本文在以下内容中提到：

介绍

在造血过程中，造血干细胞（HSC）自我更新并产生祖先及其成熟淋巴和髓系淋病。成熟过程受到控制通过内部和外部线索以及特定的血祖细胞中的转录因子(1，2).已经进行了广泛的研究，以揭示造血转录因子及其对正常人的影响发育与疾病(1，2).

红细胞和巨核细胞来源于普通前体，指定巨核红细胞前体（机电）(三). MEP承诺红细胞/巨核细胞系发生在骨骼内多重调控影响下的骨髓微环境因素。七肽转录的蛋白质相互作用因子（TFs）友白血病整合因子1（Fli-1），GATA结合蛋白（GATA）1，GATA2，runt-related转录因子1（RUNX1），MEP细胞中的T细胞急性淋巴细胞白血病1（TAL1）控制linage特异性红细胞和巨核细胞微分(4). 在人造血干细胞中七肽因子的组合结合干祖细胞、单个祖细胞和细胞线条显示了调控结构中的细胞特异性变化这些转录因子在谱系特异性微分(5–7).

Fli-1首先被确定为集成站点原病毒，通过friend鼠白血病病毒（F-MuLV）(8，9).红白血病细胞Fli-1下调促进红系微分(10–12)，而过度表达或药物介导的Fli-1激活诱导MEP分化为巨核细胞(13，14). 这与事实相符斑马鱼FLI1在转录物的顶部起作用推动血液和内皮发育的网络(15). 在本研究中，发现FLI1Gata2上游，干细胞白血病/Tal1），LIM-onlyprotein2（Lmo2）和斑马鱼ets相关蛋白（Etsrp）。的表达式Fli-1相关的红细胞转化相关基因(ERG公司)也与红系和巨核细胞分化(16). 然而这两个基因在MEP的整个成熟过程中没有但仍在调查中。研究还暗示LIM域结合1（LDB1）在红细胞分化调控中的作用(17–23). 染色质免疫沉淀分析表明，大多数DNA结合的小鼠Gata1和Tal1蛋白包含在高阶络合物（Ldb1-络合物）中包括核适配器Ldb1和Lmo2(17). 值得注意的是，FLI1与LDB1复合最近发现可以调节巨核细胞基因表达通过与小鼠红白血病细胞中GATA1的相互作用(24). LDB1被视为通过DNA使Fli-1接近Gata1的支架蛋白循环，导致巨核细胞基因激活(24).

以前的研究将GATA1确定为直接目标FLI1的表达被该TF抑制(12，25).然而，GATA2在红系或巨核细胞中的作用分化还没有完全理解。FLI1显示在当前研究绑定GATA2协议启动子并激活其转录。相反，ERG的表达可以阻断GATA2协议导致巨核细胞抑制的转录区别。淘汰研究表明，虽然GATA1是GATA2对红系分化至关重要，主要需要用于巨核细胞分化。此外FLI1介导的LDB1通过GATA1的直接调节，在控制红细胞和巨核细胞谱系。本研究提供了新的见解进入FLI1和其他控制红细胞的因素，如GATA1、GATA2、ERG和LDB1和巨核细胞分化。

材料和方法

细胞系和载体

人类红白血病细胞系HEL（cat.no。ATCC-TIB-180）和293T（目录号ATCC-CRL3216）[293T（分类号293tsA1609neo）细胞系（分类号ATCC CRL-11268）]，之前从ATCC获得。这些细胞经过培养在Dulbecco改良鹰培养基中添加5%胎牛血清（HyClone；Cytiva）。荧光素酶报告子载体PGL3（PGL3-basic）购自Promega Corporation（分类号U47295）。载体PCDNA3 Flag Erg（Addgene，Inc.）为脂质体转染HEL细胞®2000（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.），根据制造商说明。

基因克隆、转染和荧光素酶活性

GATA2协议启动子序列下载自集成基因组浏览器(https:/www.ensembl.org/index.html)下载。收件人克隆GATA2协议启动子，启动子的上游区域启动子（位置−560至+10；参见图1F和表SI)，含有强效FLI1结合位点被克隆到荧光素酶报告载体PGL3中（Promega Corporation），如前所述(26，27).启动子克隆由（GenScript Biotech，Cn）执行。这个GATA2协议启动子和阴性对照PGL3载体DNA（1.25μg）与MigR1（1.25μg）或MigR1-FLI1（1.25µg）混合嗯，在室温下培养12分钟，然后转染到293T细胞在37°C下使用脂多糖胺®2000（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）遵循制造商协议。肾素荧光素酶用于转染作为内部控制来测试转染效率符合制造商建议（Promega Corporation）。这个然后将瞬时转染的细胞置于96孔板中和之前一样，48小时后测定荧光素酶活性提到(27).

图1。 GATA2的直接监管FLI1启动子。（A） 在命名为shFLI1的FLI1敲除细胞中（B）GATA1表达增加，（C）GATA2水平下降，用RT-qPCR测定。（D） FLI1、GATA1和western blot分析shFLI1细胞中的GATA2。箭头显示FLI1 51 kDa和48 kDa蛋白带的位置。（E） 指示的FLI1结合位点位于GATA2启动子。启动子序列下载自集成基因组浏览器。（F） GATA2及其启动子荧光素酶报告子上游克隆的GATA2L区域质粒PGL3。（G） FLI1在293T细胞中的表达吸墨纸。（H） GATA2L启动子的荧光素酶活性用任一表达载体联合转染293T细胞MigR1-FLI1或对照MigR1。以PGL3质粒为对照。（一） GATA2启动子与FLI1结合的ChIP分析RT-qPCR（顶面板）。下部面板是免疫沉淀的PCR扩增带相对于输入。**P<0.01和***P<0.001。GATA2，GATA结合蛋白2；FLI1、，friend白血病整合1；sh，短发夹；RT-qPCR，反向转录定量PCR；ChIP，染色质免疫沉淀。

染色质免疫沉淀（ChIP）化验

简言之，生长的HEL细胞（4×106细胞每个反应）被洗涤，与甲醛交联，然后在500µl裂解缓冲液中再次悬浮（酶染色质IP试剂盒；Cell Signaling Technology，Inc.）。微球菌核酸酶（0.5µl）添加到固定细胞中，并在37°C下用为了将DNA消化到大约150–900个基点。细胞裂解物在三组20秒的时间内进行声波处理使用超音速Vibra VCX150的脉冲株式会社制造）以破坏核膜。作为控制，一部分去除等分染色质（20µl）作为输入DNA。在4°C下用100µl进行过夜免疫沉淀工艺溶液和5µl ChIP特异性FLI1抗体（Abcam）]或1µl非特异性正常兔免疫球蛋白G（IgG）抗体（CST）。向每个IP反应中加入30µl蛋白G磁珠，在4°C下旋转培养2小时。使用随试剂盒提供的缓冲液清洗沉淀反向交联，使用公司提供的说明酶染色质IP试剂盒（CST生物试剂有限公司）。沉淀的染色质与蛋白酶K在65°C下孵育2小时，使用公司的旋转柱进行DNA纯化酶染色质IP试剂盒（CST）。定量（RT-q）PCR用于扩增含有FLI1的指示启动子区域结合位点。ChIP引物的序列是GATA2L意义的：CGAGTTGCATCTGATTGTGG和反义：GCTCCTGTTCAACCCA。这个输入百分比根据强度通过qPCR计算扩增的FLI1 DNA除以扩增的输入DNA。扩增的DNA也在2%琼脂糖凝胶中溶解，如图1I.

RT-qPCR

从HEL细胞培养物中提取总RNA(4×105)使用三唑®（赛默飞世尔Scientific，Inc.）。使用NanoDrop 2000测量RNA浓度分光光度计（Thermo Scientific Fisher公司）。要生成cDNA，使用PrimeScript RT试剂盒（Takara Biotechnology Co.，Ltd.）。使用FastStart Universal SYBR Green Master进行RT-qPCR（Roche Diagnostics GmbH）和Step One Plus实时PCR系统（应用生物系统公司；赛默飞世尔科技公司）。这个表达标准化为GAPDH。第2个-ΔΔCq方法用于相对量化(28). RNA提取、cDNA合成和RT-qPCR均按照制造商协议进行。引物序列在表SII公司共使用三个生物三倍体RT-qPCR，每份一式三份（n=3）。

热图分析

HEL中短发夹（sh）FLI1的RNA测序单元格以前已发布(29). TBtools软件（TBtoolsV1.098）用于热图分析(30).研究中的原始贡献是公开的可在以下位置找到https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/？term=PRJNA682304.

STRING、ENCODE和ENSEMBLE数据库分析

STRING数据库(网址：www.string-db.org)用于蛋白质交互数据分析。ENCODE数据库（encodeproject.org）用于确定FLI1结合的DNA-蛋白质相互作用到GATA2协议.集成基因组浏览器(https://www.ensembl.org/index.html)习惯了提取启动子序列如所示图1E.

shRNA和短干扰（si）RNA表达

sh-FLI1表达结构的构建（shFLI1）已经过描述(29，31).简而言之，shRNA表达质粒（12 mg）和包装质粒psPAX2（6 mg），pMD2。G（12毫克）（Didier Trono，Addgene质粒12259和12260）混合并转染到HEK293T细胞，使用脂多糖胺®2000 48小时后转染后，收集细胞上清液进行转染HEL（1×106)单元格。之后的阳性细胞使用RPMI-1640选择转导并培养24小时含有嘌呤霉素的培养基（5 mg/ml；Solarbio，中国]。其他shRNA如shGATA1、shGATA2和shLDB1及其对照以类似的方式产生了干扰质粒。这个序列如所示表SIII公司。使用脂多糖胺®2000年（Invitrogen；Thermo FisherScientific，Inc.）根据制造商的说明前面描述的(27). 在简言之，使用Lipofectamine 2000转染siRNA（20μL中的15μLuM）根据制造商的说明注入HEL电池（Invitrogen；赛默飞世尔科技公司）。48小时后，细胞采集用于后续分析。

HEL中ERG的过度表达细胞

含有PCDNA3.1（−）（1.25µg）的DNA载体微克；猫。编号V79520；Invitrogen；赛默飞世尔科技公司）或PCDNA3 Flag Erg（1.25µg；产品目录号66977；Addgene，Inc.）根据制造商的协议。转染是使用脂多糖胺®2000年（Invitrogen；Thermo Fisher科学公司）。转导后48小时更换培养基用含有G418的培养基筛选阳性细胞（250µg/ml；北京索拉比奥科技有限公司。，有限公司）。

蛋白质印迹

按说明进行蛋白质印迹其他地方(14). 简而言之，细胞收集并使用RIPA裂解缓冲液提取蛋白质（Beyotime生物技术研究所）。裂解和蛋白质后使用BCA蛋白检测试剂盒测定密度，50 ug样品装在10%丙烯酰胺凝胶上并转移到PVDF上膜。用含5%脱脂牛奶的TBS缓冲液封住室温下1.5小时。FLI1的多克隆兔抗体（分类号ab133485）[稀释度1:1000]，GATA1（ab181544）[稀释1:2000]，LDB1（分类号ab96799）[稀释度1:1000]和ERG（分类号。编号ab92513）【稀释度1:1000】购自Abcam；GATA2协议（分类号4595S）[稀释1:500]，来自CST生物试剂公司。，有限公司。；来自杭州的GAPDH（目录号AB-P-R 001）【稀释度1:1000】Goodhere生物技术有限公司。；二级抗体（抗抗体来自CST Biological的IgG（H+L）（DyLight™800 4X PEG偶联物）试剂有限公司（分类号5151S）[稀释度1:30000]。这个用含有3%BSA的TBS缓冲液稀释抗体初级抗体在4°C下孵育过夜二级抗体在室温下孵育1.5h。奥德赛成像系统（LI-COR Biosciences）用于西部蛋白质印迹成像，蛋白质密度用随附的软件（Odyssey CLX Image Studio 3.1）系统。

流式细胞术

免疫荧光染色检测如前所述，红细胞和巨核细胞(14，29). 简言之，1×105细胞在4°C下用APC结合抗体染色40分钟。然后将细胞清洗两次，再悬浮在200µl PBS中，并使用用于流量分析。使用了以下主要抗体：人类分化CD41a-APC簇（分类号559777），人类CD61-APC（目录号564174）、人CD71-APC（分类号551374）和人CD235a-APC（产品目录号551336；全部从BD购买生物科学）。使用NovoCyte流进行流式细胞术细胞仪和Novo-express软件（ACEC Biosciences Inc.）。

门控策略的使用如下：FSC-A/SSC-A图用于从碎片中分离活细胞。使用散射/抗CD71+和来自未染色控制的散射/抗CD235a+门。使用散射/抗CD41a+和来自未染色控制的散射/抗CD61+门。计数/抗CD71+、计数/抗-CD235a+、计数-抗CD41a+和计数直方图中的抗CD61+表达标记。

统计分析

使用双尾学生t检验或使用韦尔奇方差分析Tamhane的T2事后测试，使用Prism 8软件（GraphPad；点处理）。结果表示为平均值±标准偏差来自至少三个独立实验。P＜0.05时被认为显示了统计上的显著差异。

结果

FLI1直接结合GATA2并调节其转录

作者曾报道过RNAseq数据慢病毒-shRNA-介导的FLI1基因敲除后显示生物潜能的红白血病细胞系HEL（shFLI1）巨核细胞生成与红系祖细胞容量(29，31).该RNAseq分析确定了一组与巨核细胞生成，其表达在FLI1后发生改变耗尽(图S1A) (29). 红系的热图分化表达基因（EDEGs），如图S1B鉴定出52个基因慢病毒介导的FLI1基因敲除中的表达改变（shFLI1）相对于控制（置乱）单元。

在与红系和巨核细胞分化、GATA1和GATA2的表达先前显示在这些血液成熟过程中起关键作用进程，尽管底层机制仍然是阐明的(16). GATA1是FLI1负调节(12)如本研究所示RT-qPCR和western blot分析(图1A、B和D). 这与先前的一份报告显示FLI1与假定位点结合在的启动子内关贸总协定1(12). 相比之下，GATA2的表达是与加扰控制单元相比，shFLI1显著降低(图1C和D)，表明FLI1可直接调节GATA2的表达。事实上本研究确定了一个推测的FLI1结合位点发起人GATA2协议位置−376至−368(图1E). 确定FLI1是否招募到GATA2协议通过这个网站GATA2协议被克隆到荧光素酶报告基因PGL3中（指定为GATA2L；图1F).GATA2L质粒转染及FLI1表达进入293T细胞的载体（MigR1-FLI1）显著增加荧光素酶活性(图1H). 这个通过western blotting验证FLI1在293T细胞中的表达(图1G). HEL的ChIP分析使用侧翼假定FLI1结合位点的引物的细胞在GATA2协议启动子检测到一条带用FLI1免疫沉淀，但不控制IgG抗体(图1I). 这些结果针对首次将人类GATA2启动子作为佛罗里达州。

FLI1法规的后果GATA1和GATA2在红白血病细胞增殖中的作用

了解FLI1法规的后果GATA1和GATA2在细胞增殖和分化中的作用，慢病毒shRNAs被用于敲除HEL细胞中的这些基因。shGATA1-1和shGATA1-2细胞中获得了显著的敲除在两个mRNA上(图2A)和蛋白质(图2B)级别。同样，通过shGATA2-1、shGATA-2和shGATA2-3载体阻断了两种转录丰度(图2C)和蛋白质(图2D)表达式。击倒时GATA2没有改变细胞增殖(图2E)，GATA1损失显著与混乱控制相比，培养物中的增殖率降低(图2F). GATA1和GATA2轻微但显著增加FLI1表达(图2G). 因此在Fli-1启动子和显示GATA1绑定这些序列(32). 表达式分析也是GATA2与FLI1的预测结合(图3E)可能需要进一步分析未来的研究。

图2。 HEL中GATA1和GATA2的拆除细胞及其对细胞增殖的影响。慢病毒介导的敲击HEL细胞中GATA1（shGATA1-1和shGATA1-2）的下降（A） RT-qPCR和（B）western blotting。慢病毒介导的消融HEL细胞中的GATA2（shGATA2-1、shGATA2-2和shGATA2-3）通过（C）RT-qPCR或（D）western blotting测定。扩散（E）shGATA2-1和（F）shGASA1-2与加扰控制的对比分析细胞使用MTT分析。（G） FLI1在通过RT-qPCR检测shGATA2-1和shGATA1-2细胞*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001。GATA，GATA结合蛋白；第页，短发夹；RT-qPCR、逆转录定量PCR；FLI1，朋友白血病整合1。

图3。 GATA1和GATA2的表达控制红细胞和巨核细胞分化。（A） 流量用细胞术测定巨核细胞的表达shGATA1-2中的（CD41a/CD61）和红系（CD71/CD235a）标记物细胞。（B） shGATA1-2中指示蛋白的表达western印迹法检测细胞。RD由检测密度计。（C） 巨核细胞（CD41a/CD61）和shGATA2-1细胞中的红系（CD71/CD235a）标记物通过流式细胞术。（D） 通过shGATA2-1细胞中的RT-qPCR。（E） 表示的表达式通过蛋白质印迹检测shGATA1-2细胞中的蛋白质。*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001。GATA，GATA约束蛋白质；CD，分化簇；sh，短发夹；RD、，相对密度。

GATA1和GATA2沉默的影响红系和巨核细胞分化

确定GATA1/GATA2对红系/巨核细胞谱系发育的研究现状使用红细胞（CD71和CD235a）和巨核细胞（CD41a和CD61）标记(33，34). 之前已经表明成红细胞中Fli-1的过度表达阻断了红系微分(10，11). 确实，在HEL细胞中FLI1沉默巨核细胞CD41a和CD61阳性细胞百分比降低晚期红细胞CD235a细胞百分比增加(图S2A和B). FLI1击倒没有对早期红细胞标志物CD71表达的影响(图S2A和B).

GATA1（shGATA1）的取消导致了一场戏剧性的红系分化标记表达减少CD235a，但CD71水平的变化可以忽略不计(图3A和第3章). GATA1击倒也被抑制CD41a和CD61水平的巨核细胞分化shGATA1-2细胞显著减少(图3A和第3章). HEL细胞中GATA1的消融导致GATA2和LDB1下调，但略高通过western blotting测定FLI1的表达(图3B).

shGATA2-1细胞中GATA2沉默表明巨核细胞CD41a和CD61的百分比显著降低表达细胞。该分析还发现shGATA2-1细胞中CD71和CD235a表达的百分比(图3C和S4系列). 事实上巨核细胞标记物CD61型和梅斯1，以及红细胞减少CD235a型标记物和珠蛋白基因HBA1型和HBA2型在shGATA2-1细胞中观察到(图3D). GATA2的拆除HEL细胞导致LDB1下调，但稍高通过蛋白质印迹测定FLI1的表达(图3E). GATA1的表达是shGATA2-1细胞轻度减少，可能是由于增加FLI1的表达(图3E).这些结果表明，GATA2在巨核细胞分化与红系的某些参与通过FLI1成熟。GATA1可能参与巨核细胞通过GATA2的监管进行区分(图3B).

使用蛋白质相互作用数据库（字符串），发现FLI1结合GATA2以及其他包括GATA1、RUNX1/2、MYB、SPI1、TAL1在内的已知因素红系和巨核细胞分化的关键作用(图S5A). GATA2也是预计与参与红系和巨核细胞成熟(17，18).由于FLI1消融抑制ITGAB3（CD61）的表达(图S2A和B)，击倒GATA2引起类似的下调(图3D). 因此，本研究发现CD61型具有假定的GATA2约束位置−102至−96处的现场(图。5亿). 在ENCODE数据库中(35)，GATA2强结合（亲和力7.93）到启动子的这个区域(图。S5C系列). 这些结果证实了GATA2作为巨核细胞分化的限制因素。

ERG在HEL细胞中的过度表达抑制巨核细胞分化

而GATA1已被证明控制巨核细胞分化，其潜在机制尚待阐明。与FLI1在HEL细胞中的过度表达相反另一个与FLI1相关的ETS基因ERG可以忽略不计(29). 已知这两个基因具有造血的不同功能(16). 本研究发现GATA1和GATA2敲除细胞ERG公司表达式是显著诱导，表明ERG通过HEL细胞中的这些GATA基因(图4A和B). 与FLI1相同(32)，的ERG公司促进者也包含多个GATA结合位点(图S6A). 确实发现了ENCODE分析GATA1和GATA2对ERG公司发起人(图S6B). 因此，GATA1和GATA2负调控HEL细胞ERG和FLI1的表达。收件人进一步研究ERG在红系和巨核细胞中的作用分化，ERG在HEL细胞中过度表达(图4C). ERG在HEL中的高表达细胞对细胞增殖无明显影响(图4D)但结果显著FLI1和GATA2下调(图。第四版)和GATA1的上调(图4E). ERG表达也更高导致CD41a/CD61水平强烈下调，表明与FLI1相反，ERG是一种强大的巨核细胞分化(图。4楼和第7部分). 更高ERG轻微但显著诱导红细胞CD235a的表达表达，与这些细胞中较高的GATA1水平一致。这些结果首次表明GATA1/2控制通过抑制ERG实现巨核细胞分化。

图4。 红细胞和ERG检测巨核细胞分化。ERG的表达反向检测shGATA1-2（A）和shGATA2-1（B）细胞转录定量PCR。（C） ERG在HEL中的表达用PCDNA-ERG或载体PCDNA转染的细胞使用西方印迹法。（D） PCDNA-ERG的增殖率与MTT法检测对照PCDNA细胞。（E） 的表达式PCDNA-ERG和PCDNA细胞中的指示蛋白质，通过western blot分析。（F） 流式细胞术检测巨核细胞（CD41a/CD61）和红细胞的表达PCDNA-ERG和PCDNA对照细胞中的（CD71/CD235a）标记。安给出了三个实验的平均值**P<0.01和***P<0.001。ERG、ETS转录因子ERG；电动滑行系统，E26转化特异性；sh，短发夹；GATA，GATA约束蛋白质；CD，分化簇；Rd，相对密度。

FLI1通过以下途径负调节LDB1GATA1控制细胞分化

LDB1基因也与两种红系有关和巨核细胞分化(17，18，24).本研究发现，LDB1受FLI1负调控(图S1B)，同时使用RT-qPCR和western blot分析(图5A和B类). 值得注意的是，LDB1合作伙伴Lmo2也表现出负面影响受FLI1调节，在shFLI1细胞中上调与红系分化相关(图S1B). 这个低密度脂蛋白B1促进剂确实没有规范的FLI1绑定站点（未显示数据），并且因此，它在shFLI1细胞中的诱导可能通过GATA1和/或GATA2(图3B和E).

图5。 红细胞和LDB1诱导巨核细胞分化。LDB1的表达通过（A）RT-qPCR或（B）western blotting检测shFLI1细胞。（C） LDB1蛋白在shRNA转染HEL细胞中的表达慢病毒（shLDB1-1、shLDB1-2和shLDB1-3），根据西方印迹法。（D） FLI1、LDB1、GATA1和GATA2的表达western blotting检测shLDB1-3细胞。GAPDH被用作装载控制。（E） shLDB1-3相关基因的表达通过RT-qPCR确定的干扰对照细胞。（F）shLDB1-3和扰乱的对照细胞的增殖率，如由MTT决定。（G） 表达的流式细胞术分析巨核细胞（CD41a/CD61）和红细胞（CD71/CD235a）标记shLDB1-3细胞与加扰控制细胞。三人的平均数实验表明。（H） 表示的相对表达式通过RT-qPCR检测基因*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001。LDB1、LIM结构域结合1；sh，短发夹；逆转录定量PCR；GATA，GATA约束蛋白质；FLI1，朋友白血病整合1；CD，组区别；RD，相对密度。

揭示LDB1在红系和巨核细胞分化，使用慢病毒-shRNA(图5C).高效敲除LDB1的shLDB1-3细胞表现出较强的活性FLI1和GATA2的减少和GATA1的稳健诱导表达式(图5D和E).然而，HEL细胞中LDB1沉默对细胞没有影响文化增殖(图。5楼).

流式细胞术显示LDB1的敲除显著降低表达巨核细胞标志物CD41a和CD61。LDB1消融导致红系CD71和CD235a表达细胞百分比较低(图5G和第8节). 这些结果得到了进一步的支持红细胞血红蛋白基因的低表达HBA1、HBA2和低巨核细胞标记物CD41细胞和美1，由RT-qPCR(图5H). 值得注意的是，虽然HEL细胞中FLI1的敲除加速了红系和中度巨核细胞分化减慢(图S2)，LDB1击倒抑制FLI1(图5D)，诱导GATA1表达式(图5D)和意外抑制红细胞成熟(图5G).

上述结果表明LDB1表达水平可能是FLI1阻断的必要条件红系分化。为了测试这种可能性，LDB1使用siRNAs（siLDB1-1-siLDB1-4）在shFLI1细胞(图6A).siLDB1-1下调shFLI1中的LDB1导致CD41a和CD61的百分比，但轻微且不显著CD235a表达细胞减少(图6B和C). 然而，在RT-qPCR中，siLDB1-1显著抑制红系标志物的表达HBA1、HBA2、HBG1和HBG2型(图6D). 这些结果表明LDB1在控制红细胞和巨核细胞中的重要作用通过FLI1承诺。

图6。 抑制红细胞和LDB1 siRNA诱导shFLI1细胞巨核分化（A）使用指示的siLDB1下调shFLI1细胞中的LDB1，如通过western blotting检测。（B） 流式细胞术用于表达巨核细胞（CD41a/CD61）和红细胞（CD71/CD235a）标记物shFLI1细胞与用siLDB1-4。在每次分析中使用相同的未染色细胞。（C）三个实验的平均值。（D） 的相对表达式shFLI1-siLDB1-1细胞中指示的红系分化基因与逆转录定量PCR对照*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001。sh，短发夹；FLI1，朋友白血病整合1；LDB1，LIM域结合1；si，短干扰；CD，分化簇。

期间FLI1和KLF1之间的相互作用红系分化

最后，KLF1（EKLF）转录因子通过结合CACCC基序控制红系分化在各种珠蛋白基因启动子内(36). KLF1和FLI1之前都是据报道相互进行负面调节(37，38).众所周知，KLF1也积极调节GATA1，导致红系分化(37–39).在GATA1敲除细胞中(图。第7章),荷兰皇家空军1号表情被大大抑制(图7B)，支持直接GATA1对KLF1的监管。值得注意的是荷兰皇家空军1号在LDB1敲低细胞中检测到表达(图7C). 符合抑制巨核细胞生成，FLI1表达降低(图5D)，而ERG公司shLDB1-3细胞中的表达强烈升高(图7D). 这些结果进一步证实LDB1在控制红细胞和与FLI1和ERG协同进行巨核细胞分化。作为中描述的图7E，FLI1对GATA1、GATA2、LDB1和ERG的转录调控是对红系或巨核细胞的承诺至关重要区别。在HEL细胞中，LDB1沉默降低了FLI1和增加的GATA1水平(图5D).GATA1表达的这种增加意外地未能诱导红系分化。相反，LDB1表达减少导致GATA2下调，导致巨核细胞减少区别。因此，FLI1和LDB1之间的合作是对红系分化的适当调节是必要的。

图7。 FLI1调节KLF1转录控制红细胞分化。（A，B）（A）的表达式通过RT-qPCR测定shGATA1-2细胞中的GATA1和KLF1（B）。（C，D）shLDB1-2细胞中（C）KLF1和（D）ERG的表达通过RT-qPCR测定。（E） FLI1复杂的调节电路以及其他导致红系和红白血病HEL细胞的巨核分化。描述的模型表明，FLI1通过激活GATA1而损失诱导红系分化。FLI1丢失抑制GATA2转录，导致巨核细胞减少区别。失去GATA1和GATA2激活ERG与FLI1相比，它阻止巨核细胞分化。低密度脂蛋白B1，通过FLI1的负调控，在红系或巨核细胞分化。虚线显示间接监管***P<0.001。KLF1、KLF转录因子1；FLI1，朋友白血病整合1；GATA，GATA结合蛋白；sh，短发夹；RT-qPCR、逆转录定量PCR；ERG、ETS转录因子ERG；电动滑行系统，E26转化特异性；CD，分化簇。

讨论

本研究表明FLI1控制转录GATA1、GATA2和LDB1，从而协调HEL细胞中红系与巨核细胞的分化。而FLI1负性控制GATA1以阻断红系分化，本研究表明GATA2协议FLI1的转录调控在促进MEP样红白血病细胞系HEL的分化朝向巨核细胞谱系成熟。LDB1发挥更广泛的作用祖细胞对红系和巨核细胞的承诺通过FLI1进行区分。这些结果提供了新的见解FLI1及其附件在红系和巨核细胞分化。然而，进一步可能需要对动物模型进行研究以确认其功能这些TF中的体内.

FLI1和GATA2之间的联系是之前已观察到，但尚不清楚该法规是否直接或间接(15). 这个目前的研究表明，FLI1对GATA2的调节至关重要对于巨核细胞的承诺。FLI1基因敲除的RNAseq分析细胞确实鉴定出至少47个与巨核细胞分化ITGB3（CD61），ITGA2B（CD41）和梅斯1(图。第1部分). 人类ITGAB3公司启动子包含结合位点对于GATA2，进一步证实了GATA2在巨核细胞中的作用区别。事实上，在高危急性髓细胞白血病中，3q21和3q26之间的染色体重排经常发生与血小板和巨核细胞数量增加有关(40). 3q重排在EVI1（或MECOM）位点附近重新定位GATA2增强子EVI1和GATA2过度表达导致巨核细胞的数量。删除小鼠体内的GATA2增强子也导致分化显著减少巨核细胞和红细胞的祖细胞(41). 此外，在inv（16）白血病中CBFβ-MYH11融合通过阻断GATA2/KLF1的表达与平衡干扰涉及这两个因素的转录程序(42). 虽然K562红白血病细胞不要表达FLI1(14),GATA2在这些细胞中的过度表达诱导巨核细胞分化和阻止红细胞成熟(43). 总的来说，目前的结果研究表明，GATA2的FLI1调节对于巨核细胞分化。

在分化过程中，祖细胞经历成熟过程成为成熟的血细胞。这个过程涉及几个可能由以下因素控制的细胞分裂TF。GATA1表达控制红细胞分化。什么时候？HEL细胞中GATA1被击倒红系分化也与细胞增殖率显著降低(图2F). 由于Fli-1是一个癌基因激活负性调节GATA1表达，导致该转录因子的下调和最终导致发育的红系分化红白血病。事实上，一些研究报告了一种作用GATA1在各种细胞增殖和分化中的作用涉及多种促生长基因的癌症类型包括PI3K系列(44，45). 虽然本研究提供了分化和增殖之间的相关性，至少对于GATA1，其他转录因子在增殖速度可能需要额外的事件来控制细胞部门。

FLI1同源基因ERG也与这两者有关造血干细胞扩增与造血(16). 然而，FLI1和不同造血细胞的ERG不同，提示不同的或重叠函数(16).与FLI1相似，ERG在造血细胞中过度表达影响红系和巨核细胞分化(46). 值得注意的是，ERG的表达在过度表达FLI1的红白血病细胞中可以忽略不计(29). 这就增加了以下可能性：FLI1和ERG在红系期间可能发挥相反的功能分化和转化。本研究表明，与FLI1相比，ERG阻断GATA2及其受体的表达红白血病细胞过度表达抑制巨核细胞区别。它还显示FLI1抑制ERG表达通过下调GATA1。这些结果表明FLI1和ERG在红细胞和巨核细胞中的相反作用区别。本研究首次做到最好据作者所知，GATA1/2可能会控制通过抑制ERG实现巨核细胞分化。

在小鼠功能性消融研究中，LDB1具有已证明对胚胎红细胞生成和血岛至关重要形成(47). LDB1促进红系伙伴的核组织β-珠蛋白基因启动子启动转录红系分化(48).与这些报告相反，LDB1和LMO2显示在红细胞负性调节因子的研究现状红白血病细胞的分化(49). 本研究还表明FLI1基因敲除诱导红白血病细胞高表达人类LDB1和LMO2，支持这些基因在促进红系分化。因此，shRNA-介导LDB1下调导致红细胞表达减少分化标记物，提示LDB1的积极作用，以及可能是LMO2，在红系分化中。Giraud的研究等(24)揭示了这一点FLI1和LDB1之间的相互作用对于激活红白血病细胞中的巨核细胞基因。值得注意的是，在本研究中的红白血病细胞，LDB1敲除诱导FLI1及其靶GATA2的下调，这两个关键巨核细胞分化的因素。因此，LDB1消融导致巨核细胞生成抑制CD41a/CD61标记下调，MEIS1表达下调。这一结果表明LDB1和GATA2是巨核细胞分化，受FLI1控制。LDB1烧蚀实验还表明，一定的阈值水平LDB1的表达使FLI1能够阻断红系分化。虽然LDB1本身不是转录因子，但它可能影响FLI1、ERG和其他因子通过蛋白质相互作用。事实上，据报道，LDB1与FLI1在红白血病细胞(24).此外，据报道FLI1抑制可以调节其自身转录(50). 总的来说，转录因子和LDB1的结合可以影响命运MEP向红系或巨核细胞分化。这些因素共同构成了一个复杂的网络影响MEP命运的蛋白质相互作用可能需要在未来的研究中进一步分析。

最后，转录因子KLF1红细胞分化调节因子(36–39),在本研究中被证实受到FLI1，GATA1积极支持。KLF1和GATA1表达协同激活红系细胞中的红系基因表达(39). 值得注意的是，在LDB1敲除中细胞，而GATA1水平显著升高细胞失去了对红系分化的承诺。作为FLI1复合体LDB1对巨核细胞生成至关重要(24)，此交互也可以控制祖细胞对红系膜的承诺，一个概念这应该在未来的研究中解决。虽然复杂程度不同众所周知，这些因素的约束对于对于不同血统的MEP，本研究提供了一个新的对微调电平的调节电路的感知红系和巨核细胞分化。

补充材料

支持数据

支持数据

致谢

不适用。

基金

本研究得到了来自国家自然科学基金（批准号：U1812403）和82260040）致YBD贵州省[批准号：QKHJC-ZK（2022）YB297，QKHJC-ZK（2023）YB240和QKHJ-ZK（2020）YB569]及重点实验室贵州省和中国天然产物化学XX科学院研究经费[批准号：TCZJZ（2022）03]CW和贵州医科大学研究基金（批准号：。RN21025）至BG。

数据和材料的可用性

本研究中产生的数据可能是请求相应作者提供。

作者的贡献

CW、MH、WL、YK、AH、KY、LH和XX对研究的概念、设计以及数据采集和解释。CW执行了实验并编写了手稿。CW、MH参与数据分析和统计。YB、EZ、XX和BG为批判性地研究和审查手稿。XX和YB确认所有原始数据的真实性。YB监督和设计了这项研究。所有作者都对研究结果，审查并编辑了手稿。所有作者阅读和批准了最后的手稿。

道德批准和同意参与

不适用

患者同意发布

不适用

竞争性利益

作者声明他们没有竞争对手利益。

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