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介绍

结直肠癌（CRC）是最危险的癌症之一人类恶性肿瘤，是第三大常见癌症在美国男性和女性中都有诊断。根据美国癌症协会将有106970例新的癌症病例美国结肠癌和46050例直肠癌新病例2023年各州(1)。CRC很常见，尤其是在经济发达国家随着生活方式的改变，如当前的饮食习惯吸烟率、缺乏锻炼和超重和肥胖人数(2)。CRC复发的可能性很高术后5年生存率低转移(三)。化学治疗药物是CRC患者最常用的治疗方法多种情况。然而，这些疗法会导致剂量限制性副作用，包括延迟腹泻，胃肠道粘膜炎、中性粒细胞减少和骨髓抑制(4)。因此，开发副作用少的新型有效抗肿瘤药物仍然至关重要。

已经证明细胞周期阻滞取决于DNA损伤信号通路的激活也会影响癌细胞的增殖(5)。此前的研究报告称选择性靶向参与细胞分裂或凋亡的调节对肿瘤生长或肿瘤支持环境的影响细胞，同时对正常细胞影响最小(6——8)。这个识别能够抑制细胞周期和诱导凋亡在潜能开发中显示出希望CRC治疗药物。许多研究表明内质网应激作为一种分子起着至关重要的作用癌症治疗的机制。药物刺激后，展开蛋白质可以积聚在细胞质中，从而导致ER应力的启动(9，10).持续的内质网应激激活PERK下游信号eIF2α，导致蛋白质翻译受到抑制；这最终导致细胞损伤和凋亡(11).

本研究合成了一种新型小分子化合物，1-[（4-乙氧基苯基）氨基]-7a，11a-二氢-3H-萘酚[1,2,3-de]喹啉-2,7-二酮（化合物225#），并进行了探索化合物225#是否能同时抑制CRC的增殖在体外和体内.本研究进一步讨论了机制，以确定它是否可以被认为是CRC治疗或佐剂的潜在候选药物治疗。

材料和方法

试剂和抗体

P21的一级抗体（类别号2947T），细胞周期蛋白B1（目录号4138T），磷酸化（p）-检查点激酶2（CHK2）（分类号2197T）、CHK2（分类号2662T）、p-ATR（分类号。2853T）、ATR（分类号2790S）、p-BRCA1（分类号9009T）、BRCA1（分类号。编号9010T），γ-H2A。X（产品目录号9718T），H2A。X（目录号7631T），p-P53（分类号9286T）、P53（分类号92 82T）、P27（分类号2552T）、，S相激酶相关蛋白2（SKP2；目录号4358T），PARP（目录编号9542T）、PUMA（目录编号4976T）、calnexin（目录编号2679T）、，蛋白质二硫键异构酶（PDI；目录编号3501T），p-eIF2α（目录。编号3398T）、eIF2α（目录编号5324T）、PERK（目录编号5683T）、，泛素（Ub；分类号20326T）和LC3B（分类号3868T）分别为从Cell Signaling Technology，Inc.购买。；初级抗体针对α-微管蛋白（分类号AF0001）和CDK1（分类号AF0111）从贝约泰姆生物技术研究所购买；和主要购买了抗细胞周期蛋白A1（分类号13295-1-AP）的抗体来自Proteintech Group，Inc.。所有主要抗体均为用西方一级抗体稀释液（cat.no。AZ100；Beyotime生物技术研究所）。抗兔IgG（DyLight™800 4X PEG共轭物；目录号5151P）和抗鼠IgG（DyLight™680共轭；猫号5470P）二级抗体获得自Cell Signaling Technology，Inc.（1:15000）。MTT（猫。编号ST316），BeyoClick™EdU-594细胞增殖检测试剂盒（分类号C0078S），0.5%结晶紫（分类号CO121），丙碘化物（PI；目录号ST512）、核糖核酸酶A（目录号ST578）、膜联蛋白V-FITC（目录号C1062S）和BCA试剂盒（目录号P0010）购自Beyotime生物技术研究所。二甲基亚砜（DMSO；目录号D2650）和聚偏二氟乙烯（PVDF）膜购自MilliporeSigma。

化合物225的合成#

化合物225#的合成如所示图1氯乙酰氯（1.5当量）添加到1-氨基蒽醌化合物1的搅拌悬浮液中苯中（1当量）。将混合物在70°C下搅拌12小时通过过滤分离沉淀物，然后用饱和NaHCO三，去离子水和乙醇。这个将黄色化合物2在真空下干燥24h，得到89%的收益率。随后，化合物2和三乙胺的混合物（3 eq）在乙醇中回流12 h冷却至室温，置于4°C。固体沉淀被过滤掉，用少量冷水清洗乙醇和空气干燥后得到化合物3（15%产率）。为了获得化合物225#，化合物3（1当量），4-乙氧基苯胺（1eq）和无水醋酸钠（1 eq）在190°C下加热12h.冷却后，向反应混合物中添加水固体从硝基苯溶液中过滤出来，然后干燥和重结晶，目标化合物的产率为获得7%。1H和13测量了C NMR在Bruker 400光谱仪上（Bruker Corporation）(图S1).

图1。 综合战略化合物225#。

细胞培养

人结肠癌细胞系HCT116和SW620，以及正常人结肠细胞系FHC和293T细胞取自美国类型培养物收集。HCT116细胞在McCoy的5a培养基（cat.no.16600108）中培养补充10%胎牛血清（FBS；目录号10100147，澳大利亚原产）（均来自Gibco；Thermo Fisher Scientific，股份有限公司）。SW620细胞在高糖DMEM（cat.no。SH30022.01；杂交克隆；Cytiva）补充10%FBS.FHC细胞在DMEM:F12K培养基（cat.no.11330032；Gibco；Thermo Fisher Scientific，Inc.）补充10%FBS（目录号。10100147；原产澳大利亚；吉布科；赛默飞世尔科学公司），10 ng/ml霍乱毒素（分类号HY-P1446；MedChemExpress），0.005mg/ml胰岛素（分类号I9278；MilliporeSigma），0.005 mg/ml转铁蛋白（目录号T3309-1；MilliporeSigma）和100 ng/ml氢化可的松（分类号H0888-500；MilliporeSigma）。所有细胞均为在37°C的培养箱中培养，湿度为5%一氧化碳2.

细胞活力测定

细胞活力和IC50的值采用MTT法测定化合物225#的含量。HCT116和SW620细胞被计数，并以96-well板的密度播种1×10三细胞/孔，含200µl完整培养基。之后预孵育12小时后，将细胞暴露于不同的化合物225#（0、1.5、3.1、6.25、12.5、25、50、，100和200 nM），在37°C下持续1-4和5天。评估细胞活性，向每个溶液中添加20µl MTT溶液（PBS中为5 mg/ml然后将培养基移除，并添加200µl二甲基亚砜以溶解甲素晶体。将板搅拌10分钟，然后将光学使用微孔板阅读器（BioTek Instruments，Inc.）。这些实验是重复三次，增殖抑制曲线和集成电路50值是使用GraphPad Prism 5生成的（点处理）(12).

EdU染色分析

使用BeyoClick™评估细胞增殖EdU-594细胞增殖检测试剂盒。CRC细胞系（SW620和HCT116）被计数并以96-well板的密度播种1×104细胞/孔，含200µl完整培养基。12小时后预孵育的SW620和HCT116细胞用0，12.5、25和50 nM化合物225#在37°C下放置24小时。随后，将EdU添加到每个孔中，并在37°C下培养2 h，然后通过在室温下用Hoechst 33342染色30分钟。使用高含量分析进行分析System-Operetta CLS™（PerkinElmer公司）。

集落形成分析

菌落形成试验用于评估在里面体外用化合物225#的指示浓度。简单地说，CRC细胞系（SW620和HCT116）以1×10三细胞/孔置于2ml培养基中。培养12小时后，用0、6.5、12.5和25 nM处理SW620和HCT116细胞化合物225#在37°C下放置10天。随后，细胞被用PBS洗涤两次，并用4%多聚甲醛固定30分钟在室温下。经过另一轮清洗，细胞用0.5%结晶紫染色（分类号C0121；Beyotime生物技术研究所）在室温和检查菌落形成（菌落定义为>50单元格）。过量的结晶紫被冲走，菌落使用Epson扫描仪（Epson公司）。

细胞周期分析

化合物225#对细胞周期的影响使用流式细胞仪（Accuri™C6；BD）评估分布生物科学）。接种SW620和HCT116细胞在密度为2×10的6厘米培养皿上6细胞/培养皿。隔夜培养后，用不同的化合物225#（0、25、50和100 nM）在37°C。随后，将细胞固定在70%冰镇乙醇中4°C 24小时，再悬浮在含有1µl PI（5）的200µl PBS中mg/ml）和1µl RNase A（5 mg/ml），并在黑暗中培养3037°C时最小值。使用流式细胞术测量PI荧光数据通过FlowJo7.6软件分析得到（FlowJo有限责任公司）(4).

流式细胞术分析细胞凋亡

将SW620和HCT116 CRC细胞接种在6 cm培养皿（2×106细胞/培养皿）。经过一夜的培养，用化合物225#（0、50、100和200 nM）培养细胞在37°C下持续48小时。收集细胞后，用冰镇PBS，然后再悬浮在含有5µl PBS的200µl中Annexin V-FITC和5µl PI（50µg/ml）。在黑暗中孵化后在室温下保持15分钟，使用流式细胞仪（Accuri™C6；BD Biosciences）和数据通过FlowJo7.6软件分析获得。

荧光观察m樱桃-GFP-LC3B

为了进一步研究化合物225#是否能够调节自噬流量的进展，HCT116细胞感染了双标记mCherry-GFP-LC3B报告子pH敏感。这允许对融合进行评估自噬体和溶酶体的效率。使用慢病毒感染后，HCT116细胞稳定表达mCherry-GFP-LC3B（cat。编号P4837；武汉妙龄生物科技有限公司）成立。这个mCherry-GFP-LC3B，Pspax2（分类号P0261；武汉妙凌生物科技Science）和pMD2G（目录号JY03028；南京江源生物技术有限公司）载体共转染到293T使用Lipo8000™转染试剂以1:1:1的比例培养细胞（分类号：C0533；Beyotime生物技术研究所）。遵循在37°C下培养72小时，提取慢病毒颗粒然后在HCT116细胞培养基中感染的多重性为~10，增加了10µg/ml聚布伦。在37°C下24小时后，更换培养基，并添加10µg/ml用嘌呤霉素筛选稳定表达mCherry-GFP-LC3B载体。细胞在6厘米内隔夜生长培养皿（2×106细胞/培养皿）化合物225#（0、25、50和100 nM）在37°C下放置48小时，之后，在室内用4%多聚甲醛固定30分钟温度，用PBS和高含量洗涤数次分析系统-Peretta CLS™（PerkinElmer，Inc.）用于分析数据。

蛋白质印迹

用化合物225#（0，50，100）处理后和200 nM）在37°C下24小时，SW620和HCT116人CRC细胞收集并添加到裂解缓冲液中（分类号P0013；Beyotime含蛋白酶抑制剂的生物技术研究所；30之后在冰上放置min，样品在4°C下以16602×g离心15分钟。使用BCA试剂盒评估上清液。随后，等量的蛋白质被用8–15%SDS-PAGE分离，转移到PVDF膜和在室温下用5%脱脂牛奶孵育1小时，然后在4°C下与初级抗体隔夜培养。膜用TBS-0.5%吐温漂洗，然后与二级抗体在室温下持续1h。最后，在Tanon 5200成像系统（Tanon科技有限公司）。条纹的灰度为由ImageJ 1（美国国立卫生研究院）分析目标蛋白的表达水平使用α-微管蛋白作为参考。

异种移植小鼠模型

共30只裸鼠Balb/c雌性小鼠（年龄4-6岁周；重量，约20 g），从湖南SJA实验室获得Animal Co.Ltd.将小鼠培养在特定的无病原环境中动物室，置于温度为28°C的通风笼中湿度为50%，在光照10小时和黑暗14小时下假如随意获得足够的食物和水。这个实验程序是在2.5%以下的动物身上进行的异氟烷气体麻醉。皮下注射HCT116细胞(5×106细胞）在裸鼠上进行建立异种移植模型。当肿瘤达到平均水平时体积~100 mm三，30只小鼠随机分为三组（n=10/组），如下所示：对照组（0 mg/kg），和10和30 mg/kg化合物225#组。化合物225#组以10或30 mg/kg的化合物灌胃给药225#溶于100µl溶剂（5%二甲基亚砜，30%聚乙二醇300，10%吐温-80和55%生理盐水）。药物服用疗程为6天（连续三天每天一次，之后三天退出），并进行了五个疗程。肿瘤长度（L）和每3天使用游标卡尺测量宽度（W），并且使用标准公式计算肿瘤体积：（L×W公司2)/2. 32天后，所有小鼠被安乐死颈椎脱位，切除肿瘤并称重进一步分析。

统计分析

使用GraphPad Prism 5.0和SPSS 18.0（SPSS，Inc.），表示为at的平均值±SD至少三个独立实验。统计分析为使用单向方差分析进行两个以上的比较然后进行Tukey的事后测试。考虑了P<0.05以显示统计上的显著差异。

结果

化合物225#抑制CRC细胞的体外增殖

研究化合物225#对人CRC细胞、HCT116和SW620细胞的作用是用化合物225处理1-4天和5天，以及细胞活性通过MTT法测定。集成电路50化合物225的值#HCT116和SW620电池如所示表一。如所示图2A，人类CRC细胞的生存能力呈剂量和时间依赖性降低。此外，化合物225#对人直肠粘膜细胞（FHC）几乎没有影响浓度相同(图。2安培)表明其对正常细胞毒性低。同样，集落形成实验证明化合物225能够以有效减少剂量依赖性方式(图2B).与对照组相比，EdU阳性数细胞数量显著减少，呈剂量依赖性暴露于化合物225#(图。2摄氏度)从而表明化合物225#具有抑制HCT116和SW620细胞的增殖。这些结果建议化合物225作为抑制人CRC细胞的增殖。

图2。 化合物225#抑制CRC细胞增殖和生存能力。（A） 通过MTT评估细胞活力化验。（B） 化合物225#对SW620克隆形成的影响采用集落形成试验对HCT116细胞进行分析。（C） 在SW620和HCT116中进行EdU荧光染色化合物225处理后的细胞。比例尺，100µm。数据表示为三个独立实验的平均值±SD。***与对照组（0 nM，HCT116）相比，P＜0.001，***P＜0.0001。##与Ctr组相比，P<0.01，###P<0.001（0nM，SW620）。控制中心。

表一。 化合物的IC50值结直肠癌细胞系中225个。

表一。

化合物的IC50值结直肠癌细胞系中225个。

	集成电路50，纳米
细胞系	1天	2天	3天	4天	5天
HCT116型	277.400	20.630	7.803	5.688	3.261
SW620型	114.600	21.110	19.100	8.863	6.750

化合物225#诱导细胞周期G2/M期阻滞

为了进一步阐明本研究考察了225#化合物的抗CRC作用它对细胞周期进程的影响。流式细胞术显示化合物225诱导了G中的单元格数2/培养24小时后的M期(图3A)。值得注意的是，100 nM化合物225#增加了G中SW620单元的数量2/M相68.8%，S期细胞数减少36.4%与对照组比较。同样，用100 nM化合物225#诱导了G中HCT116细胞的数量2/M相和明显的与相比，S期细胞数量减少（21.3%）控件中的(图3A)。收件人进一步评估其对有丝分裂进程的影响细胞周期相关蛋白的表达水平通过西方印迹法。细胞周期蛋白A1、B1、，与225#化合物相比，CDK1和SKP2减少与对照组相比P21和P27呈剂量依赖性增加(图3B)。根据这些数据，化合物225#可能通过调节键抑制人CRC细胞增殖G中的分子2/M相。

图3。 化合物225#诱导G2/M人类CRC细胞系中的细胞周期阻滞。（A） 细胞周期流式细胞术分析其分布。（B） 细胞是用指示浓度的化合物225#处理24小时h、 G2/M转换相关的表达水平蛋白质用westernblotting进行评价。（C） 磷酸化western评估了DNA损伤相关蛋白的水平吸墨纸。α-管蛋白被用作负荷控制。（D） 灰色值显示了相关蛋白带。数据显示为平均值±标准偏差。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。CHK2，检查点激酶2；Ct，对照；p-，磷酸化；SKP2，S相激酶相关蛋白2。

据报道，细胞周期阻滞取决于关于DNA损伤途径的激活(4)。因此，DNA损伤相关蛋白用western blotting检测以评估DNA损伤是否存在于CRC细胞中。正如所料，p-CHK2的表达水平，p-ATR、p-BRCA1和γ-H2A。X上调，而p-P53上调HCT116和SW620细胞在225#化合物处理(图。3C公司)。因此，这些结果表明化合物225#可能能够导致CRC细胞DNA损伤，从而导致G细胞周期阻滞2/M相。

化合物225#诱导细胞凋亡人CRC细胞

本研究调查了细胞凋亡是否为响应化合物225#而触发。流程的结果细胞分析表明化合物225可诱导细胞凋亡在SW620和HCT116细胞中，增加了晚期细胞凋亡（SW620细胞从1.8%到29.5%；HCT116细胞为6至36.1%），浓度依赖方式(图4A)。随后通过以下方法评估凋亡相关蛋白的表达水平西方印迹法。正如预期的那样复方225#治疗后PARP增加(图4B)。值得注意的是在SW620和HCT116细胞中PUMA水平也增强用化合物225#进行后续处理(图4B)。总之，这些数据表明225号化合物可能具有调节凋亡相关蛋白，从而诱导人CRC细胞凋亡细胞。

图4。 化合物225#对SW620和HCT116细胞凋亡。（A） SW620和HCT116电池经225#化合物处理后，用Annexin V/PI染色。显示了具有代表性的流式细胞仪图。（B） 的影响化合物225对凋亡相关蛋白表达水平的影响蛋白质。（C） 显示了相关蛋白质带的灰度值。数据以平均值±标准差表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；ns，不显著；Ct，对照。

225#化合物诱发内质网应激CRC细胞中的反应和泛素聚集

一般来说，当细胞受到外界刺激时细胞病毒感染和细胞营养素等因素缺陷，展开或错误折叠的大量积累蛋白质发生在内质网腔中，这种积累最终导致内质网应激和随后的细胞凋亡(13)。假设内质网应激可能在暴露于化合物225#后被激活，因为检测细胞凋亡诱导。因此内质网应激时细胞内错误折叠蛋白的积累是用western印迹法进行研究。如所示图5AER的表达水平应激相关蛋白，包括p-eIF2α、PDI、PERK和calnexin呈剂量依赖性增加。这些发现表明用化合物225处理可能导致未折叠或错误折叠的蛋白质积累。

图5。 225#化合物促进SW620中泛素化蛋白的积累和内质网应激HCT116细胞。ER（A）表达的Western blot分析CRC细胞中的应激相关蛋白和（B）泛素化蛋白用化合物225#处理。（C） 相关蛋白质带如条形图所示。数据显示为平均值±标准偏差.*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；ns，不是显著；Ct，对照；p-，磷酸化；PDI，蛋白质二硫异构酶。

据报道，展开或折叠错误在刺激内质网应激之前，蛋白质将被Ub标记(14); 因此，本研究调查泛素化蛋白是否聚集以下化合物225处理。如所示图5B，泛素化的积累处理后聚集物呈剂量依赖性增加化合物225#。总之，这些观察结果表明该化合物225#诱导泛素化的积累聚集，这可能会进一步引发内质网应激。

化合物225#诱导自噬人CRC细胞

多项研究证明ER应激可以诱导自噬的激活，导致通过自噬体的形成吞噬应激内质网(15)。确定是否化合物225可调节自噬，western blotting为用于检测LC3-II在使用抑制剂。值得注意的是，化合物225#诱导了SW620和HCT116细胞中LC3B-II呈剂量依赖性(图6A)，表明自噬被激活。

图6。 化合物225#诱导自噬SW620和HCT116细胞。（A） 化合物225#促进自噬过度表达GFP-mCherry-LC3B的HCT116细胞中的流量。黄色的荧光指示非酸性自噬体的数量，红色荧光标记自溶体。比例尺，10µm。（B）采用western blotting检测LC3B，以评估化合物225号具有自噬作用。（C） 相关蛋白质的灰度值显示了条带。数据以平均值±标准差表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。Ct，对照。

化合物225对自噬流量的调节#显示在中图6B; 与…相比在对照组中，红色荧光点更加明显化合物中几乎没有黄色荧光点225#处理的HCT116细胞，表明酸性环境的溶酶体导致GFP荧光在225号化合物治疗自噬体融合溶酶体发生，表明促进自噬通量。

化合物225#抑制CRC肿瘤体内生长

研究化合物225#对大肠癌的影响肿瘤生长体内，HCT116×基因移植小鼠模型是已建立。如所示图7A，化合物225#给药32天显著抑制HCT116肿瘤小鼠的肿瘤生长。6天后治疗，用1030 mg/kg化合物225#显著小于对照组(图7B)。按日计算32，10 mg/kg和30 mg/kg化合物中的平均肿瘤体积225#治疗组仅为对照组的27.4%和14.3%组。此外，肿瘤重量在10和30 mg/kg化合物225#治疗组减少72.7和与对照组相比，分别为90.6%(图7C)。此外，在第32天，用225号化合物治疗的小鼠体重减轻与对照组相比，但无显著性差异(图7D)。总的来说，这些结果表明化合物225#可有效抑制HCT116 CRC肿瘤生长体内在中体内设置。

图7。 化合物225#抑制HCT116肿瘤小鼠的生长。（A） 裸鼠皮下注射HCT116细胞建立异种移植模型实验结束时切除。（B） 测量肿瘤体积每3天显示一次并且每6天显示一次数据。（C） 小鼠肿瘤研究结束时测量体重。（D） 体重为每3天测量一次，显示每6天的数据表示为平均值±标准偏差。***P<0.001，***P<0.0001 vs。Ctr组。控制中心。

讨论

CRC是一种常见的恶性肿瘤，影响消化系统，全球发病率仅次于恶性肿瘤中的肺癌(2)。化疗是CRC患者的治疗和预后。然而当前的化学疗法在其方面存在局限性由于副作用和药物的出现而产生的疗效阻力。因此，必须探索和确定具有更大效力和更低毒性水平的新药。在本研究中，合成并展示了化合物225#对CRC细胞具有一定程度的抗增殖活性。这个这一发现鼓励对其进行进一步调查抗增殖作用及其分子机制。结果表明，化合物225#能有效抑制增殖、阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡和促进CRC细胞自噬。首先研究了CRC细胞中的化合物225#及其对正常人结直肠上皮细胞的细胞毒性。尤其是，观察到化合物225有效地抑制了CRC细胞的存活率，但仅轻微影响正常人结直肠上皮细胞，表明其高表达抗肿瘤活性和低毒性。此外化合物225#对CRC细胞增殖的影响用菌落形成和EdU分析。结果显示菌落形成的剂量依赖性抑制和数量EdU-阳性细胞对化合物225#的反应。其次化合物225#的抗肿瘤作用在在里面活泼地异种小鼠模型，其表现出剂量依赖性抑制肿瘤生长。此外，在用225号化合物治疗的小鼠没有显著高于对照组的毒性较低。基于这两项研究的结果在体外和体内研究，化合物225#有望成为大肠癌的治疗剂。

细胞周期进程的失调是关键以癌症为特征。诱导细胞周期停滞，尤其是在G2/M阶段，可能是解决不受控制的癌细胞增殖(16)。细胞周期蛋白B1和细胞周期蛋白A1，以及CDK1作为G中的特定调节器2/M相，它们有助于将一个细胞分裂为两个(17)。流式细胞术分析显示225#化合物诱导了G2/CRC中的M阶段停止细胞。进一步的western印迹显示，用复合物处理225#增强了p-CHK2、p-ATR、p-BRCA1和γ-H2A。X、 同时降低p-P53的表达水平，表明DNA对细胞周期的损伤。它以前是据报道，p-P53的下调与DNA损伤有关和CHK2激活(18)。第21页在阻断CDK1/细胞周期蛋白B1在P53独立或独立方式(19)。从机械角度来看，化合物225#研究表明，该治疗导致SKP2显著下调。两种重要的肿瘤抑制因子P21和P27(20)作为SKP2的底物，在225#化合物处理的CRC细胞中发现上调本研究。本研究结果表明化合物225#具有肿瘤抑制作用，部分是归因于SKP2的抑制和其促进下游目标P21和P27。

细胞凋亡是程序性细胞死亡在维持人体内稳态(21)。诱导肿瘤细胞凋亡许多抗癌药物所针对的关键机制。因此，它研究抗癌药物诱导细胞凋亡。在本研究中，化合物225#对流式细胞术检测CRC细胞凋亡。这个结果表明，化合物225显著诱导细胞凋亡HCT116和SW620 CRC细胞。值得注意的是，PUMA位于下游在P53基因中，是一个促凋亡启动子基因，它可以通过P53依赖途径激活细胞凋亡，从而诱导肿瘤细胞凋亡。PARP被半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶分解为形成分裂PARP的底物，最终导致细胞死亡。化合物225#通过诱导HCT116和SW620细胞凋亡增加促凋亡蛋白PUMA的表达水平并通过切割PARP。

ER广泛存在于真核细胞中负责蛋白质合成、折叠、组装和运输，和药物代谢。外部环境刺激可导致ER细胞功能障碍，内质网应激通过错误折叠的蛋白质，这是一种自我保护机制(22)。然而，一系列病理学当错误折叠的蛋白质数量超过时，就会发生反应ER的处理能力(23)。一般来说，细胞内当内质网应激时，分子伴侣相应升高发生(24)。Calnexin存在于ER作为Ca2+-需要凝集素样分子伴侣蛋白，与寡糖链结合尚未完全折叠的新合成蛋白质，防止蛋白质聚集和泛素化并抑制不完整蛋白质离开内质网(25)。值得注意的是，Ub蛋白聚集是蛋白质降解的异常表现。然而，在本研究中复方225治疗后calnexin增加，表明泛素化蛋白的聚集和不完全折叠蛋白的溢出未被阻止与western blot检测结果一致泛素化蛋白表达增加。

在ER压力条件下，暂时减弱mRNA在细胞整体水平上的翻译释放细胞内蛋白质的压力，PERK形成二聚体随后被自我磷酸化激活进一步促进下游eIF2α的磷酸化(26)。PDI不仅是一种酶催化二硫键的形成和异构化，但也是重要的陪护(27)。PDI量随着ER中错误折叠或未折叠蛋白的增加。过去几年来，PDI作为药物靶点的潜力，尤其是在癌症治疗中，受到了相当大的关注(28)。PDI在以下方面发挥着关键作用通过以下途径促进错误折叠蛋白质的降解ER相关降解。这个过程涉及易位从内质网到细胞质的受损蛋白质随后被蛋白酶体水解酶泛素化和降解(29)。治疗后化合物225#，用于维持细胞蛋白质的体内平衡防止蛋白质错误折叠和聚集分子伴侣被触发表达式被提升，这反过来指示ER压力响应。因此，在本研究中，化合物225#导致PDI、p-eIF2α和PERK的蛋白表达水平升高。大肠癌细胞蛋白质代谢失衡与内质网应激表明有望成为可能抑制CRC细胞的增殖。因此，针对ER压力信号通路可能是治疗CRC的一种有前途的策略。

内质网应激是众所周知的细胞应激反应这在激活自噬中起着关键作用。自噬，a高度重要且进化上保守的机制，是负责维持细胞内环境稳定(15)。以前的研究已经证明自噬的激活依赖于ER应力(30，31)。内质网应激诱导的自噬可以通过GFP-LC3点状和蓄积的增加来证明LC3-II。LC3-II促进了自噬，被认为是自噬激活的信号(32).

GFP-mCherry-LC3B串联荧光蛋白是一种用于检测自噬水平的融合蛋白通量。当只有红色荧光而没有绿色荧光时在单元格中，没有重叠，因此没有黄色荧光，表明融合蛋白位于溶酶体或自噬溶酶体，即自噬通量激活(33)。这突出了它的作为发展的潜在目标的重要性抗癌药物(34，35)。激活癌细胞的自噬被认为是改善化疗在癌症治疗中的效果。然而，它是确保自噬在癌症中高度激活至关重要将其视为可行治疗靶点的细胞(36)。本研究表明化合物225诱导自噬可抑制CRC细胞的增殖活性。本研究是一项化合物225抗肿瘤作用的初步研究。在结论：本研究为化合物225#在大肠癌中的抗癌活性在体外和体内具体而言，化合物225#抑制了通过诱导细胞周期停滞和凋亡来增殖CRC细胞和自噬。值得注意的是，内质网应激对化合物225#介导CRC细胞的病理反应。这个本研究结果表明，化合物225可能具有成为有效治疗剂或佐剂的潜力CRC的治疗。虽然本研究提供了以下证据化合物225#对大肠癌的显著抗癌活性在体外和体内，有一些局限性。首先，本研究只是抗癌的初步研究化合物225的作用，其确切作用机制不是完全理解，需要进一步探索。其次，其他对这种物质的具体研究，例如与现有的抗癌药物尚未实施该领域可以在未来的研究中进一步探索。最后，尽管本研究表明内质网应激可能是其原因之一化合物225#介导CRC细胞的病理反应，其他可能的机制尚未完全阐明再次需要通过进一步的研究来完善。因此，更多深入全面地研究化合物225及其作用机理仍需进一步研究。

补充材料

支持数据

致谢

不适用。

基金

这项研究得到了基础研究和前沿重庆市科学技术局项目（批准号：。cstc2020jcyj-msxmX0733），科学技术研究重庆市教委项目（批准号：。KJQN202201329、KJQN202201330和KJZD-K202001302），科学与永川市科技局科技计划（批准号：2022yc-jckx20014和2021yc-jck x20044）重庆市教委技术研究计划（批准号：KJQN202201205），以及研究生科学研究重庆三峡大学创新工程（批准号：。YJSKY21032）。

数据和材料的可用性

本研究中产生的数据可能是请求相应作者提供。

作者的贡献

XZ和LH进行了文献检索，设计并进行实验，分析数据和起草手稿。YL设计合成了225#化合物。YQ、WH和WL参加了实验。HD和DY怀孕并设计实验，严格修改手稿最终批准了提交的版本。LH和DY确认所有原始数据的真实性。所有作者阅读并批准了最终手稿。

道德批准和同意参与

对所有进行的动物研究进行了回顾并由动物研究伦理委员会批准重庆文理学院（批准号：CQWU202204；中国重庆）。实验是严格进行的根据标准协议。

患者同意发布

不适用。

相互竞争的利益

作者声明他们没有竞争对手利益。

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