的过度表达等多种损伤下，可进入永久性生长停滞状态，称为“应激诱导的早衰”（SIPS）。衰老细胞在培养过程中表现出明显的形态学改变，例如膨胀的不规则形状，伴有增大的分叶细胞核。它们的主要功能特征是由于p53/p21WAF1/pRb轴的激活而不能增殖。此外，衰老细胞的基因表达谱发生改变，导致“促炎症”表型，表现为基质金属蛋白酶、生长因子、细胞因子和其他炎症分子的过度表达。由于这种“促炎症”表型，衰老细胞可以影响组织更新和正常功能，因此它们可以促进衰老过程和与年龄相关的病理发展。为了支持后者，研究表明，慢性创伤或年龄相关疾病（例如骨关节炎和动脉粥样硬化）部位的衰老细胞百分比随着年龄的增长而增加。3.6细胞因子细胞因子是作为细胞吞噬和调节分子的小分泌蛋白或糖蛋白。它们包括具有多种功能的分子，如白介素家族成员、TGFß和TNFa。每种细胞因子与细胞表面受体结合后，都会导致细胞内信号级联，从而改变细胞行为，例如上调和/或下调几个基因中的任何一个及其转录因子。这可能导致进一步产生其他细胞因子，增加其他分子的表面受体数量，产生蛋白酶或通过反馈抑制抑制其自身效应。椎间盘细胞长期以来被认为能够合成多种细胞因子。3.7退化生物力学模型目标。通过有限元模型研究了椎间盘退变的各种临床情况，其中最常见的椎间盘宏观退行性变化（水分损失、椎间盘高度损失、终板钙化、骨赘生物）分别存在或以各种组合存在。所有考虑的宏观变化都被发现与机械相关；椎间盘退变分级系统应尽可能考虑到这些因素。这项工作导致列出了四份出版物，其中提供了模型的详细信息[8；11-13]。所报告的研究结果可能为讨论针对特定临床病例选择合适的退行性椎间盘疾病治疗方法提供了基础，包括保守治疗和手术治疗。3.8分子年龄测定了椎间盘中结构大分子（胶原蛋白、弹性蛋白和聚集蛋白）的分子半衰期与退变程度的关系。该数据提供了关于基质稳定性与降解影响的信息。它也是制定组织修复策略的关键因素。为了测量半衰期，我们使用天冬氨酸的外消旋作用作为“分子年龄”标记。提取结构分子；通过结合/分离CsCl梯度离心法提取Aggrecan（A1）。胶原蛋白通过连续酶处理进行纯化，并通过羟脯氨酸分析进行纯度分析。使用胰蛋白酶消化、CNBr和胶原酶通过逐步去除组织成分的策略提取弹性蛋白。使用部分氨基酸分析和蛋白质组学方法评估弹性蛋白的纯度。对目标大分子进行适当的衍生化后，用高效液相色谱法（HPLC）测定天冬氨酸的异构体L-和D-。D-Asp的积累用于评估蛋白质周转。蛋白质中D-Asp的量的时间变化率由方程给出：D（D/L）/dt＝ki-kT（D/L）。式中：d（d/L）/dt的值是由d/L值作为时间函数的多项式拟合的导数得出的。为了估计蛋白质周转率（kT）随年龄的变化，我们利用了胶原蛋白和聚集聚糖的外消旋速率（ki）值。使用半衰期关系（1/2）：？1/2=ln（2）/kT，我们能够确定正常和退变椎间盘聚集蛋白和胶原的半衰期随年龄的变化。由于弹性蛋白没有可用的ki值，因此未计算其周转量，但证明了其寿命。结果表明，对于所有测试的蛋白质，D-Asp的体内积累（以D/L-Asp比率表示）随年龄增长而增加。对于胶原蛋白和聚集蛋白，将NP和AF（正常或退化）的数据合并，因为在D-Asp积累率方面没有观察到显著差异（p小于0.05）。由于不同退化程度或不同病理的退化组织之间的D/L天冬氨酸积累没有显著差异（p小于0.05），因此将退化标本的D/L数据汇总并与健康组织进行比较。对于胶原蛋白，D-天冬氨酸的增加与年龄的关系呈线性拟合，正常胶原蛋白的积累率为6.74 10-4/年，退化胶原蛋白的累积率为5.18 10-4/每年。这十年汇集的数据显示，仅在50至60岁之间，正常组织和退化组织的D/L-Asp平均值之间存在显著差异（p小于0.05）。除了来自牙本质的胶原蛋白外，与软骨和皮肤相比，IVD获得的胶原蛋白积累D-Asp最快。对于aggrecan，D/L-Asp随年龄的增长在成熟后（大于20岁）呈非线性增长，直到60岁以上达到稳定。相对较大的分散可能是由于聚集聚糖制剂的异质性。与所有年龄段的正常人相比，退化聚集蛋白中D/L-Asp的测量值始终显著降低。这十年汇集的数据表明，D/L-Asp积累在正常组织和退化组织之间的差异更为显著，而不是年龄的函数。对于弹性蛋白，D-Asp在正常IVD样品中的积累随年龄增加而增加。由于数据在50-80岁之间从退变椎间盘趋向于稳定，因此这种情况下的线性回归仅适用于50年代中期。对完整数据集进行线性回归后，R因子稍差（R=0.8）。将D-天冬氨酸的线性增加与年龄的关系进行拟合，得出正常（1-2级，所有年龄段）和退变椎间盘（3-5级，直到50年代中期）获得的弹性蛋白的累积率分别为16.2±3.1×10-4年（R=0.95）和11.7±3.8×10-4每年（R=0.84）。在p小于0.05的水平上，我们发现这两个比率之间没有统计上的显著差异。组合数据集的D-Asp线性累加率为12.3±2.6×10-4/年（R=0.79）。在50岁以上，正常组织和退化组织之间的差异具有统计学意义（p＜0.05）。3.9基因表达我们使用微阵列和蛋白质组学来描述正常和病理椎间盘对压力的细胞反应的差异。由于缺乏基线人类椎间盘组织，我们通过在模型系统中模拟病理条件来检查这个问题，我们比较了正常和病理条件下的基因表达。由于蛋白多糖的丢失及其对细胞外渗透压的影响是椎间盘病理学中第一个也是主要的生化变化，我们将渗透压下降作为主要的退行性信号。然后，我们研究了患者病理性椎间盘的模型系统中识别的表达标记。3.10个诊断基因为了找到诊断或作为药物靶点的靶基因，我们使用了WP3和WP5中描述的方法。全基因组关联分析已成功应用于多种病因复杂的慢性疾病，但不适用于椎间盘退变或相关脊柱疾病；今年秋季（2012年）发表的第一项gwas研究发现了一种新的关联，即PARK2基因，该基因在椎间盘退变中没有作用。为了降低成本，我们使用病例和对照的ofl DNA集合，并比较集合中的等位基因频率，而不是对样本中的每个人进行单独的基因分型。汇集现已成为一种技术上可行的替代个体基因分型的方法，以识别与椎间盘退变相关的变异，这也节省了大量成本。我们提出了一项高效、经济高效的多阶段设计GWA池研究，以确定参与椎间盘退变的许多SNP。匈牙利腰椎间盘突出症样本和对照组的DNA由芬兰分子医学研究所技术中心（芬兰基因组中心的继任者）制备和分析。在最后一组（共12个重复）中，有203例患者和203名对照，每个受试者的DNA数量相等。这些是在Illumina OmniExpress芯片上运行的，对第1至22号染色体上总共709358个单核苷酸多态性进行基因分型。通过要求病例和对照组在所有12个重复中都具有成功的基因型，对数据进行了清理。每个池基因分型的个体成功率为99.34%或更高。接下来，我们排除了等位基因频率变异性太大的SNP（平均值大于+/-0.05）。进行了两组分析。候选基因分析基于已发表的工作和系统综述（Eskola P等人，Plos One），我们旨在复制早期候选基因关联。Eskola等人确定了6个基因（ASPN、COL11A1、GDF5、SKT、THBS2和MMP9）在腰椎间盘退变中具有中等程度的证据（在不同的研究中评估了多种表型）。我们能够在我们的数据集中评估三个相同的单核苷酸多态性，没有一个在病例和对照组之间显示出差异（最大等位基因频率差异为0.029）。我们还检测了另外两种候选药物，Aggrecan和维生素D受体。Aggrecan rs 1042631与TwinSpine椎间盘退变相关。这里病例中的次要等位基因频率（MAF）为.1794，对照组为0.1257 p=0.09，因此有一些建议，但对于Vit D受体rs731236，病例MAF为40.7，对照组40.3 p=0.98。最近的一篇论文（Olsen等人，《神经科学杂志》，2012年7月18日；32（29）：9831-4）指出，μ-阿片受体1（OPRM1）功能变体A188G与腰椎间盘突出症相关的疼痛强度程度有关。我们发现，OPRM1 G等位基因在匈牙利病例中的频率高于对照组（.189 vs.135）。控制频率与欧洲人群报告的频率相同，而我们汇总DNA分析中较高的病例频率可能是因为那些具有更多持续疼痛的患者被选入Genodisc。基因发现是基于对我们数据集中最大影响的研究。我们计算了与方差成比例的效应大小度量（病例和对照等位基因频率的平方差），但通过乘以p（1-p），惩罚了非常大或非常小的等位基因的频率（这些频率更容易出错，并且功率较小），其中p是等位基因频度。3.11肌肉和学校锻炼计划确定了一项特殊学校锻炼计划的功效，该计划侧重于早期预防退行性脊椎疾病，并探索与早期预防功效相关的遗传标记。在此期间，匈牙利三个城市的八所学校参与了这项研究。共有1371名学生参与了这项研究，1180名受试者在间隔6个月的情况下进行了两次测量，982名学生的家长同意进行唾液采集和DNA分析。学生们接受了体检、无创脊柱功能评估和肌肉锻炼。他们还完成了生活方式问卷调查。第一次测试后，所有学生都参加了为期6个月的专项活动，重点是训练体操中的躯干和下肢肌肉。在第二个测试期间，确定了脊柱运动的效果。其中三名学生在第一个学习年组成了对照组，当时他们在为期6个月的学习期间没有进行锻炼。这些孩子在下一学年接受了预防计划。根据标准体检方案确定姿势问题。使用12次运动试验测量肌肉状态。整个队列中的平均肌肉得分为9.1+1.7。第一次测量时，只有不到20%的儿童处于肌肉平衡状态。肌肉评分与体重、健身房数量、健身房质量以及颈部脊柱前凸、背部脊柱后凸和脊柱侧弯的存在显著相关（p＜0.05）。在为期6个月的学校预防计划后，干预组的肌肉得分显著高于对照组（10.7+1.2），而对照组没有变化。干预组的姿势问题发生率下降，而对照组在学年内脊柱曲率恶化。3.12 VDR多态性目的是研究VDR多态性与肌肉力量的关系。我们在赫尔辛基大学（合作伙伴5）使用Sequenom MassArray系统进行了一项个体基因分型研究。经过详细的文献综述和SNP选择工作，14个候选基因中有55个SNP。其中7个SNPs位于维生素D受体基因（VDR）内。我们分析了这些VDR SNP（以及由这些SNP构建的单倍型）与两种肌肉相关表型的关联；小学生的握力和背部肌肉得分。方差分析用于个体SNP分析，而对数似然比检验用于研究VDR单倍型的影响。我们在预防项目中使用了第一次测量的数据。我们在基因中鉴定了两个单倍体，并研究了这些单倍体的遗传效应。我们发现三个单独的SNP与优势手的握力显著相关，一个SNP与非优势手的握力相关。”由位于基因3'部分的三个SNP构建的ACT单倍型（rs1544410、rs731236、rs10783215）与双手握力最高有关。背部肌肉评分与一个个体的SNP显著相关（rs3782905），且无单倍体。我们的结果表明，VDR及其遗传变异在肌肉功能中起着重要作用，不同的肌肉表型可能有遗传背景。VDR变异体在退行性脊柱疾病中的生物学重要性有待进一步研究。修理3.13药物输送这项工作是与西拉齐·阿德尔教授、埃科尔理工学院、蒙特勒学院及其学生合作进行的。椎间盘感染具有毁灭性后果。为了防止此类感染的发生，在椎间盘手术之前，通常通过静脉注射预防性使用抗生素。如果出现感染，也可以通过静脉注射治疗。为了成功的预防和治疗，药物水平必须在规定的时间内保持在整个椎间盘的临界水平以上。然而，目前关于抗生素如何渗入椎间盘的信息很少；没有依据得出令人满意的药物剂量方案。因此，我们开发了一个计算模型，可以预测整个椎间盘的药物水平如何随时间变化，与椎间盘特性、药物特性和给药剂量有关。我们根据两项已发表研究的数据对该模型进行了测试，这两项研究都测量了静脉注射后血液和椎间盘中溶质的浓度。第一项研究检查了注射后6小时内放射性示踪剂硫酸盐进入动物椎间盘的情况。第二项研究检测了术前给药150分钟后手术取出的椎间盘中抗生素头孢唑啉的浓度。在这两种情况下，计算模型都很好地模拟了实验结果。因此，我们对模型进行了进一步的研究，并检查了终板钙化对药物进入椎间盘的影响。现在已经证实，与许多病例相比，退行性椎间盘终板和老年椎间盘钙化，从而阻碍了椎体血液供应进入椎间盘。模拟显示，即使终板部分堵塞，也会显著减少药物进入椎间盘的运输[14]。模拟清楚地表明，正如扩散理论所预期的那样，并与公布的实验数据一致：-（i） 进入椎间盘中心的速度很慢，需要数小时才能达到人体椎间盘中央的最大浓度。动物研究，尤其是对兔子等动物的研究，因为兔子的椎间盘比人类小得多，在很大程度上高估了药物渗透的速度和程度；（ii）静脉注射溶质后，除了靠近椎间盘边缘的区域外，即使是健康的人体椎间盘，其浓度也低于血液值，并且在使用抗生素的情况下，椎间盘的很大一部分（大于60%）没有达到抑制感染所需的浓度；（iii）退化椎间盘给药应考虑到终板途径进入椎间盘的渗透性下降；因此，穿透率和最终浓度将大大低于正常椎间盘。总之，模拟结果表明，如果没有很高的剂量或很长时间的灌注，通过静脉途径就无法将药物、生长因子或示踪剂充分注入人体大腰椎间盘。3.14选择可能受益于细胞疗法的腰痛患者。自1994年以来，细胞疗法一直用于软骨修复；开发治疗下腰痛的类似疗法现在是一个很有研究兴趣的话题。该领域的大多数研究都集中在细胞来源的选择以及如何对其进行操作，以恢复椎间盘退变引起的腰痛患者的细胞核。然而，关于患者选择的临床问题以及其他技术问题都没有太多讨论，也需要进一步研究。此外，即使椎间盘可能支持植入或刺激的细胞，目前也没有诊断手段来预测细胞治疗的成功是否会缓解患者的症状。一种诊断算法，用于选择椎间盘处于细胞治疗受益状态的腰痛患者。在细胞疗法被视为治疗退行性椎间盘疾病的常规治疗之前，一些需要解决的问题的注释如下所示，见交付文件7.31.患者选择。目前，我们无法预测谁会出现疼痛性椎间盘退变，因此预防性治疗的不确定性益处是没有根据的，需要对无症状人群进行筛查；2.和3电池需要注入阀盘，而不会进一步损坏阀盘，必须保留在阀盘中，直到固定。MRI上可识别的放射状撕裂或裂隙是排除标准4.为了使植入细胞存活，营养物质必须充足。目前只能通过延迟对比MRI进行评估，如Bydder[15]和Rajasekaran[16；17]最初所示。不适当的营养供应也是一个排除标准。5.如果细胞外环境不合适，基质生成受到抑制；许多退变椎间盘中的酸性条件和低氧是反诱导的，但目前无法进行无创性评估。6.如可交付成果6.2所示，主要大分子聚集蛋白、胶原蛋白和弹性蛋白的半衰期分别为10-100年，因此人类椎间盘基质的更换将非常缓慢，这种缓慢愈合对生活质量的影响尚未评估。如果椎间盘符合纳入标准，选择合适的细胞来源是椎间盘细胞治疗成功的先决条件之一。植入的细胞应该能够存活，而且，它们应该产生适当的富含蛋白聚糖的基质，这是髓核组织的基本特征。然而，这些细胞是否真的分化为盘细胞尚不清楚，因为目前还没有盘特异性细胞标记物。迄今为止，临床上用于椎间盘细胞治疗的细胞来源包括自体椎间盘干细胞和间充质干细胞。尽管美国和德国向患者提供了一些细胞产品，但这些产品尚未完全表征或用于随机对照试验。事实上，最近有几份出版物表达了对全球许多医学领域未经证实的细胞治疗（尤其是“干细胞”治疗）程序繁荣的担忧[14,15]。除了与细胞存活和疗效有关的问题外，将这些细胞用于细胞治疗本身也是一个挑战。除了细胞植入外，细胞治疗还可以刺激常驻细胞。生长因子在治疗退变椎间盘中的应用引起了人们的兴趣，因为它们已被证明在体外和一些体内模型系统中对椎间盘细胞具有潜在的有益作用。我们已经证明，来自纤维环和髓核细胞的人椎间盘细胞对生长因子有反应，如血小板衍生生长因子（PDGF）、胰岛素样生长因子（IGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）和转化生长因子-ß（TGF）通过激活细胞内信号传导途径（即MEK/ERK和PI3K/Akt途径）以及随后的细胞增殖。有趣的是，这些途径在活体椎间盘标本中也被激活，很可能是对外源性和自分泌生长因子的反应。PRP是由富含血小板的血液成分制备的，释放出大量不同的生长因子。PRP制剂是可变的，但它们被接受为治疗选项，广泛用于不同的临床应用，以促进不同结构组织的再生。我们观察到PRP对NP细胞软骨分化的积极作用，但我们将添加PRP的培养基与添加TGFß1的分化培养基进行了比较，结果表明，PRP培养基对MSCs和NP细胞的软骨分化作用较弱（在基因表达和蛋白水平上均显示）。PRP对增殖的影响大于对分化的影响。该研究发表在《组织工程与再生医学杂志》上[18]。因此，如果细胞增殖是理想的结果，自体PRP是最便宜和最安全的选择，但对某些患者可能无效；PDGF是最有效的，但价格昂贵。然而，如果没有健康和功能性细胞，注射生长因子的治疗效果将无法实现。使用上述标准，我们评估了Genodisc项目招募的一些患者队列中适合细胞治疗的比例，作为下文所述患者队列的总体指标。我们发现，在应用排除标准后，三级脊椎中心的腰痛患者中仅有10%以上的腰椎间盘残留，因此可以考虑采用生物疗法通过修复或再生髓核（NP）来治疗退行性椎间盘疾病。从6个采集点招募了2000多名患者（英国牛津、凯特琳和奥斯维斯特里，意大利米兰，斯洛文尼亚卢布尔雅那和匈牙利布达佩斯）。每位受试者的6个腰椎水平（T12-L1）的临床MR图像由一位经验丰富的放射科医生（合作伙伴3）进行评分。使用数字量表对28个特征进行评分，包括裂隙或疝气破坏环完整性的标记。通过复制大于80个脊柱的评分来评估评分的可靠性。MRI中每个等级的椎间盘数量是从具有代表性的脊椎亚组中计算出来的。使用Pfirmann分级方案，通过退行性变等级评估任何类型的椎间盘突出（即突出、挤压、分离）或环状撕裂的椎间盘中的比例。不同欧盟国家的三级脊柱中心的转诊模式存在差异。由于有资格接受细胞治疗的患者比例因中心而异，我们将Genodisc患者分为两组。队列1包括仅从意大利招募的患者，其中54%患有腰椎间盘突出症。队列2包括从英国和匈牙利招募的患者，其中24%患有腰椎间盘突出症。队列2患者中中度（4级）和重度（5级）椎间盘退变的比例明显高于队列1，尽管从任何一个队列来看，大多数检查的椎间盘都被归类为1级或2级。Pfirrmann 1级或2级椎间盘无病理变化，一般不认为是疼痛的来源。因此，评估的大多数椎间盘都不适合作为细胞治疗的靶点。每个队列中纤维环破裂的椎间盘百分比随着退变程度的增加而增加；这些有环裂的椎间盘不适合用于NP修复的细胞治疗，因为任何撕裂都可能导致细胞产物渗入椎间盘。很少有1级或2级椎间盘出现环破裂，但更退化的椎间盘并非如此。一般来说，3级和4级椎间盘环完整性丧失的百分比相似，但5级椎间盘中的百分比较小，这可能是因为在严重退变的这个阶段，椎间盘几乎塌陷，MRI无法区分任何特征。我们通过Pfirrmann等级评估了队列1和队列2中存在环状撕裂的患者椎间盘的比例（通过MRI测量，可能低估了他们）；队列中47%的3级椎间盘和队列2中30%的3级腰椎间盘不适合细胞治疗。此外，常驻细胞和植入细胞都必须有足够的营养供应，才能存活、发挥功能并修复/恢复椎间盘[20]。在退行性椎间盘中，营养物质进入椎间盘的途径减少，病理变化干扰营养物质进入腰椎间盘。如果常驻细胞不能正常工作，或因缺乏营养而死亡，任何植入的细胞都将遭受同样的命运。因此，在确定细胞治疗方法对任何特定患者是否可行时，必须有一些评估营养供应的方法，因为退化椎间盘营养供应的减少可能是任何形式细胞治疗成功的主要障碍之一。在这里，我们使用已发表的方法，通过对比后MRI评估了222个单独椎间盘的营养途径[15；21]。简单地说，静脉注射造影剂（CM）后，CM扩散到椎间盘后，测量与MRI信号对比前注射相关的增强程度随时间的变化。然而，并非所有3级椎间盘都有足够的营养供应。在提倡细胞治疗之前，需要进行单独的诊断测试，以评估每个患者可能的营养流。我们将上述数据汇总在一起，以计算Genodisk项目中招募的适合细胞治疗的患者百分比，即不因瓣环破裂或椎间盘营养不足而被排除在外。结果是，仅超过10%的Genodisc患者符合基于MRI结果的细胞治疗纳入标准（当然，由于其他原因，它们也可能不合适）。结论。目前，很少有诊断或预后测试可用于确定髓核修复的细胞疗法是否可能成功。尽管背痛和椎间盘退变之间有着密切的联系，但许多人，即使是椎间盘严重退变或椎间盘突出的患者，都是无痛的[6；22]。此外，有证据表明，通常存在疼痛的中央处理，即驱使患者前往诊所的症状，或神经性疼痛的发展[23；24]。去除病理来源可能不会消除疼痛，如果要有效使用细胞疗法，必须比针对3级退化椎间盘更精确。此外，人椎间盘基质半衰期很慢，部分原因是即使在健康人椎间盘中细胞密度也很低；植入细胞的基质再生需要数年而不是数月[25-27]，需要考虑这一漫长过程中的生活质量和康复问题。在研究其在临床应用的可行性之前，以治疗退行性椎间盘疾病为目的的细胞治疗是一个非常有吸引力的概念。仍有许多障碍需要克服。其中一些远远超出了我们目前的能力。目前，还没有可接受的诊断方法来确定单个患者是否可以从细胞治疗中受益。这需要在理解背痛方面取得重大进展，而背痛在过去一个世纪里一直受到严重调查的挑战。植入细胞逆转退变过程并修复椎间盘的潜力仍有待确定。此外，应该认识到，通过细胞疗法进行椎间盘再生和修复可能非常缓慢，应考虑植入后的适当康复方案。考虑到这里讨论的所有因素，很难看到细胞疗法如何被引入广泛的常规临床实践中来治疗“退行性椎间盘疾病”。此外，由于需要大量扩大细胞来源，椎间盘细胞治疗可能是一项昂贵的手术[28]。这些问题对于指导背痛研究稀有资源的分配应该具有相关性。也许应该引导他们更好地了解背痛患者的疼痛机制，以便我们更好地了解在哪里以及如何针对治疗策略。潜在影响：4.1影响，包括社会经济影响和更广泛的社会影响腰痛是所有社会（包括欧洲社会）的主要经济和社会负担，也是世界范围内长期残疾的主要原因[1]。尽管经济成本很高，但对于抑郁症、冠心病和糖尿病等其他主要致残原因的研究却很少。PubMed最近的一项搜索（2013年4月）发现，与糖尿病（430969）相比，腰痛（43973）的出版物减少了10倍，而抑郁症（287853）和冠心病（244761）的出版物则减少了5倍。治疗是任意的，因中心而异，大约80%的背痛病例没有明确的诊断[29]。因此，任何旨在提高对背痛相关疾病的病因和进展的了解，并澄清不同途径的诊断的研究都有可能对这一重大医疗和社会问题的治疗和预防产生重大影响。改善背痛的治疗也将带来显著的经济效益，因为背痛的成本不仅包括治疗成本，还包括残疾补助金的成本以及因慢性背痛袭击工龄人群而导致的生产力损失[30]。腰痛、冠心病和糖尿病是最昂贵的疾病之一；2000年，英国的成本约为120亿英镑，估计约占欧盟国家GDP的1.5%[31]。在英国，初级水平下腰痛的健康治疗费用是对照组的两倍多[32]，并且没有考虑到非处方药物和使用脊医或其他辅助医学方法的干预。由于腰痛是导致残疾的主要原因，它破坏了患者的生活质量并影响了他们的家庭。患有慢性腰痛的人通常都是失业者，经常情绪低落。腰痛对日常生活、就业、运动和家庭参与的所有活动以及整体情绪和文化福祉产生影响。因此，它显著降低了患者的生活质量，影响了社会中很大一部分人，并增加了其福利负担。在Genodisc进行的这项研究极大地增加了对背痛疾病的现有知识，并将以多种方式影响对背痛进展和治疗的理解。因此，它有潜力改进诊断，提供合理治疗手段，提供切实可行的经济可行的预防手段，从而影响这一重大疾病的经济和社会成本。主要研究影响如下所述。（i） 澄清背痛表型。目前，背痛经常与“退行性椎间盘疾病”一词混为一谈。这个非特异性术语无法区分从椎间盘突出症到椎管狭窄和脊椎病等疾病，所有这些疾病都遵循不同的途径，需要不同的治疗方法。病理学也被混淆了，因为不同的术语，例如疝气和突出，可以用于相同的病理学。因此，明确定义感兴趣的复杂表型有明显的好处。此外，除非表型明确定义，否则很难揭示疾病流行病学的统计基础，尤其是其遗传基础。《欧洲脊柱杂志》[33]上发表的一项研究回顾了Genodisc中的临床表型特征。基因组通过明确定义临床表型及其共病性，为合理的流行病学和遗传学研究以及改进诊断和治疗提供了基础。（ii）诊断方面的进展。目前的诊断方法主要集中在椎间盘及其退行性改变上，通常以退行性分级编纂而成，但却忽略了可能导致疼痛和病理变化的许多特征。除了临床检查外，脊椎MRI被用作主要的诊断工具，但几乎无法区分症状性和非症状性变化。椎间盘造影术是诊断椎间盘源性疼痛的主要工具，但它无法预测临床结果。目前的诊断手段明显不足。未来的一种潜在替代方案是微型传感器，可插入光盘并用于无损检测，以定量诊断光盘的状态。在Genodisc，开发了许多这样的传感器。其中一人测量了椎间盘细胞的存活率。了解细胞是否有活细胞对于了解椎间盘健康的长期前景以及是否可以使用生物椎间盘修复方法至关重要。另一种传感器用于测量MMP13，MMP13是一种参与椎间盘基质降解的主要酶。原则上，所开发的方法可适用于测量其他降解酶、炎症分子、基质降解产物以及参与伤害性作用的缓激肽等分子。还开发了一种传感器，用于测量椎间盘的膨胀压力和渗透压[10]。该参数对于维持适当的椎间盘生物力学行为和椎间盘高度至关重要；肿胀压力下降是椎间盘退变的第一个征兆之一。此设备可能是一个重要的诊断工具。新型MRI技术也有潜在的诊断用途。其中，最有用的是增强后MRI。静脉注射造影剂，监测椎间盘对比度随时间的变化。对比剂介质进入椎间盘是维持细胞活力所需营养物质运输的标志，是评估椎间盘是否有足够的营养供应，从而判断椎间盘能否维持活细胞的微创方法。在Genodisc中，使用此方法评估了222个椎间盘，发现严重退化的椎间盘营养物质运输受到干扰，但轻度退化的椎之间盘营养物质传输没有受到干扰。因此，该方法为评估椎间盘退变的可能途径和评估生物修复的可能性提供了潜在的诊断工具。新生物力学方法。目前对腰痛的治疗是基于这样的假设，即轻度退化的椎间盘在机械上不稳定，并导致腰痛，因此融合或稳定轻度或中度退化的椎间盘将缓解疼痛。因此，已经开发出多种稳定脊柱的装置，脊柱融合被视为黄金标准治疗。然而，融合并不一定能减轻疼痛；实际上，随机对照试验表明，非手术治疗的结果与融合治疗的结果相同[34；35；35]。Genodisc对111名捐赠者采集的203个运动节段的大型体外结果数据库进行了分析，结果表明，在大多数情况下，随着退化程度的增加，屈曲/伸展和侧向弯曲的稳定性增加[8]。然而，一些轻度退化的运动节段表现出不稳定性。这些发现应该对动态稳定系统和融合的使用产生影响；它们的使用应限于实际证明不稳定性的情况。降解途径退变是由构成椎间盘基质组织的基质大分子降解及其生物力学功能调节引起的。因此，了解退化途径对于任何旨在防止进一步退化或逆转和修复退化组织的合理干预都至关重要。退化显然是一个细胞过程。虽然双胞胎研究表明椎间盘退变是由强烈的遗传因素引起的，但其发病机制尚不清楚[36；37]。椎间盘退变的进展涉及基质降解相关因子的上调[38]、膨胀压力的丧失[39]和基质破坏。基因组研究通过以下方式影响了对退化的生化和分子过程的理解。使用天冬氨酸外消旋法测量组织周转率，发现构成基质的分子即使在降解时也具有长寿命。研究发现，主要组成基质大分子的分子周转率特别缓慢，尤其是胶原蛋白。在正常的人类生命周期内，这种缓慢的转换可能会损害正常生理功能所必需的椎间盘细胞外基质的结构完整性。弹性蛋白[40]和胶原蛋白[26]一样，在健康和退化的人类椎间盘中代谢稳定且长寿，后者有一些新合成的迹象，可能是为了修复这种结构分子。因此，D-天冬氨酸含量可以作为整体老化过程的新标记。在Genodisc中，我们研究了可诱导炎症和分解代谢细胞表型的应激。一般来说，机械应激本身倾向于促进基质生成，但当与更生理环境相结合时，其他因素，如细胞外pH值、氧气和特别是渗透压，则倾向于改变细胞对机械应激的反应。事实上，我们发现，在生理渗透压下，相同的机械应力可以上调基质的生成，但在退化组织的渗透压下会下调基质的生成[41]。这一发现对实验设计有重要影响，表明除非考虑到适当的环境条件，否则可能会报告对外部信号的响应，例如来自受环境条件制约的机械应力或生长因子区域的信号和误导性响应。Genodisc的研究还表明，渗透压是调节细胞行为的一个非常重要的信号。渗透压直接由聚集聚糖的浓度调节；退变椎间盘的渗透压较低，因为aggrecan降解并在椎间盘退变中丢失。结果表明渗透压和聚集蛋白在调节细胞活性和维持组织稳态方面的重要性；聚集蛋白聚糖浓度的下降导致基质降解蛋白酶的上调，从而产生前馈分解代谢级联反应。因此，任何途径引起的聚集蛋白聚糖丢失都会推动椎间盘退变的进展。此外，体内健康椎间盘的高渗透压通过延迟细胞周期中G2/M和G0/G1期的细胞具有抗增殖作用[42]，并且可能是椎间盘退变中细胞簇形成的一个因素。椎间盘细胞中的细胞衰老已被证实。衰老细胞表现出“促炎症”表型，以基质金属蛋白酶、生长因子、细胞因子和其他炎症分子的过度表达为特征。由于这种“促炎症”表型，衰老细胞会对组织更新和正常功能产生不利影响，因此它们可能会促进衰老过程和与年龄相关的病理学发展。在Genodisc中，我们已经表明外源性应激，特别是氧化应激和渗透应激会导致椎间盘细胞过早衰老，并加速IVD细胞的衰老过程。当这些细胞表达促炎表型时，这些应激会导致组织退化。因此，对Genodisc的基础研究提高了对导致椎间盘退变的细胞和分子途径的理解，并可能对预防和治疗退变相关疾病产生影响。遗传基础椎间盘退行性变是一种强烈的遗传性疾病，已有许多关于人群的候选基因研究[43]。然而，关于患者队列的研究很少，因此与症状性椎间盘退变而非无症状性椎间盘退变相关的基因尚未得到任何深入的研究。在Genodisc中，数据库中的所有患者都可以获得DNA。迄今为止，我们已经对仔细进行基因分型的患者进行了一项综合GWAS，并确定了[49]种与疼痛性椎间盘突出症相关的新基因变体，DNA可用于进一步研究。因此，基因组有可能影响对椎间盘退变相关疾病遗传基础的理解。维修排除标准以治疗退行性椎间盘疾病为目的的细胞治疗是许多研究的焦点，因为用针将细胞或药物插入椎间盘是一种极具吸引力的微创治疗方法。大多数工作都集中在开发合适的细胞源和支架上。目前很少有人研究临床问题，例如哪些患者应该接受治疗，细胞能否存活，生成基质，修复患者退化的椎间盘。Genodisc的研究表明，如果椎间盘有裂缝或环状撕裂，注射到椎间盘的材料一旦被加载就无法保留在组织中。因此，一旦患者坐起来或站起来，MRI上任何有明显环形破裂的椎间盘都无法维持注射材料。因此，细胞疗法将不得不使用环密封或其他侵入性手术的方法，从而失去了大部分吸引力。因此，椎间盘环破裂被排除在微创细胞治疗之外为了使椎间盘细胞存活并发挥功能，它们需要充足的营养供应。营养物质由椎体的血管供应至无血管盘核，这些血管穿过软骨下板，终止于软骨终板的毛细血管环。在退变的椎间盘中，软骨终板趋向于钙化，从而限制营养物质向椎间盘细胞的传递，从而限制细胞的生存能力[20；44]。我们检查了Genodisc中222个椎间盘的营养供应，结果表明，尽管正常椎间盘和轻度退化椎间盘中的营养途径相似，但正如其他人所见，退化椎间盘中的营养路径也受到干扰[17]。由于植入的细胞无法存活，任何干扰营养途径的椎间盘都应排除在使用细胞疗法的治疗之外。因此，基因盘有可能通过提供诊断方法来确定哪些患者可以从细胞治疗中受益，从而影响治疗椎间盘变性的细胞疗法的发展。值得注意的是，在我们数据库中检查的椎间盘中，大约90%的潜在症状椎间盘不符合这些纳入标准。还应注意，即使椎间盘可以支持细胞治疗，也应证明这种治疗的临床益处。年轻人的预防。众所周知，腰痛是年轻人的一个问题。在Genodisc，制定了一项运动计划，用于早期预防退行性脊柱疾病。脊椎疾病与躯干肌肉无力有关，因此制定了一项锻炼计划来加强躯干肌肉。在此期间，匈牙利三个城市的八所小学参与了这项研究。共有1371名学生被纳入研究。经过6个月的旨在加强躯干肌肉的锻炼，与对照组相比，锻炼组的肌肉力量显著增加。干预组的姿势问题发生率下降，而对照组在学年内脊柱曲率恶化。总体而言，由于预防计划，脊柱整体功能能力有了显著改善。该项目有可能对年轻人的脊柱问题产生影响；它表明，一个简单、易于管理的锻炼计划可以在6个月内显著提高整体脊柱功能能力。4.2传播活动Genodisc联盟的研究传播（i） 通过同行评审的科学论文和评论、书籍章节、脊椎期刊的社论、科学会议上的口头和海报演示、出版的摘要、邀请的全体讲座、博士论文、，（ii）通过有关背部疼痛主题的研讨会、报纸文章、学校讲座与公众交流。（iii）通过医院海报、针对背痛患者的研讨会、患者传单与患者沟通。4.3成果利用（1） 光盘数据库、DNA和血清样本数据库。该匿名数据库提供了2500多名慢性背痛患者的独特资源。该数据库包含300多个项目的信息，包括临床表型、定量和定性MRI评估、患者特征，如年龄、性别、职业、种族、合并症和问卷答案。原始的匿名核磁共振成像仪也可以在光盘上找到，以供进一步研究。该数据库可供所有Genodisc合作伙伴进行相关研究。所有患者均提供血液或唾液样本以提取DNA。该DNA已用于汇集和验证研究。每个中心负责储存患者的DNA。目前没有提出进一步的研究。预计随着技术的进步，基因测序的成本下降，对表观遗传变化的理解增加，仔细表型和成像患者的DNA将为揭示椎间盘退变和背痛发展的遗传背景提供宝贵的资源。可获得部分英国患者的血清样本，并妥善保存，以评估血清生物标记物。同样，这是一种宝贵的资源，只有当信息和成本提供适当的指示时才会使用。这些资源领域也向外部研究人员开放，其基础是通过后基因组指导委员会提交的研究提案。该指导委员会将维护数据库，并监督与Genodisc工作相关的研究和出版物。2.预防这项旨在加强躯干肌肉，从而改善全身脊柱功能，减少青少年背痛的机会的学校运动，将在匈牙利所有小学中推广。将对长期结果进行随访，以观察疗效是否可以维持，年轻人的背痛发生率是否降低。如果这种简单、易于管理的运动计划能够成功预防背痛，那么潜在的影响就很大。3.诊断。Genodisc开发了基于针头的诊断设备，用于测量细胞活力、MMP13水平和渗透压。然而，最初于2009年发表的关于椎间盘造影术长期效果的研究[45]表明，椎间盘成像过程包括使用针头穿刺椎间盘并在压力下注射造影剂，可能会加速椎间盘退变和突出。因此，目前这些设备无法用于患者的诊断，除非确定针刺是否会像一些动物研究表明的那样促进退化，或者注射压力和/或造影剂的存在是否会导致问题。然而，这些设备在体外和动物研究中具有相当大的潜力，因为数据可以非破坏性地获得，从而减少了实验动物的数量，加快了体外实验研究。网站列表：http://www.physical.ox.ac.uk/genodisc/index.html 相关文件 最终报告-GENODISC（椎间盘退变相关病理学：靶向治疗和修复的新生物标记物和诊断）
