本文在以下内容中提到：

介绍

膝关节骨性关节炎（KOA）是一种常见病影响中老年人生活质量的因素个人(1). 使用随着社会的老龄化，KOA的发病率逐年增加(2). 临床表现包括关节疼痛、肿胀、运动受限和关节摩擦，而疾病的末期会导致残疾(三). KOA的原因主要与性别、年龄、肥胖、遗传因素、机械力和先天性关节异常等因素。KOA就是结果退化和软骨细胞、细胞外基质和软骨的合成。它是由机械和生物因素共同作用引起的导致退化和软骨下骨的合成和关节软骨是其特征和基本病理KOA变更(4–6).

软骨细胞，软骨的核心成分组织，具有维持正常结构和软骨的生理学。当软骨细胞的数量例如由于自噬、衰老和细胞凋亡而减少，软骨的结构和功能受到影响(7–10). 聚[ADP-核糖]聚合酶-1（PARP-1）依赖性细胞死亡，称为parthanatos(11–13)由PARP1过度激活引起，PARP1催化细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的分解代谢生产聚[ADP-核糖]（PAR），PAR被转运到细胞质与线粒体外表面结合，导致凋亡诱导因子（AIF）的释放和巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）的招募细胞核，在那里它作为DNA内切酶与核酸外切酶G诱导染色质凝聚和DNA断裂，产生长度约为50 kb的片段并诱导parthanatos中的细胞凋亡(12，14，15).没有研究表明PARP1/AIF与软骨细胞凋亡。

荣进娘娘坊（RJNTF）源于“清”陈氏学者编纂的《宫培方济成》它由六味草药组成，牛膝属双齿类布鲁姆（牛西），当归（橄榄色）狄尔斯（当归），Heracleum铁杉迪尔斯（杜霍），韦伯巴里亚纳汉森尼亚（Fedde ex H.Wolff）皮姆（羌）霍），防风（Turcz.）Schischk（方风）和乌拉尔甘草Fisch（干草）。作为一名知名人士传统的中国民间医学，它被用来给肿胀的循环，缓解关节痛引起的疼痛，滋补肝肾，促进血液循环；它是通常用于治疗各种疾病，包括KOA(16). 众所周知已知RJNTF的活性成分直接作用于软骨细胞(17，18)，但其作用机制尚未但已被彻底调查和解释。目标本研究旨在为其应用提供科学依据RJNTF治疗KOA。RJNTF是否可以通过调节PARP1/AIF信号抑制软骨细胞凋亡通路。进一步阐明该药物的作用机制并评估其作为KOA治疗的潜力，目前的研究研究RJNTF对软骨细胞凋亡的抑制作用通过基于网络的PARP1/AIF途径的调节药理学分析工具和在体外实验。最后，本研究的结果表明PARP1能有效抑制软骨细胞凋亡对民间行为机制的新理解医学，有助于促进民间医学的临床翻译为KOA的治疗提供重要参考进一步研究和临床实践。

材料和方法

网络药理学分析

正常人软骨和KOA软骨的数据从基因表达总览检索并下载数据库（登录号：GSE75181）(19)和合并的基因表达使用R（版本4.0.5）中的limma包分析矩阵和R Studio（版本4.0.5）(20–22)筛选差异表达基因（DEG）。的DEGKOA是通过使用标准|log2（倍数变化）|≥1和P形容词<0.05，火山图使用Hiplot Pro绘制（BGI Group；网址：http://hiplot.com.cn/). 繁体中文药物系统药理学（TCMSP）数据库(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)习惯了识别RJNTF的活性成分，然后使用搜索工具用于相互作用的化学品(网址：http://stitch.embl.de/)数据库用于检索每种活性成分的潜在靶点。维恩图是用于可视化RJNTF与DEG的重叠目标科威特航空公司。蛋白质相互作用（PPI）分析用于Cytoscape软件的BisoGenet插件（版本3.8.2）(23)，并根据关于使用CytoNCA插件的拓扑参数(http://apps.cytoscape.org/apps/cytonca)获得RJNTF的关键目标(24). 京都基因百科全书基因组（KEGG）途径富集分析在RJNTF的潜在目标是KOA的常见DEG，使用R中的clusterProfiler包（版本4.0.5）；潜在目标获得了与凋亡相关的信号通路利用Cytoscape构建靶向信号通路图(25，26).

初级试剂和抗体

RJNTF包括牛膝，当归、白芷、白芷，防风和乌拉尔甘草位于比例为4:2:3:2:2。RJNTF的煎煮方案包括以1:10的固液比加水，煎三次每次1.5小时，然后每次过滤液体以去除混合前的渣滓，混合后的蒸发将液体冻干成粉末，并储存冻干的真空干燥箱中的粉末（制备方法和用途国家发明专利授权配方；专利号。ZL201710284659.8和ZL201810899834.9）(27). 细胞计数试剂盒-8（CCK-8）试剂购自MedChemExpress。DAPI购自北京索拉比奥科技有限公司Novolink™聚合物检测系统购自福州迈新生物科技Co.Ltd.购买Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒L-DMEM购自南京科创生物技术有限公司上海巴赛尔传媒科技有限公司过氧化氢（H）2O（运行）2)FBS从MilliporeSigma公司。构建PARP1敲除慢病毒载体由上海基因化学有限公司提供。PCR引物和核使用的细胞质蛋白提取试剂盒来自上海生物技术有限公司PARP1抑制剂PJ34购自MedChemExpress公司。

关节的分离和培养软骨细胞

共30只雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（4周龄；80±10 g）购自SLAC实验动物科技有限公司【动物许可证编号SCXK（Hu）2019-0007】和用于从膝关节软骨中获取软骨细胞，这相对容易获得。4周龄的软骨细胞大鼠处于活跃的生长发育期，它们的新陈代谢是软骨细胞数量多，因此可以更好地适应在体外文化环境(28，29).根据《动物护理和使用》收集组织福建中医药大学委员会（IACUC发布编号：FJTCM IACUC 2022044）和赫尔辛基。对4周龄SPF级SD雄性大鼠实施安乐死腹腔注射100 mg/kg戊巴比妥钠。这个使用呼吸停止和心率来确认老鼠的死亡。获得了膝关节的软骨在无菌条件下。用PBS 3冲洗软骨次，然后用手术刀片切成1×1×1-mm的块，再次用PBS清洗，并转移到60-mm培养皿中；5ml含有1%青霉素的0.2%II型胶原酶溶液，链霉素和两性霉素B三重抗生素溶液从上海巴赛尔传媒科技有限公司购买置于5%CO的细胞培养箱中2和37°C为了进行消化，每2小时收集一次细胞。上清液为用吸管吸出并通过200米尼龙过滤筛子。滤液转移到15 ml Eppendorf管中，在室温下以1000×g离心3分钟去除上清液；使用4 ml完整培养基重新悬浮细胞颗粒，然后在T25细胞中均匀培养培养瓶培养软骨细胞。通过添加5 ml 0.2%胶原酶溶液进行消化原60-mm培养皿中含有1%抗生素总共三次。24小时后，更换培养基当细胞粘附后，每2次更换培养基天。用倒置光显微镜观察细胞生长。当细胞汇合达到~90%时，软骨细胞用2.5 g/l胰蛋白酶（Promega公司）和0.02%继代培养EDTA公司。第二代软骨细胞用于随后的实验。

细胞活力测定

根据制造商的说明，aCCK-8试剂盒用于单独评估不同浓度的H2O（运行）2、PJ34和RJNTF对软骨细胞活性的影响。第二代软骨细胞接种在96个板中（2000个细胞/孔）然后暴露于H2O（运行）2持续4小时（0、100、200、，300、400、500、600、700或1000µM），PJ34持续4.5小时（0.001、0.01、，0.1、1、10、100或1000µM）和RJNTF（0、100、200、400、800、，1600、3200、6400或12800微克/毫升），持续24、48或72小时，分别是。用10%CCK-8溶液处理每口井在37°C下再培养2小时。吸光度在450 nm，使用EnSpire®多模平板阅读器（PerkinElmer公司）。

DAPI染色

软骨细胞（2×105细胞/孔）接种到细胞爬行器中，放置在6孔板中。24小时后孵育后，将细胞爬行转移到一个新的6孔中然后用PBS清洗两次。固定后用4%多聚甲醛固定液（Beyotime生物技术研究所）30分钟后用PBS冲洗两次，软骨细胞在室温下用500µl DAPI染色10分钟，然后用PBS洗涤两次，每次洗涤共3分钟在徕卡DMi8反向荧光下观察形态显微镜（徕卡微系统公司）。

流式细胞术

使用Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒根据制造商的协议。简单地说，软骨细胞收集软骨细胞并用PBS冲洗两次用500µl 1×结合缓冲液标记5µl PI和5µl AnnexinV-FITC在黑暗中放置15分钟。使用Cyto-FLEX流式细胞仪（Beckman Coulter Inc.）和CytExpert（版本2.4；Beckman Coulter，Inc.）。

PARP1的拆卸

软骨细胞（2×105细胞/孔）播种成96个板。短干扰RNA（si）阴性对照（NC），si-PARP1#1（阳性病毒114447），si-PARP1#2（阳性病毒114448）和si-PARP1#3（阳性病毒144449）绿色荧光蛋白购自GeneChem，Inc。(表一). 24小时后，病毒储存在−80°C下，需要时取出，放在冰上解冻。这四种病毒被分别稀释成多种感染率（MOI）为100、50和10，使用完全培养基。这个从细胞中丢弃培养基，并使用核酸核酸转染试剂盒（上海基因化学有限公司）浓度为1×108TU/ml和有效转染增强剂HiTransG A和HiTransG P（基因化学公司）根据分组添加，并在37°C，含5%CO2，持续16小时。转染后用10%FBS-DMEM替换培养基，在37°C，含5%CO248小时，转染在荧光显微镜下评估效率。这个转染效率计算如下：转染效率=（荧光电池数量/电池总数）×100.挑选出转染效率高的病毒后，复制软骨细胞凋亡模型。

表一。 si-PARP1和si-NC序列。

表一。

si-PARP1和si-NC序列。

基因	序列(5′-3′)
PARP1-RNAi（114447）	GCTGATCTGGAATAGAGA公司
PARP1-RNAi（114448）	GGAGGCAAGTTGACAGGATCT公司
PARP1-RNAi（114449）	GCACAGTATACGGCAGTAACA公司
硅-碳	TTCTCCGAACGTGTCACGT公司

[一]PARP1，聚乙烯[ADP-核糖]聚合酶-1；si-NC，短干扰RNA-阴性控制；RNA干扰。

逆转录定量PCR（RT-qPCR）

软骨细胞（3×106细胞/孔）在6孔板中播种，并用上述其中一种处理不同的siRNA结构。从细胞中提取总RNA使用三唑®试剂（Invitrogen；Thermo FisherScientific，Inc.），并测量RNA浓度。cDNA是使用Evo M-MLV RT试剂盒（湖南Acre生物工程有限公司），并根据制造商的协议进行放大使用SYBR Green Pro Tap（湖南英亩生物工程有限公司。，Ltd.）在Bio-Read CFX96放大器上。热循环条件95°C持续3分钟；然后在95°C下进行40次放大循环10秒和60°C 30秒。β-actin用作内部对照组，相关基因表达归一化为β-actinmRNA表达和使用2-ΔΔCq方法(30). The sequences of the引物列于表二.

表二：。 反向使用引物序列转录定量PCR。

表二：。

反向使用引物序列转录定量PCR。

基因	正向底漆(5′-3′)	反向底漆(5′-3′)
第1部分	CTTGGTGGAGTACGATGAC公司	GGTGTAGAGAGATGGAGAG公司
β-肌动蛋白	TCACCCACCTGTGCCCATCTAGA公司	CATCGGAACCGTCATTGCGATAG公司

[一]PARP1，聚乙烯[ADP-核糖]聚合酶-1。

蛋白质印迹

用冷PBS洗涤细胞三次吸干，然后120µl RIPA（Beyotime Institute of添加添加1 mM PMSF的生物技术缓冲液30冰上最小值；培养皿每10分钟摇晃一次将裂解液转移到1.5 ml EP管中，该管在在12000×g下4°C持续5分钟。收集上清液总共5µl上清液用于BCA蛋白定量，将5×SDS-PAGE蛋白取样缓冲液添加到剩余的样品中上清液。提取细胞核和细胞质蛋白根据制造商的说明，使用Nuclear和细胞质蛋白提取试剂盒（Beyotime Institute of生物技术；猫。编号P0028），缓冲液与蛋白质上清液，然后在恒温金属浴中加热99°C持续10分钟，使蛋白质充分变性并储存在−80°C。每条车道共装载30µg蛋白质样品用10%或15%的SDS-PAGE在30 V下分离10分钟，80 V下分离30分钟分钟，110 V持续55分钟，然后转移到0.45-µmPVDF膜；15%的PAGE凝胶用于caspase-3，裂解caspase-3、AIF、MIF、组蛋白和β-actin，而10%的PAGE凝胶用于PARP1、裂解的PARP1，PAR和β-肌动蛋白。两者都是目标蛋白和相应的内部参照物相同的膜；这被切成条状，每个都被探测以确保每个蛋白质都能与特异性抗体。用NcmBlot堵塞膜后在25°C下封闭缓冲液10分钟，用抗PARP1的一级抗体（1:5000；Proteintech Group，Inc。；猫。编号66520-1-Ig），caspase-3（1:1000；Proteintech Group，Inc。；猫。编号19677-1AP），裂解PARP1（1:1000；细胞信号科技公司。；猫。94885S），裂解半胱天冬酶-3（1:1000；Cell Signaling Technology，Inc.公司。；猫。编号9661S），PAR（1:200；Enzo生命科学公司。；猫。编号ALX-804-220-R100），AIF（1:1000；类别。编号5318S；Cell Signaling Technology，Inc.），MIF（1:1000；Abcam；猫。编号Ab175189），β-肌动蛋白（1:1000；细胞信号技术，股份有限公司。；猫。编号8457S），或组蛋白（1:1000；Abcam；目录编号Ab1791）在4°C下过夜。第二天，用TBST（含0.1%吐温-20，10X的TBS）三次，随后与相应的HRP共轭次级抗体（1:20000；Cell Signaling Technology，Inc.；类别号。7074S）在25°C下冲洗1h。用TBST，并使用Bio-Read ChemiDoc MP可视化信号成像系统（Bio-Read Laboratories，Inc.），使用增强型化学发光蛋白质印迹底物。密度分析为使用ImageJ执行（win64版本；国家研究院健康）并归一化为各自的β-肌动蛋白或组蛋白乐队。

协同免疫沉淀（IP）测定

抗AIF的稀释抗体（400µl）（1:1000；cat。编号5318S；Cell Signaling Technology，Inc.），MIF（1:1000；目录号。Ab175189；Abcam）和β-肌动蛋白（1:1000；目录号8457S；细胞Signaling Technology，Inc.）被吸入50µl磁珠中并充分混合，然后在4°C下孵育2 h。磁化后分离，收集磁珠，500µl磷酸盐缓冲盐水（上海巴赛尔传媒科技有限公司。，有限公司），磁珠混合良好磁性分离后，上清液被丢弃。正在清洗执行了四次。总共200µl裂解缓冲液（Beyotime添加生物技术研究所），然后在4°C下进行裂解30分钟，每10分钟搅拌一次电池，以确保充满与裂解缓冲液接触，然后在4°C下离心在12000×g条件下10分钟。收集上清液并放在一边温度为4°C。BCA定量后，取20µl SDS-PAGE负载缓冲液添加到磁珠中并均匀混合，然后磁珠在99°C下加热10分钟，磁珠分离上清液进行western印迹。

统计分析

使用GraphPad Prism进行数据分析（版本8.0；点式处理）。使用不成对的两样本t检验比较两组之间的差异。对于多个组比较中，使用了单向方差分析，然后是Tukey的事后分析测试。P<0.05被认为是统计学上的差异显著。

结果

网络药理学分析确定关键目标和核心信号通路RJNTF治疗KOA

共有644人发生了显著改变和影响获得了差异基因，包括423个上调基因和221个下调基因(图。1安培). RJNTF共获得45种活性成分使用TCMSP数据库进行筛选，对应234个目标。KOA和RJNTF之间有29个共同目标，如中的维恩图图1B; 这个每种药物对应的活性成分数量为6牛膝Blume，10代表甘草属乌拉尔人Fisch，4个代表韦伯巴里亚纳汉森尼亚（联邦快递H.Wolff）皮姆，3人Heracleum铁杉Diels，11用于防风（Turcz.）Schischk和11当归（橄榄色）狄尔斯(图1C).

图1。 共同目标的识别RJNTF和KOA。（A） 差异火山图在OA中表达基因。患者膝关节样本数据其中OA来自基因表达综合数据库。绿色代表下调基因，蓝色代表上调基因，粉红色表示没有显著变化。（B） 基因文氏图KOA和RJNTF通用。（C） 活性成分和关键RJNTF的目标。绿色方块代表毒品，蓝色钻石代表基因，圆圈代表药物；深红色代表DH，玫瑰红色代表QH的活性成分，黄色代表NX，粉红色代表DG，蓝色代表GC紫色代表FF；RJNTF，荣金年童方；KOA、，膝关节骨性关节炎；PARP1，聚[ADP-核糖]聚合酶-1；DH（决断高度），Heracleum hemsleyanum Diels；QH，汉森尼亚weberbaueriana（Fedde ex H.Wolff）皮姆；NX，牛膝双齿苋；DG，当归（Oliv）Diels；GC、，乌拉尔甘草；FF，Saposhnikovia公司divaricata（Turcz.）Schischk。

RJNTF治疗的主要目标KOA的

RJNTF治疗KOA的目标是导入Cytoscape以生成PPI网络，总共1966个相关目标和48840个目标对目标得到了相关关系；插件CytoNCA更进一步用于根据拓扑过滤网络节点使用度中心值的属性，之后，531相关目标和2218个目标-目标相互关系通过排除无关节点获得。最后，143个关键目标通过以下方法获得3600个目标-目标相互关系利用中间性中心值进行筛选，包括STAT3，PI3K、RAF、RAS、AKT、PARP1和JALK2，其机制包括增殖、炎症和凋亡。在层之后筛选发现PARP1是一种特殊的凋亡靶点几个目标(图2A).

图2。 网络药理学分析RJNTF对软骨细胞凋亡的调控。（A） 的过程PPI网络的拓扑筛选和蛋白质相互作用。（B） RJNTF的靶向途径图。粉红色圆圈代表目标，绿色钻石代表路径；凋亡的目标和路径以深红色突出显示。RJNTF，荣进年芳；PPI，蛋白质相互作用；PARP1，聚乙烯[ADP-核糖]聚合酶-1。

RJNTF的核心信号通路处理KOA

KEGG分析结果表明，RJNTF可以通过干扰多种信号通路来治疗KOA，例如NF-κB、凋亡、HIF-1信号通路、JAT-STAT信号通路和IL-17信号通路(图2B) (31–34).根据之前大量研究的结果显示PARP1/AIF通路与细胞凋亡密切相关(35–37)，而网络的结果药理学表明，RJNTF对KOA的治疗是与PARP1凋亡途径相关；然而，没有评估PARP1/AIF途径之间关系的研究软骨细胞凋亡。因此，后续设计实验以确定潜在的机制。

抑制软骨细胞凋亡通过调节PARP1/AIF途径

正常软骨细胞的特征如所示图3A.在软骨细胞培养的反相对比光学观察显微镜下，1天后，软骨细胞完全附着在细胞壁开始分裂和生长，大多数细胞圆形或椭圆形。培养7天后，软骨细胞数量显著增加，并以路面；这些簇相互连接在一起，扩散速度加快。当细胞当它们长大到80%的密度时，可以进行继代培养以获得F1软骨细胞。培养3天后，细胞质核丰富，可以清楚区分，边缘细胞很锋利。培养约4天后，F2细胞可以通过替换获得；此时F2细胞仍可能保持较好的形态，没有明显的肥大和降解，而F3细胞似乎有更多肥大和退化的细胞，边缘重叠模糊，伪足增多，增殖速度减慢。因此，F2选择细胞进行后续细胞实验。在图3B，细胞外胶原蛋白II用免疫细胞化学方法对软骨细胞基质进行染色方法），细胞质呈棕黄色细胞核呈蓝色。在阴性组中细胞核呈蓝色，而没有褐色在细胞质中可见。结论是，实验细胞可以合成胶原蛋白II和蛋白聚糖，并具有功能对软骨细胞进行鉴定。CCK-8分析结果表明，软骨细胞的抑制率增加随着H的增加2O（运行）2浓度(图4A). 同样，流式细胞术结果还表明，细胞凋亡率随着增加H2O（运行）2浓度(图4C). 随后，使用DAPI染色，与对照组相比，模型组治疗500µM H2O（运行）2，在早期细胞凋亡，表现为细胞核凝结，导致细胞核DAPI染色不均匀是由于细胞核侧面的染色质。在凋亡，凋亡细胞的细胞核呈圆形不同大小的小泡，可能是凋亡小泡(图4B). 蛋白质印迹结果表明，与对照组相比模型组PARP1的表达减少劈开的PARP1增加(图。4D-F型)表明关节软骨细胞模型成功建立了细胞凋亡模型，可用于随后的实验。

图3。 形态分析和正常软骨细胞的特征。（A） 形态学用倒置相观察软骨细胞的变化对比光显微镜。（a） 第1天的原代细胞培养；（b）第7天的原代细胞培养；（c） 第一子代细胞培养第3天；（d） 第二代子代细胞培养第1天；（e） 第二代子代细胞培养第2天；（f）第二天进行第三代子代细胞培养。放大倍数，×100.（B）胶原蛋白II免疫细胞化学染色。胶原蛋白II细胞质中呈棕黄色，细胞核染上蓝色。放大倍数，×200。

图4。 复制和表征关节软骨细胞凋亡模型。（A） 的影响不同浓度的H2O2软骨细胞抑制率。（B） DAPI染色鉴定凋亡模型。放大倍数，×200。（C） 不同的影响H2O2浓度对细胞凋亡率的影响软骨细胞。（D） PARP1和裂解蛋白表达水平软骨细胞中的PARP1。相对的定量分析（E）PARP1和（F）的蛋白表达水平裂解了PARP1。*与对照组相比，P<0.05。PARP1，聚[ADP-核糖]聚合酶-1；过氧化氢。

PARP1击倒对软骨细胞凋亡

三种病毒的转染效率使用HiTransG P转染增强时达到>80%解决方案和100的MOI。有效转染条件对于包括MOI=100在内的所有三种PARP1敲除慢病毒转染增强试剂为HitransG P和转染后改变溶液的时间为16小时(图5A). 的结果RT-qPCR和western blotting显示PARP1表达转染si-PARP1#3的细胞中含量最低(图5B-D); 因此，使用了这个构造用于所有后续实验。流式细胞仪结果显示si-PARP1组软骨细胞凋亡减少与si-NC组相比。与si-NC相比组，si-NC细胞凋亡率增加+H（H）2O（运行）2组。软骨细胞凋亡率si-PARP1+H降低2O（运行）2组与si-NC+H相比2O（运行）2组(图5E和F). 与此同时，它被发现了PARP1的敲除导致PARP1减少，裂解PARP1、PAR和细胞核AIF和MIF水平，以及细胞质AIF和MIF表达（P<0.05）；图6A-I). 总之，击倒PARP1有效抑制软骨细胞凋亡。

图5。 转染的效果PARP1基因敲除慢病毒对软骨细胞凋亡的影响。（A）不同处理条件下eGFP荧光强度并转染PARP1敲低慢病毒。放大倍数，×100。PARP1（B）mRNA和（C）蛋白表达三种不同PARP1敲除转染后的水平慢病毒*与si-NC组相比，P<0.05。（D） 定量分析PARP1的相对蛋白表达水平*P<0.05与。si NC组。（E） 以下各组软骨细胞凋亡PARP1击倒。（F） 软骨细胞凋亡率分析不同的群体*与si-NC组相比P<0.05#P<0.05与si-NC+H2O2组相比。si，小干扰RNA；NC，阴性对照；感染多重性；第1部分，聚[ADP-核糖]聚合酶-1；过氧化氢，过氧化氢。

图6。 PARP1击倒对PARP1/AIF通路相关蛋白的表达。（A） 蛋白质半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3、裂解半胱氨酸蛋白酶-3、PARP1、裂解不同处理下软骨细胞中的PARP1和PAR组。相关蛋白表达的定量分析（B）半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3、（C）裂解半胱天冬酶-3、（D）PARP1、（E）水平裂解PARP1和（F）PAR.*P与si-NC组相比<0.05；#与si-NC+H2O2组相比，P<0.05。（G） AIF和MIF在细胞核和细胞质中的蛋白表达不同处理组的软骨细胞。定量（H）AIF和（一） MIF公司*与si-NC组相比P<0.05#P<0.05与。si-NC+H2O2组。PARP1，聚[ADP-核糖]聚合酶-1；聚ADP-核糖；AIF，凋亡诱导因子；迁移抑制因子；ns，不显著；si，小干扰RNA；NC，阴性对照；过氧化氢，过氧化氢。

PJ34介导的抑制PARP1对软骨细胞凋亡的影响

细胞凋亡与靶PARP1密切相关，虽然PJ34是一种常用的PARP1抑制剂对软骨细胞的抑制作用尚不清楚。要确定PJ34的细胞毒性作用，软骨细胞在不同浓度（0、0.001、0.01、0.1、1、10、100和1000µM）4.5小时。PJ34对软骨细胞的活性没有影响在所有测试浓度下(图。第7章). 基于先前的研究(12)，选择10µM PJ34用于随后的实验。此外，当细胞用PJ34盐酸盐进行预处理，表明PARP1依赖性通路在软骨细胞中起关键作用细胞凋亡(图7B和C). 收件人了解作用机制并确定PJ34的影响在软骨细胞上，关键因子的免疫印迹分析是执行。与模型组相比，蛋白表达PAR、细胞核AIF和MIF水平下调，而胞浆AIF和MIF在抑制剂中上调组（P<0.05），蛋白表达差异半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3、裂解半胱氨酸蛋白酶-3、PARP1和裂解PARP1的水平没有统计学意义。Co-IP的结果表明AIF与MIF相互作用，这种相互作用减少了通过添加PJ34。总之，抑制PARP1有效减少软骨细胞凋亡(图8A-K).

图7。 PJ34介导的PARP1的作用抑制软骨细胞凋亡。（A） 不同的影响PJ34浓度对软骨细胞活性的影响。（B） 分析不同组软骨细胞凋亡率*P<0.05与。对照组，#P<0.05 vs.H2O2组。（C） 不同治疗方法对软骨细胞凋亡率的影响组。Ns，不显著；过氧化氢、氢气过氧化物；PARP1，聚[ADP-核糖]聚合酶-1。

图8。 PJ34介导的PARP1的作用抑制PARP1/AIF通路相关蛋白的表达。（A） 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3、裂解半胱氨酸蛋白酶-3、，每个治疗组软骨细胞中的PARP1、裂解PARP1和PAR组。相关蛋白表达的定量分析（B）半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3，（C）裂解半胱氨酸蛋白酶-3（D）PARP1，（E）水平裂解PARP1和（F）PAR。（G）AIF和软骨细胞核和细胞质中的MIF不同治疗组。相对的定量分析（H）AIF和（I）MIF的蛋白表达水平。（J） IP分析AIF合并MIF，其中免疫沉淀物为AIF。（K） 分析AIF和MIF蛋白相互作用*与对照组相比P<0.05；#与过氧化氢组相比，P<0.05。第1部分，聚[ADP-核糖]聚合酶-1；聚ADP-核糖；AIF、，凋亡诱导因子；迁移抑制因子；过氧化氢；ns，不显著；IP，免疫沉淀。

RJNTF抑制软骨细胞凋亡通过调节PARP1/AIF途径

如上所述，软骨细胞凋亡至少部分由PARP1/AIF途径介导。使用CCK-8最终选择800、1600和3200µg/ml RJNTF进行检测，以将细胞处理48小时以进行后续实验(图9A). 流式细胞术结果结果表明，与模型组相比RJNTF低、中、高剂量组软骨细胞减少组，RJNTF中软骨细胞的凋亡率高PJ34治疗组剂量组较低（P<0.05）；图9B和C). Western blotting显示与模型组相比，蛋白质表达水平裂解半胱天冬酶-3、裂解PARP1、PAR和细胞核AIF和MIFPARP1、caspase-3和细胞质AIF和RJNTF中、高剂量组MIF上调（P<0.05）。与抑制剂组相比，caspase-3和PARP1RJNTF高剂量组蛋白表达水平上调组、裂解caspase-3、裂解PARP1和蛋白表达RJNTF高剂量组水平下调（P<0.05；图10A-F). AIF和MIF蛋白在两种细胞的沉淀物中检测到表达水平模型组和RJNTF组，表明AIF和MIF之间的相互作用，并且这种相互作用被减少添加RJNTF后(图。11A-E公司). 综上所述，RJNTF可以有效降低软骨细胞通过抑制PARP1/AIF途径凋亡。

图9。 RJNTF抑制软骨细胞凋亡通过调节PARP1/AIF途径。（A） 软骨细胞用不同浓度的RJNTF培养24、48或72 h。使用细胞计数试剂盒-8评估细胞活力化验。（B） 软骨细胞凋亡率分析不同的群体。（C） 软骨细胞凋亡率不同的群体*与对照组相比P<0.05；#与过氧化氢组相比P<0.05，$P<0.05与RJNTF组相比，▲P<0.05与。3200µg/ml RJNTF组。PARP1，聚[ADP-核糖]聚合酶-1；AIF，凋亡诱导因子；RJNTF、荣金娘通范；过氧化氢。

图10。 RJNTF对PARP1/AIF路径相关蛋白。（A） 蛋白质表达半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3、裂解半胱氨酸蛋白酶-3、PARP1、裂解PARP1和不同治疗组软骨细胞中的PAR为已确定。相关蛋白质的定量分析（B）半胱天冬酶-3，（C）裂解半胱天蛋白酶-3（D）的表达水平PARP1、（E）裂解PARP1和（F）PAR.*与对照组相比P<0.05；#与过氧化氢组相比P<0.05；与RJNTF组相比，$P<0.05；▲P<0.05与。3200微克/毫升RJNTF。PARP1，聚[ADP-核糖]聚合酶-1；PAR，聚乙烯ADP-核糖；AIF，凋亡诱导因子；过氧化氢。

图11。 RJNTF对PARP1/AIF路径相关蛋白。（A） AIF和MIF的表达各组软骨细胞的细胞核和细胞质中。相对蛋白质表达水平的定量分析（B） AIF和（C）MIF*与对照组相比P<0.05；#与过氧化氢组相比，P<0.05。（D）用MIF对AIF进行免疫沉淀分析，其中IP为AIF。（E） AIF和MIF蛋白质相互作用分析*P<0.05与。过氧化氢组。PARP1，聚[ADP-核糖]聚合酶-1；AIF，凋亡诱导因子；MIF，迁移抑制因子；免疫沉淀；过氧化氢；ns，不是重要。

讨论

蛋白质的网络药理学分析相互作用表明，RJNTF对KOA通过调节STAT3、PI3K、RAF、RAS、AKT、PARP1、JALK2和PARP1太阳等(38)发现TANK-binding kinase 1（TBK1）高表达通过建立C57BL/6 J骨性关节炎动物模型测定KOA水平老鼠。TBK1激活JAK/STAT信号通路，并击倒TBK1抑制细胞外基质降解。有益的通过转染细胞，TBK1基因敲除的作用被消除STAT3过表达质粒。AKT1是一个重要的下游PI3K/AKT信号通路中的靶激酶，可以调节mTOR信号通路和IL-1β诱导的其他通路软骨细胞增殖，并可减少细胞凋亡(39). 已经证明Ras独立抑制Erk1/2的激活。这种效果是与转录因子活性降低有关，如Elk-1通过抑制KOA软骨降解过程中的分解代谢因子(40). 上述结果认为KOA的作用机制包括扩散，炎症与细胞凋亡(41–44).

KEGG分析表明，RJNTF发挥了其作用通过干扰多种信号通路，如NF-κB途径、凋亡途径、HIF-1信号途径、JAT-STAT信号通路、IL-17信号通路和其他治疗膝关节的信号通路(45–48).NF-κB与炎症和网络药理学密切相关与在体外实验证实风湿骨痛胶囊治疗KOA的作用机制是与NF-κB信号通路相关(49). 已经注意到，保持软骨下骨缺氧环境缓解骨关节炎进展。HIF是诱导缺氧基因，修复细胞氧环境并发挥在OA治疗中的重要作用(50，51).已有研究表明，IL-17信号通路高度在KOA患者的滑膜组织中调节，表明IL-17信号通路具有更好的转录反应在KOA软骨细胞和滑膜组织中关节炎疾病中的破骨细胞生成和骨侵蚀；因此，IL-17信号通路可能是一个潜在的靶点KOA治疗和诊断基因(52，53).几种途径在KOA中起调节作用；其中，PARP1与细胞凋亡密切相关(37，54).例如，伴侣介导的自噬可以抑制心肌细胞氧化应激通过抑制裂解的PARP1诱导细胞凋亡蛋白质表达(55); 极光激酶A敲除促进Epstein-Barr细胞凋亡通过卵裂感染病毒的非典型腺细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3和-9以及PARP1(56).此外，PARP-1/AIF在细胞核中的共定位表明PARP-1在AIF介导的碳中起着关键作用离子促凋亡(14).因此，我们假设RJNTF可能发挥抑制作用调节PARP1/AIF对软骨细胞凋亡的影响pathway，随后的实验就是为了测试这一点而设计的假设。

PARP1是一种DNA修复酶，在大多数真核细胞，通过识别结构受损的DNA而激活碎片，被认为是DNA损伤，也是凋亡核心成员蛋白caspase的裂解底物(57). 的主要功能PARP1用于检测和修复DNA断裂(48). PARP1结合DNA链断裂和然后将PAR多聚体转移到PARP1本身，PARP1招募DNA修复机制对DNA损伤的修复。PARP1催化形成组蛋白上的PAR，这允许它诱导染色质松弛在染色质中增加DNA修复机制的活性导致DNA断裂。因此，PARP1被激活的caspase-3激活当损伤太大。在本研究中，发现PARP1结合的DNA链断裂后，软骨细胞被激活caspase-3能裂解PARP1，89-kDa PARP1片段为从受损的DNA中释放出来，因为它不能再结合24kDaPARP1片段到DNA。同时，启动PAR合成导致AIF的释放，转位到细胞核与巨噬细胞MIF结合以及DNA的作用核酸内切酶和核酸外切酶G产生染色质冷凝和DNA断裂(36). 发现这种类型的PARP1抑制剂PJ34可抑制细胞凋亡PARP1和裂解的PARP1的蛋白表达水平没有添加PJ34后发生改变，而PAR表达监管明显下调，AIF和MIF核现象易位被抑制。因此，PJ34进一步抑制AIF通过抑制PAR的合成。

流式细胞术结果显示RJNTF可以通过干扰PARP1/AIF途径。然而，随着RJNTF的加入裂解caspase-3、裂解PARP1和细胞核AIF的表达MIF下降，caspase-3、PARP1和细胞质AIF下降MIF增加，但未表现出剂量依赖性效应RJNTF浓度增加。结合流的结果细胞分析显示，RJNTF高剂量组的细胞凋亡率为低于PJ34组；显著差异建议使用H2O（运行）2建模不不仅影响PARP1/AIF的凋亡途径，而且其他凋亡途径的参与。RJNTF不仅可以抑制通过干扰PARP1/AIF途径，以及其他抑制凋亡的途径，从而在与单一抑制剂相比，抑制细胞凋亡。再一次，这为多靶点定位提供了可靠的实验依据RJNTF在KOA治疗中的多途径作用。

总之，本研究表明RJNTF降低H2O（运行）2-诱导软骨细胞通过PARP1/AIF信号通路的细胞凋亡(图12). 这些发现突出了新颖性了解RJNTF治疗机制的途径，以及为进一步探索和临床提供参考RJNTF的应用。然而，值得注意的是目前的研究是在体外学习地点RJNTF与软骨细胞直接接触。这可能并不反映形势体内因为RJNTF是口服的，而不是清除RJNTF的所有组件是否直接联系口服后的软骨细胞；这将被调查在未来的研究中进一步。

图12。 的潜在作用机制RJNTF抗软骨细胞凋亡。RJNTF被抑制H2O2诱导软骨细胞凋亡抑制PARP1/AIF信号通路。RJNTF，荣进年芳；PARP1，聚[ADP-核糖]聚合酶-1；AIF、，凋亡诱导因子；迁移抑制因子；标准，聚[ADP-核糖]。

致谢

不适用。

基金

本研究得到了国家自然科学局的支持国家自然科学基金（批准号：82074465）福建省基金会（批准号：2022J01843）福建省大学综合医学实验室（福建中医药大学；批准号：。KLIM2022003和CKJ2022003），NATCM的高级项目中医药重点学科建设（中医药）骨科）（批准号zyyzdxk-2023106）和传统FJTCM中国骨科开放课题（批准号：。XGS2023004）。

数据和材料的可用性

本研究中产生的数据可能是请求相应作者提供。

作者的贡献

JC和TZ进行了大多数实验。YD和ZC辅助免疫荧光实验。捷克和XC进行流式细胞术。RW和QL执行了统计分析，撰写、审查和编辑原文手稿。JC和TZ修改了手稿。JC、TZ、QL和RW设计了这项研究。GW构思和设计了这项研究，并写道，审阅并编辑原稿。RW、YD和GW确认所有原始数据的真实性。所有作者均已阅读并批准了手稿的最终版本。

道德批准和同意参与

所有动物都得到了人道的照顾实验方法得到了动物护理和使用部的批准福建中医药大学委员会（中国福州；批准号：FJTCM IACUC 2022044）。

患者同意发布

不适用。

竞争性利益

作者声明他们没有竞争对手利益。

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