1.简介
疟疾仍然是威胁生命的主要疾病,主要影响热带地区的国家。在过去十年中,以青蒿素为基础的治疗方法以及各种保护和预防措施的引入减少了严重疟疾感染的数量。然而,2011年仍有约2.16亿疟疾临床病例,导致约660例 000人死亡(世界卫生组织,2012年). 这些病例大多是由寄生虫引起的感染恶性疟原虫这种寄生虫的快速耐药性,最近在一些亚洲地区(曼斯克)发现的抗青蒿素菌株证明了这一点等。,2013年; 米奥托等。,2013年),进一步强调迫切需要新的、廉价的和有效的抗疟疗法。
多胺对细胞生长和增殖至关重要(华莱士等。, 2003; Gerner&Meyskens,2004年; Casero&Marton,2007年). 细胞需要最丰富的多胺(腐胺、亚精胺和精胺)的平衡水平,而多胺水平的失调会导致生长停滞或细胞死亡(Persson,2009; 诺沃塔斯基等。,2013年). 这些观察结果表明,抑制多胺生物合成途径可以作为治疗癌症和热带病(巴基等。, 1980; 米勒等。, 2008; 比尔霍尔茨等。, 2011). 后者得到了DFMO(二氟甲基鸟氨酸)在治疗由以下原因引起的非洲昏睡病方面的成功支持布氏锥虫(Wickware,2002年). DFMO抑制多胺-生物合成途径中的第一步:鸟氨酸脱羧酶催化鸟氨酸脱羧(ODC;图1一). 多胺生物合成途径的其他酶的抑制剂也被考虑用于热带疾病的治疗(Heby等。, 2007; 比尔霍尔茨等。, 2011). 其中包括S公司-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(AdoMetDC),催化S公司-腺苷甲硫氨酸脱羧S公司-腺苷蛋氨酸(dcAdoMet;图1b条)和精脒合成酶(SpdS),一种氨基丙基转移酶,可转移N个-dcAdoMet的氨丙基与腐胺形成亚精胺和5′-甲基硫腺苷(MTA;图1一). 该途径中的另一种酶也是氨丙基转移酶家族的成员,是精胺合酶(SpmS),它分别使用dcAdoMet和亚精胺作为氨丙基供体和受体来合成精胺(Pegg,2009); Pegg和Michael,2010年).
| 图1 多胺生物合成。(一)多胺-代谢途径示意图恶性疟原虫. (b条)本研究中使用的化合物的化学结构。 |
中存在ODC、AdoMetDC和SpdS,但不存在SpmS恶性疟原虫,尽管有报道称功率因数SpdS可使用亚精胺和dcAdoMet合成亚精胺(海德尔等。, 2005). 这已经被一个晶体结构属于功率因数活性部位(PDB入口)含有MTA和精胺的SpdS3b7便士; 结构基因组学联合会,未出版作品)。与人类细胞类似,多胺的另一个来源是恶性疟原虫似乎是由特定运输工具进口的多胺(苎麻等。, 2006). 然而,目前尚不清楚当寄生虫体内的多胺生物合成受到化学抑制时,多胺转运是否可以补偿体内耗尽的多胺水平。
SpdS是研究得最好的多胺途径酶之一。细菌的晶体结构(海洋热托加,大肠杆菌,霍里克希热球菌和幽门螺杆菌),克氏锥虫(PDB条目3磅和3个工作循环; 致病原生动物联盟的结构基因组学,未发表的工作),人类,植物(拟南芥; PDB条目1xj5个; 真核结构基因组学中心,未发表的工作),秀丽隐杆线虫和功率因数SpdS已被单独测定或与各种配体复合测定(Korolev等。, 2002; 杜夫等。, 2005; 卢等。, 2007; 吴等。, 2007; 周等。, 2010). 第一个要确定的SpdS X射线结构是马里蒂玛锥虫(科洛列夫等。, 2002). 这项工作显示了一种折叠成两个结构域的结构:一个N-末端β-片状结构域(残基41–97)和C末端Rossmann-fold型结构域(残留基98–321)。C末端结构域与I类甲基具有显著的结构同源性转移酶使用AdoMet作为甲基供体。SpdS的活性位点位于域之间,由两个相互连接的裂缝组成,用于结合dcAdoMet和腐胺。一种被称为看门人环的保守的柔性结构元件覆盖着酶的活性位点(Korolev等。, 2002). 在复合体的结构中马里蒂玛锥虫含抑制剂的SpdSS公司-腺苷-1,8-二氨基-3-硫辛烷(AdoDATO;图1b条显示了文中提到的化合物的支架)门控环具有良好的有序结构,而在无配体酶中,它不能定位在电子密度图中。AdoDATO被设计为一种多基质类似物抑制剂,并具有IC50值0.012–0.4 µM(M)(取决于分析中dcAdoMet的浓度)用于大鼠SpdS(Tang等。, 1980; 佩格等。, 1983)和0.7 µM(M)对于大肠杆菌SpdS(佩格等。, 1983).
这个晶体结构属于功率因数SpdS已被测定为无配体形式,并与dcAdoMet、MTA和抑制剂AdoDATO和反式-4-甲基环己胺(4MCHA;Dufe等。, 2007). 4MCHA设计用于占据腐胺结合位点,具有中等强度的抑制活性,具有IC50第页,共1.7页 µM(M)鼠用SpdS(Shirahata等。, 1991). 抑制功率因数4MCHA和AdoDATO的SpdS也进行了研究,并揭示了IC504MCHA值在其他生物体酶的范围内,但IC稍高50AdoDATO的值(1.4 和8.5 µM(M)分别为;海德尔等。, 2005; 杜夫等。, 2007). 然而,在分析中使用较低浓度的dcAdoMet时,IC50第页,共0.5页 µM(M)是为了抑制功率因数AdoDATO的SpdS值,与其他生物体的值处于相同范围内(L.Persson,未发表的观察结果)。复合物的结构表明AdoDATO与功率因数SpdS与马里蒂玛锥虫(科洛列夫等。, 2002)4MCHA确实在腐烂部位结合。在与AdoDATO和dcAdoMet复合物的结构中,守门环(残基196–208 In功率因数订购SpdS)。另一方面,在apo结构中,这个循环完全或大部分是无序的(Dufe等。, 2007). Šečkutм等。(2011)还证明dcAdoMet类似物脱羧S公司-腺苷同型半胱氨酸(dcSAH)抑制人,马里蒂玛锥虫和功率因数SpdS与IC呈剂量依赖性50低微摩尔范围内的值。有趣的是,IC50的值功率因数SpdS约为人类SpdS的十倍。在晶体结构在与dcSAH复合的人SpdS中,抑制剂被证明与dcAdoMet位点结合,具有部分有序的看门人环(Šečkutï等。, 2011).
其他几种化合物已被用于研究SpdS的抑制作用。白畑等。(1991)研究了一系列环己胺衍生物和环苯胺衍生物,它们也被建议与酶的腐胺结合位点结合。一般来说,环己胺基化合物被证明是更好的SpdS抑制剂。例如,虽然4MCHA有一个IC50值1.7 µM(M),4-甲基苯胺(4MAN)通过IC抑制大鼠SpdS50值108 µM(M)(白幡等。, 1991). 然而,尽管苯胺的抑制活性较低,但其亲脂性不如环己胺基化合物,更容易进行化学修饰,因此可能是进一步开发先导化合物的更好选择。最近一次设计SpdS抑制剂的尝试生物信息学复合库的筛选(雅各布森等。, 2008). 在库中的260万个化合物中,有28个被挑选出来进行核磁共振结合分析。其中有7个与酶结合,其中一个为5-(1)H(H)-苯并咪唑-2-基)戊烷-1-胺(BIPA;图1b条)表现出很强的结合亲和力(雅各布森等。, 2008).对接研究预测该化合物的氨基戊基部分占据腐胺结合位点,苯并咪唑部分占据N个-氨丙基位点。然而,SpdS与苯胺衍生物或BIPA的配合物中的晶体结构以前没有报道过,因此其与蛋白质的相互作用模式的细节基本未知。
在本研究中功率因数SpdS与MTA和底物腐胺以及通过将腐胺浸泡在功率因数SpdS与dcAdoMet复合。X射线晶体学也用于研究功率因数SpdS与BIPA,4MAN和4MAN,4-氨基甲基苯胺(4AMA)的氨基衍生物。这些结构为配体与SpdS结合的细节、酶活性位点两部分的相互依赖性以及门控环在配体结合中的作用提供了新的见解。实验结果表明,腐胺结合位点可以容纳小的芳香化合物,而不仅仅是脂肪族化合物胺,这一发现,连同其他结果,可能为SpdS抑制剂的设计提供新的方法。
4.讨论
这项工作介绍了功率因数SpdS与4MAN、4AMA和BIPA三种不同配体的复合物,其中4MAN具有抑制活性。此外,我们还提出了与底物腐胺和反应产物MTA的配合物,以及与反应产物MTA和亚精胺的配合物。后者是由于腐胺浸入SpdS与dcAdoMet复合物的晶体中时发生的酶反应而获得的。复合体的结构强调了早期观察的重要性(科洛列夫等。, 2002; 杜夫等。, 2007; 吴等。, 2007)这表明,与SpdS腐烂位点结合的配体需要通过dcAdoMet位点中的配体稳定门控环的构象。另一方面,与BIPA的复合物表明,具有特定支架的配体可以单独与酶结合,并仍然形成环稳定所需的相互作用。
基于这项研究的结果和早期数据(Shirahata等。, 1991; 海德尔等。, 2005; 杜夫等。, 2007),潜力的分类功率因数可以将SpdS配体分为两组。第1组包含的配体可以稳定柔性环,并且不需要存在其他配体来与酶结合。属于这一组的化合物包括(1a)底物dcAdoMet、反应产物MTA及其类似物(Hibasami等。, 1980; 拉卡宁等。, 1995; Šečkutм等。, 2011)其代表是所谓的多底物加合物抑制剂AdoDATO(Tang等。, 1980)它结合了MTA和dcAdoMet的支架(图1b条)和(1b)配体,它们与酶的自由形式结合,类似于BIPA,采用替代的门控-上稳定机制。第2组包含4MAN、4AMA和4MCHA等化合物,这些化合物仅在dcAdoMet位点中存在门控环稳定配体的情况下才能与腐烂位点结合。
虽然4MAN和4MCHA是SpdS的中度抑制剂,但4AMA的抑制活性要弱得多(在1 米M(M)浓度)。这些化合物的主要价值在于它们的结合模式,这表明在设计腐胺竞争对手时可以使用芳香基团,而不仅仅是线性链,这一发现在设计新的SpdS抑制剂时应该考虑。需要进行更多的研究来探索这些化合物对SpdS的抑制细节,例如,研究它们的抑制作用是否仅取决于与腐胺的竞争,或者包括一些其他因素,这些因素会影响dcAdoMet或MTA的结合。MTA–腐胺复合物的结构(图3一)表明腐胺可能在亚精胺释放后和MTA/dcAdoMet交换前直接与酶结合。该结构还表明,即使是腐胺竞争性抑制剂也可能在酶促反应的这个阶段结合。
虽然酶活性研究表明,MTA及其一些类似物通常是SpdS的弱抑制剂(浓度为0.1时抑制约30% 米M(M)),SpmS以更高的效力被抑制(Pajula&Raina,1979; 希巴萨米等。, 1980; 池口等。, 2006). 吴等。(2008)讨论了SpdS和SpmS在MTA结合方面存在差异的原因。尽管如此,研究表明,细胞中MTA浓度的增加仍可能降低SpdS的活性(Pegg&Michael,2010)). 基于此,有人认为,例如,MTA磷酸化酶(MTAP)抑制剂对癌细胞的作用可能是由于MTA水平升高(Basu等。, 2011). 然而,随后的研究表明,肺癌细胞中MTAP的完全抑制对多胺水平没有影响(Basu等。, 2011). 然而,调查MTA和dcAdoMet水平的变化是否会影响疟原虫会影响精脒和精胺水平功率因数通过MTA和腐胺进行SpdS。例如,MTAP和AdoMetDC的联合抑制可能会干扰细胞内dcAdoMet/MTA平衡,从而使MTA成为dcAdoMet的有效竞争对手。此外,腐胺或甚至在腐胺部位结合的另一配体可以通过稳定门控环来促进酶抑制,这可能导致更稳定的MTA结合。值得注意的是,在人SpdS与MTA、MTA/腐胺和MTA/精脒复合物的结构中B类门卫环路的因子约为42、28和29 Å2分别清楚地显示了当MTA单独结合时环路的更高的灵活性。类似的图片出现在具有功率因数SpdS:具有MTA的复合体(PDB条目2小时; 维达迪等。, 2007)具有平均值B类系数32.5 Å2而MTA/腐胺复合物(PDB进入4个基点1)和MTA/精脒(PDB入口4立方厘米)具有平均值B类21.9和21.4的系数 Å2分别是。
对早期结构和本文所述结构的分析表明,结合配体与柔性环的N端和C端的相互作用对环稳定至关重要。因此,在与结合的dcAdoMet和4MAN的配合物中,这些相互作用分别涉及腺嘌呤部分的外环胺和dcAdoMet的氨丙基与门控-上残基Pro203和Asp196(图3c(c))而抑制剂4MAN的氨基占据腐胺远端氨基的位置,可能与Asp199形成氢键。在这三个残基中,Asp196和Asp199在SpdS序列中是不变的,而Pro203是高度保守的。此前有人建议(吴等。, 2007)谷氨酰胺替代Pro203对应的残基是导致门控环在马里蒂玛锥虫SpdS(Glu178英寸马里蒂玛锥虫编号)。在大肠杆菌用谷氨酰胺替换相应的残基(Pro165),产生的酶与野生型酶相比活性约为50%(Lee等。,2013年). 当MTA与腐胺结合在复合物中时,腐胺的近端氨基取代了dcAdoMet的氨基丙基与Asp196的相互作用(图3一). 当MTA和亚精胺结合在活性部位时,观察到类似的排列(图3b条). 因此,将dcAdoMet转换为MTA的一个后果是与Asp196失去交互,这可能导致MTA的亲和力低于dcAdoMet,再加上网关守卫循环的灵活性更高,可能会触发MTA/dAdoMet交换。
另一方面,BIPA的绑定模式支持不同的回路稳定方式。因此,咪唑环的一个氨基似乎通过与Asp196形成氢键来稳定守门环的N端部分,尽管Ser197和Ser198的主链羰基和Ser198的侧链也处于氢键距离。在环的另一端缺乏与Pro203的相互作用可能是BIPA是SpdS的不良抑制剂的原因之一。然而,BIPA的结合模式仍然可以用于设计新的SpdS有效抑制剂。
这项工作的结果表明,结合到活性位点两部分的配体之间的相互作用及其与柔性环两端的相互作用对于控制配体与SpdS活性位点的结合至关重要。换句话说,门控环不是一个被动的结构元件,而是一个主动的参与者,不仅控制配体结合,还控制酶反应。在设计新的SpdS抑制化合物的未来策略中,需要考虑这些发现。
致谢
这项工作得到了欧洲科学技术合作组织(COST-CM0801和COST-CM1307)的支持。作者感谢日本Josai大学A.Shirahata博士和Y.Ikeguchi博士慷慨提供dcAdoMet。感谢A.Pegg博士提供AdoDATO。我们还感谢I911站的MAX-lab工作人员在数据收集过程中提供的帮助。
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