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用于分离膜结合多聚体和构建标准化CK cDNA文库的协议

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• 果蝇粗面内质mRNA的分离网状物
• 果蝇cDNA文库的标准化gDNA微珠杂交

果蝇粗面内质网mRNA的分离

Casey Kopczynski，加州大学伯克利分校（古德曼实验室）当前地址：Exelixis Pharmaceuticals，Inc S.San Francisco，CA94080 650-825-2239[电子邮件保护]

该方案已用于生产至少10倍浓缩的RNA样品，用于mRNA编码膜和分泌蛋白与细胞溶质蛋白（C.C.Kopczynski，J.N.Noordermeer，T.L.Serano，W.Chen，J.D。彭德尔顿、S.刘易斯、C.S.古德曼和G.R.鲁宾，1998年，PNAS 95:9973-9978）。

I.粗ER RNA的分离1） 收集10克（约）的8-16小时胚胎，清洗并去角质。2） 将1/2胚胎放入40 ml Dounce均质器中，加入35 ml冰冷均质缓冲区。均质缓冲液---------------------40毫米Tris 7.450毫米氯化钾10毫米氯化镁3毫米DTT0.5mg/ml肝素将1/4 vol的2.5M蔗糖添加到上述->0.5M蔗糖终末中3） 用B杵在冰上均质，然后用A杵。倒入50ml管中冰。如上所述将剩余胚胎均质化。4） 在JS 13转子中，以8K rpm x 10'x 4°的速度在单独的管中旋转匀浆，以沉淀细胞核和线粒体。5） 将线粒体后支持物（PMS）转移到冰上的新试管中。6） 在12ml均质缓冲液中重新提取每个颗粒，旋转，并向PMS中添加浆料。总计此时PMS体积应为~90ml。_可选：苯酚/氯仿提取物2ml PMS，用于普通RNA样品_7） 准备阶梯梯度溶液：步骤A:10.2毫升PMS+20.4毫升2.5毫升蔗糖（最终1.8毫升）步骤B：6.0ml PMS+6.6ml 2.5M蔗糖（最终1.55M）步骤C：66.0ml PMS+46.0ml 2.5M蔗糖（最终1.35M）8） 在4-70Ti超离心管上做标记，指示距离底部2ml，距离底部7ml底部，距离底部28毫升。然后依次添加28ml步骤C、2ml步骤B和7ml步骤A至各管。用均质缓冲液将管子加满，以保持平衡。

将较重的溶液（A和B）添加到较轻的步骤C下，使用连接到tygon的100ul毛细管管道-使用蠕动泵获得缓慢、稳定的液体流动。

9） 在Beckman 70 Ti型转子中旋转48K x 6小时x 4°。与内质网膜结合的多聚体（“粗糙微粒体”或“RM”）密度较低而不是游离多聚体。因此，RM在步骤B中浮动，而游离多聚体通过步骤B然后在管子的底部打球。10） 使用蠕动泵去除步骤B及其上方的混浊物质（RM样品）置于冰上的新试管中（~6ml/梯度）。

这是一种含有大量无污染多聚体的天然RM制剂。

11） 将RM样品分成2-50ml试管（~12ml/试管）。缓慢添加1.2ml 1M KCl在低速旋转时，流向每根管子。然后向每个试管中添加12ml 2.5M蔗糖搅拌均匀（最终约2M蔗糖）。

增加的K+浓度会破坏弱蛋白质与蛋白质的相互作用，并有助于游离来自膜结合多聚体的多聚体。

12） 在8个Beckman SW41试管中各加入6ml RM样品，然后覆盖3ml 1.8M蔗糖（在调节至150mM KCl的均质缓冲液中）和3ml 1.3M蔗糖（in均质缓冲液调节至150mM KCl）。13） 在2个单独的SW41转子中旋转35K x 5.5小时x 4°管。14） 使用蠕动泵，将1.8M/1.3M接口处的混浊材料清除至冰上新导管（约1.6ml/梯度）。该样品（约12ml）代表“清洗过的”RM。15） 从清洗的RM制备RNA：a） 向样品中添加24ml dH20。b） 添加0.36ml 500mM EDTA和3.6ml 10%SDS。如果SDS沉淀，加热简单取样，直到它回到溶液中。c） 用等量的苯酚/氯仿萃取样品，旋转至分离相。d） 向水相中加入1/10体积3M NaAc，pH 5.2，并将样品分成4-SW28管（~10ml/管）。向每个管中添加2.5 vols EtOH，并放置在-20°x外径。e） 在SW28转子中旋转20K x 1hr x 4°管，以造粒RNA。f） 将湿颗粒重新悬浮在0.5ml dH2O中。合并样本并旋转简要地对不溶性物质进行造粒。g） 重复EtOH pptn。在1ml dH20中重新悬浮干颗粒。预计产量为730ug每10克胚胎中含有RM RNA。二、。从RM RNA中选择polyA+RNA我用Promega PolyA Select试剂盒从RM RNA中纯化PolyA+RNA发现大约50%的polyA+RNA对应于“polyA+”线粒体1.4kb的rRNA（果蝇异常）。我能够从通过遵循以下协议，RM RNA，然后我在“线粒体RNA-free”RM RNA。1） 将170ul（500ug）RM RNA加热至65°x 10'。2） 添加2ul（200pmol）生物素化反义mt rRNA寡核苷酸（5'biotin-cctggcttacgcgttgaactcagt）和4.5ul 20X SSC（0.5X SSC最终）。3） 将试管置于装有65°H2O的250ml烧杯中，并在20'以上冷却至37°，然后拆下并坐在RT x 10'处。4） 将退火混合物添加到100ul Promega链霉亲和素磁珠中（按照Promega说明）。5） 培养RT x 10'。6） 将管子放置在磁性支架上x 30秒，然后取下新管子的支撑物。7） 重复步骤4、5和6。8） 使用Promega从“无线粒体RNA”的RM RNA中选择polyA+RNAPolyA Select套件。

我从500ug RM RNA中获得了4ug polyA+RNA，相当于7g胚胎。这只是从未分离RNA样品中获得的polyA+RNA I的产量（步骤6）。我怀疑大部分的粗糙ER仍然与细胞核相关，因此在步骤4中丢失。不管是什么原因在考虑该方案是否适用于其他方案时，相对大量的组织值得注意感兴趣的组织。

通过与gDNA杂交对果蝇cDNA文库进行标准化珠

该协议用于使mRNA在粗糙微粒体中的表达标准化克隆到Bluescript的cDNA文库（C.C.Kopczynski、T.Serrano、G.R.Rubin和C。S.Goodman，准备中）。简言之，cDNA插入物与基因组DNA杂交（gDNA）和从随后洗脱的cDNA制备的标准化文库来自gDNA。一、gDNA珠的制备A.gDNA的消化和大小分级1） 用Sau3A部分消化400ug gDNA，用MaeIII消化另一个400ug cDNA最大DNA量在1-4 kb大小范围内。苯酚/氯仿提取物，EtOHppt，并在200ul TE 7.4中重新悬浮颗粒。2） 将每个消化过的gDNA样本加载到单独的10-40%蔗糖梯度上（10.5mlSW41管中的梯度）。3） 旋转28K x 20小时x 20°4） 用18g针头刺穿试管底部，将300ul馏分收集到Falcon 96孔中板（40个分数）。5） 在琼脂糖凝胶中加入10ul粒级10至34之间的偶数粒级确定尺寸分布。6） 包含1到4kb之间最多DNA但不包含DNA的池部分小于500bp。

这对应于梯度上的分数18、19和20。

7） EtOH ppt混合组分并在150ul dH2O中重新悬浮DNA颗粒。

我从每个梯度中获得了约100ug的DNA。

B.生物素末端标记gDNA1） 在以下反应中分别标记MaeIII和Sau3A-cut gDNA：75.0ul 1-4 kb gDNA（约50ug或约80pmol末端）10.0ul BMB限制性缓冲液M（100mM tris 7.8，100mM氯化镁、500mM氯化钠、10mM二硫苏糖醇）3.3ul 0.3mM生物素-dUTP（1 nmol，ENZO Biochem）1.0ul 32P-dCTP（3.3pmol，3000Ci/mmol）1.0ul 1mM dCTP1.0ul 10mM dGTP1.0ul 10mM dATP2.7升dH2O5.0ul克莱诺（10U）-------100.0升2） 培养37°x 1小时。3） 在2-DEAE滤纸圈上各点1 ul的反应。洗一圈3次用0.5M NaH2PO4，pH 7.2，1x加dH2O，1x用70%EtOH，并让其干燥。通过比较总cpm与上的cpm，确定32P-dCTP的掺入百分比洗过的圆圈。成功的反应将导致5-10%的掺入，具体取决于DNA的大小分布。4） 制造商称，通过Millipore UFMC 100过滤器进行旋转反应去除未合并dNTPS（最重要的是生物素-dUTP）的说明。C.将gDNA与磁珠结合1） 混合MaeIII和Sau3A末端标记的gDNA制剂（总体积180ul），然后煮沸x 5'。2） 在冰浴中快速冷却样品。3） 添加45ul 5M氯化钠和220ul TE 7.4，1M氯化钠。4） 用1ml TE 7.4，1M NaCl在1.6ml Eppendorf试管。5） 将煮熟的DNA添加到珠子中，摇滚30'x RT。6） 将管子放置在磁性支架中。去除上清液并保存为未结合gDNA。

在这一步中，我损失了20%的cpm。

7） 用1 ml TE 7.4，1M NaCl清洗珠子两次。

此步骤中丢失的计数可以忽略不计。

8） 用400ul洗脱缓冲液（30%甲酰胺，10mM Tris 8.0）在65°x 10'的温度下清洗。

这一步去除了不直接与珠子结合的gDNA——我损失了总cpm的10%。

9） 将珠子重新悬浮在400ul TE 7.4、1M NaCl中，储存于4°二、。gDNA珠cDNA文库的筛选A.用于与珠子杂交的单链cDNA的制备1） 用稀切法将粗糙微粒体cDNA文库中的20ug质粒线性化在cDNA插入物的3'端切割的酶。消化后，苯酚/氯仿提取物，EtOH ppt，并在dH2O中重新悬浮质粒。

对于基于Bluescript的库，我分别使用了NotI和SmaI。

2） 进行10个单独的体外转录反应，如下所示：a） 准备反应混合物150升分水120ul 5x Promega体外转录缓冲液（0.5M HEPES-氢氧化钾，pH 7.5，60mM氯化镁，10mM亚精胺，200毫米DTT）120ul 10mM dNTP30ul核糖核酸酶抑制剂（30U，BMB）90ul T7 RNA聚合酶（360U，BMB）-----510升b） 将50ul反应混合物添加到含有10ul（1ug）模板的10个试管中DNA。c） 培养37°x 2小时。d） 添加40ul DNA酶混合物：320ul分水40ul 10x DNaseI缓冲液（200mM Tris 8.0，100mM MgCl2）40ul DNaseI（1200U，无RNase）-----400升e） 培养37°X 15’。f） 合并反应（总计1ml），然后合并苯酚/氯仿提取物样品。g） 添加1/2体积的7.5M NH4Ac和2.5体积的EtOH。h） 在5根微型离心管中旋转20'X 4°。i） 在100ul dH2O中重新悬浮每个颗粒，并合并样品。总收益应为~500ug“cRNA”（每次反应~50ug）。3） 从360ug cRNA中制备第一链cDNA，如下所示：a） 在18-1.5ml微滤管中，分别添加20ul（20ug）cRNA、1ul（1nmol）Pst-T15引物（一种寡核苷酸（dT）引物，在5'端具有Pst位点），19ul dH20。b） 培养65°x 5'，然后快速将试管放在冰上。c） 向每个试管中添加40ul cDNA反应混合物和20ul（4000U，BRL）MMLV-RT。cDNA反应混合物-----------------360ul 5X第一股缓冲器（BRL）180升0.1M DTT90ul 10mM dNTP（2.5M 5M-dCTP*，每个dATP、dGTP、dTTP各2.5M）72ul 32P-dCTP（240pmol，3000Ci/mmol；最终规格行为，rxn：<1 Ci/mmol）36ul核糖核酸酶抑制剂（36U，BMB）-----738升*注：5m dCTP用于保护cDNA中的Pst位点不被消化随后将cDNA克隆到Bluescript中。d） 在37°X 1.5小时下培养试管。e） 在2-DEAE滤纸圈上各点1 ul的单一反应。确定上述dNTP的合并百分比。

我获得14%的掺入量，相当于每次反应合成9 ug cDNA（162ug cDNA/18rxns）。

f） 水池样品（总计1.8毫升）。增加1/2体积7.5M NH4Ac和2.5体积乙醇。将样品分成8根微量离心管（~1.2ml/管），并储存在冰x 10'。g） 在微型离心机中旋转20'X 4°。h） 用70%的EtOH冲洗颗粒，然后在90ul dH2O中重新悬浮每个颗粒。合并样本。i） 向700ul样品中添加28ul 0.5M Na2EDTA和728ul 0.2M NaOH（新鲜）。j） 将样品分成4管（364ul/管），然后加热65°x 15'以水解RNA。k） 将样品放在冰上。增加1/2体积7.5M NH4Ac和2.5体积将EtOH涂在每根管子上，并存放在10’厚的冰上。l） 在微型离心机中旋转20'X 4°。m） 用70%的EtOH冲洗颗粒，然后在30ul dH2O中重新悬浮每个颗粒。合并cDNA样本并保存在-20°n） 在微型甲醛凝胶上运行1ul（~1ug），以检查相对于cRNA模板。B.在gDNA珠上选择单链cDNA1） 在500ul 0.1N NaOH中清洗珠子5'，然后在500ul-清洗缓冲液A中重新悬浮（50mM Na2HPO4，pH 7.2，0.1%十二烷基硫酸钠）。

所有步骤均在1.5ml Eppendorf试管中进行。

2） 去除清洗液，然后添加500ul杂交混合物（预热至65°）。杂交混合-----------------130μl cDNA（120μg）33ul“游离多聚体”polyA+RNA*200ul 0.5M NaHPO4，pH 7.24ul 10%十二烷基硫酸钠4ul 0.5M乙二胺四乙酸钠29升dH2O100ul 50%硫酸葡聚糖（Pharmacia）-----500升3） 在65°x 16小时的条件下摇动管。4） 将珠子拉到试管侧面，并去除上清液。5） 在500ul洗涤缓冲液B（25mM Na2HPO4，pH7.2，0.1%十二烷基硫酸钠）。6） 在洗涤缓冲液B中以65°角洗涤珠子四次。7） 在100ul洗脱缓冲液（0.1N NaOH）中重新悬浮珠。在房间孵化洗脱cDNA的温度x 10'。8） 将洗脱缓冲液移到新试管中，然后重复步骤7。9） 合并洗脱液（总计200ul）并加热65°x 15'以水解样品中的任何RNA。10） 把管子放在冰上。增加1/2体积7.5M NH4Ac和2.5体积将EtOH涂在每根管子上，并存放在10’厚的冰上。11） 在微型离心机中旋转20'X 4°。12） 用70%的EtOH冲洗颗粒，然后在50ul dH2O中重新悬浮颗粒。13） 在闪烁计数器中计数1ul样品，以确定产率。

我从gDNA珠中获得580ng cDNA（占杂交混合物中总cDNA的0.5%）。

*注：“游离多聚体”是指细胞中不与粗面内质结合的多聚体网，因此不翻译膜或分泌蛋白。游离多糖体RNA作为竞争对手添加到hyb混合物中，以防止cDNA代表非膜与gDNA结合的蛋白质。这有助于保持文库对cDNA的偏见编码膜和分泌蛋白。三、 cDNA文库的制备A.第二链合成1） 联合收割机：46ul洗脱cDNA（580ng，~2pmol）2ul Bluescript KS引物（KS互补序列存在于所有cDNA插入物的5'末端）6ul 10X Klenow缓冲液（0.5M NaCl，0.1M Tris，7.4M MgCl2）2） 加热65°x 2'，在30'以上缓慢冷却至30°。3） 添加：1.0ul 6mM dNTP3.0升0.1M DTT1.2ul 32P-dATP（4pmol，3000Ci/mmol）5.0升Klenow（30升，Pharmacia）4） 培养15°x 5小时。5） 在室温x 30’下培养。6） 添加：1ul 1mM ATP1ul多核苷酸激酶（10U）7） 培养37°x 15’。8） 添加等体积（60 ul）苯酚/氯仿，涡旋，旋转5'。9） 将水相移到新管中。用60ul TE 7.4重新萃取有机相。10） 合并水相，添加1/2体积7.5M NH4Ac和2.5体积EtOH并储存在10英尺的冰上。11） 在微型离心机中旋转20'X 4°。12） 用70%的EtOH冲洗颗粒，然后干燥颗粒并在33ul dH2O中重新悬浮。B.cDNA末端的修复1） 联合收割机：33.00ul cDNA样本1.25ul 10mM dNTP5.00ul 8X修复缓冲液（265mM三乙酸盐，7.8，535mM KAc，80mM碳酸镁，4mM DTT，640微克/毫升BSA）1.30ul T4 DNA聚合酶（4U）-------40.50升2） 培养37°x 45’。3） 添加40ul dH2O，然后如上所述添加苯酚/氯仿提取物。4） 合并水相，添加1/2体积7.5M NH4Ac和2.5体积EtOH并储存在10英尺的冰上。5） 在微型离心机中旋转20'X 4°。6） 用70%的EtOH冲洗颗粒，然后干燥颗粒并在50ul dH2O中重新悬浮。C.链节结扎1） 合并：25ul cDNA（按cpm计算~330ng）4ul 10X结扎缓冲液（NEB）1ul 20mM ATP6ul退火HindIII/XmnI适配器（NEB）4ul T4连接酶（4U，BMB）----40升2） 培养16°x 8小时。3） 加热65°x 10'。4） 添加10ul 0.5M NaCl、50ul 1X BMB限制缓冲液H和1.5ul Pst（15U）。

Pst消化将在寡核苷酸dT尾部下游的Pst位点切割，但不会在内部位点切割因为cDNA是用5m-dCTP合成的。

5） 培养37°x 1小时。6） 添加40ul dH2O，然后如上所述添加苯酚/氯仿提取物。7） 合并水相，添加1/10体积的3M NaAc和2.5体积的NaAcEtOH并储存在10英尺的冰上。5） 在微型离心机中旋转20'X 4°。6） 用70%的EtOH冲洗颗粒，然后在50ul dH2O中重新悬浮。D.将cDNA克隆到Bluescript1） 大小选择cDNA（~300ng），如Molecular Cloning，eds.Fritsch等人。2） 将大小选择的cDNA连接到Bluescript中，如下所示：a） 联合收割机：10.0ul cDNA（~100ng）2.0ul Pst/HindIII-digested Bluescript SK+（~100ng）1.4ul BMB连接酶缓冲液1.0ul BMB连接酶（1U）------14.4升b） 培养16°x 8小时。c） 转换2-100ul等分的Stratagene XL1 Blue MRF细胞（1 x 109cfu/ug），每个细胞带有5ul结扎混合物。d） 将每一个变换电镀到5个LB-amp板上。我总共获得88000个菌落，其中约50%为深蓝色因此可能缺少插入。我把殖民地集中在一起，产生一个拥有约44000个独立克隆的库。