1.简介

铜胺氧化酶（CuAOs）催化各种胺底物的氧化，生成产品醛、氨和过氧化氢（Mure等。, 2002). 它们在自然界中普遍存在，在人类中参与多种过程，包括细胞粘附和信号传递（Salmi等。, 1998; 埃尔莫尔等。, 2002; 于等。, 2003). 在细菌中，它们在一般氮分解代谢中起作用（帕罗特等。, 1987; 哈西萨利霍格鲁等。, 1997). 它们包含一种蛋白衍生辅因子，该辅因子通过保守内源性酪氨酸的翻译后修饰自动催化生成2,4,5-三羟基苯丙氨酸醌（TPQ），只需要铜和分子氧的存在（Cai&Klinman，1994; 基姆等。, 2002). TPQ位于蛋白质的核心，位于一个定义明确的底物通路末端，靠近由三种组氨酸配位的II型铜（图1; 帕森斯等。, 1995; 达夫等。, 2006; 威尔斯等。, 1997; 卢内利等。, 2005; 古玛等。1996年; 艾琳等。, 2005; 锂等。, 1998). 这个大肠杆菌酶（ECAO）表现出对小芳香胺底物的偏好，如苯乙胺和酪胺（Roh等。, 1994). 催化反应继续进行通过两个半反应；在氧化半反应中分子氧还原之前，醛产物在还原半反应结束时释放（图2).

图1 ECAO（PDB代码）的结构1对)显示底物内显通道（品红色表面）和活性位点（穆雷等。, 1999). 右下角的面板是活性位点的更详细视图，显示TPQ、铜（II）离子、三个配位组氨酸残基（按原子类型着色的棒状物）和底物内显通道的末端（品红色表面）。使用以下公式计算子状态输入通道CAVER公司（彼得雷克等。, 2006)图像是用PyMOL公司（德拉诺，2002).

图2 CuAOs催化循环示意图，确定反应途径中的关键中间体。图中显示了2型铜中心、蛋白衍生辅因子TPQ和非金属O2-结合位点位于保守活性位点蛋氨酸（ECAO中的Met699）附近。I是酶的静息状态，中间产物II是希夫碱，中间产物III是还原的TPQ或氨基喹啉形式，中间产物IV是氧活化和还原之前提出的非金属结合氧物种，中间产物V是水解释放氨的亚氨基喹啉物种，完成催化循环。

对原核生物和真核生物来源的CuAOs进行的广泛结构和生化分析表明，分子氧在TPQ的另一侧与胺底物结合（图2). 人们对解剖氧到达并结合活性部位的途径颇感兴趣。结构和诱变研究表明氧气不会进入通过必须存在底物通道和其他可能特定的氧通道（威尔斯等。, 1997; 锂等。, 1998; 约翰逊等。, 2007; 威尔莫特等。, 1999; Goto&Klinman，2002年).

最近对氧进入进行了几项晶体学研究，使用氙作为探针，以确定可能是推测的氧进入途径的一部分的分子氧结合位点（Lunelli等。, 2005; 约翰逊等。, 2007; 达夫等。2004年). 氙络合物晶体结构现在可用于CuAO多形Hansenula polymorpha（HPAO），豌豆（PSAO）、牛血清（BSAO），毕赤酵母（PPLO）和球状节杆菌（AGAO）（卢内利等。, 2005; 约翰逊等。, 2007; 达夫等。2004年). 这些结构揭示了氙结合的一致模式，暗示了氧通过保守的β-三明治（图3). 最近，生物信息学计算HPAO、PSAO、AGAO和PPLO中可能的低能氧进入途径的实验支持了结构研究确定的主要途径（约翰逊等。, 2007).

图3 ECAO亚单位将底物-能量通道显示为品红色表面，并将假定的氧-能量途径显示为绿色表面（通过沿通道放置虚拟原子生成）。PPLO、HPAO、AGAO和PSAO中观察到的氙位点显示为氰球。TPQ和铜配体显示为元素着色的棒状物，铜显示为青铜球体。此图像是使用生成的PyMOL公司（德拉诺，2002).

ECAO不同于革兰氏阳性细菌和酵母CuAOs，因为它具有额外的9.3 kDa N末端结构域，使ECAO具有典型的“蘑菇柄和蘑菇帽”形状（帕森斯等。, 1995). 哺乳动物CuAO也拥有一个N端结构域，被认为是膜锚（Smith等。, 1998)但尚未从晶体学上进行可视化（艾伦内等。, 2005). ECAO的生物化学和结构特征表明，活性位点中的氧结合与其他家族成员相似（Smith&McPherson，2008); 然而，可能存在额外的N末端结构域，该结构域位于结构保守的β-三明治，可以改变或提供氧气进入的替代途径。为了调查这种可能性，我们确定了晶体结构ECAO与2.5的氙络合物 Å分辨率。

2.实验

2.3. X射线数据采集和处理

答2.5 在达累斯伯里SRS的光束线14.1上收集了衍射数据集。数据采集是在1.48的最高光束线可到达波长下进行的 最大化氙（Xe）的异常信号（f）′′=6.9），并使用Quantum4 ADSC CCD检测器记录数据。晶体保持在100 K使用低温流（Oxford Cryosystems）。收集360°的数据，振荡角度为1°，暴露时间为30 s.衍射数据使用MOSFLM公司并使用缩放SCALA公司（莱斯利，1992年; 埃文斯，1993年; 表1).

表1 数据收集和处理 括号中的值表示最高分辨率外壳。 波长（Ω） 1.48 温度（K） 100 单位-细胞参数（Ω） 一= 166.9,b条= 134.6,c（c）= 80.3 “空间”组 P（P）212121 分辨率（Ω） 50.0–2.5 (2.55–2.50) R（右）合并†(%) 12.3 (44.8) 完整性（%） 98.6 (94.9) 冗余 10.1 (7.4) 平均值我/σ(我) 23.6 (4.4) †R（右）合并=，其中我我(香港特别行政区)是观察到的强度和〈我(香港特别行政区)\9002；是多次测量的平均强度。

2.4.精炼和模型构建

全部精炼并使用中央处理器4个软件套件和库特（合作计算项目，第4期，1994年）; 埃姆斯利和考坦，2004年). 初始映射是使用本地ECAO（PDB代码）的结构通过直接傅里叶变换计算的1对; 默里等。, 1999). 计算并检查了异常差异图，以确定可能的氙位置。在地图中用σ4级或以上。其中两个（8.5和8.0 r.m.s）位于已知与天然酶（Ca（f）〃=1.2（1.48时） Å). 峰值较弱（3.6–4.6 r.m.s.）位于铜位置和s原子上，预计在该波长（Cu（f）1.48时，〃=0.55 奥，S（f）1.48时，〃=0.5 Å). 当其高于4时，其余峰被指定为氙 r.m.s.与铜、钙或硫没有重叠，对应于F类_o个−F类_c（c）电子密度图和主要位于疏水囊中。对每个氙气的占有率进行了修改，以便在约束细化没有进一步的正电子密度F类_o个−F类_c（c）地图和B类这些因素与附近原子的因素相似。使用模型构建的迭代循环和约束细化进入决赛R（右）16.1%的系数和R（右）_自由的21.9%（表2). 结构验证使用SFCHECK（SF检查）和专业检查（拉斯科夫斯基等。, 1993; 迷茫等。, 1999).

表2 结构精炼和验证 括号中的值表示最高分辨率外壳。 R（右）工作† 16.1 (21.9) R（右）自由的‡ 21.9 (30.1) 反射总数 64552 中的反射数R（右）工作设置 61345 (3900) 中的反射数R（右）自由的设置 3207 (220) 非H原子数量 11947 蛋白质原子数 11348 配体原子数 17 溶剂原子数 582 理想中的R.m.s.d    债券（Å） 0.017  角度（°） 1.7 平均值B类因子（λ2)    主链条 39.6  侧链 41.5  配体 49.4  溶剂 44.7 拉马钱德兰阴谋    允许的区域（%） 99.8  不允许的区域（%） 0.2 PDB代码 2周0次 †R（右）因子=，其中|F类o个|是观察到的结构系数振幅|F类o个|是计算出的结构系数振幅。 ‡R（右）自由的是R（右）系数基于排除在外数据的5%精细化。

3.结果和讨论

之后精细化，在结构中发现了11个氙结合位点（图4一). 虽然所有位置的占有率都很低（0.1–0.45），但这与其他CuAO氙络合物（Lunelli等。, 2005; 约翰逊等。, 2007; 达夫等。2004年). 氙气根据其占用率进行编号（从高占用率到低占用率）。Xe原子被束缚在疏水性口袋中，这些疏水性口袋位于胺底物-通道或保守的β-夹心氧途径（表3). 在不对称单位中的ECAO的两个亚单位中观察到几乎相同的位点¹.

图4 (一)ECAO单体显示基质进入通道为品红色表面，假定的氧气进入通道为绿色表面（通过沿通道放置假原子产生）。ECAO中观察到的Xe位点显示为品红球体。TPQ和铜配体显示为按元素着色的棒，铜显示为青铜球。(b条)ECAO活性位点，与之前一样着色，显示氙1/2、4/11、7/5、8/–和9/–。此图像是使用生成的PyMOL公司（德拉诺，2002).

两个Xe原子结合在胺基态-电子通道中。氙4/11占据了Tyr381和Tyr3807之间的一个位置，这与之前在AGAO和HPAO中观察到的位置相同。Tyr381被提议作为一个门控基板接入TPQ，Tyr38和Tyr378的芳香环允许与芳香胺基板的芳香部分（Wilmot等。, 19972004年). 氙1/2与活性部位结合得更远，但仍靠近胺基通道（图4b条).

两种氙气，氙气7/5和氙气9/–（仅在单体中一个)，绑定在β-三明治，靠近PPLO和PSAO中观察到的氙结合位点（达夫等。2004年; 图4一和4b条). 我们没有在下半部观察到任何氙结合位点β-位于假定的氧能途径底部入口附近的三明治。然而，两个氙结合位点（3/6和8/–）位于β-夹芯，外表面粘合（图4一). 这与其他铜胺氧化酶-氙复合物一致，其中氙结合位点位于β-仅报告了AGAO的夹层通道（图3). PPLO、PSAO和HPAO中该区域缺乏氙结合位点，表明该区域的氙结合不如β-三明治，无论是否存在N-末端结构域。最后一个氙，氙–/10，在ECAO的边缘结合在一个疏水囊中，与之前观察到的任何氙位置都不接近。

此处报道的氙络合物ECAO结构表明，分子氧可能通过与实验和生物信息学其他CuAO的研究（Lunelli等。, 2005; 约翰逊等。, 2007; 达夫等。2004年). ECAO N末端结构域本身没有观察到氙结合位点，该结构域的存在似乎也不会影响下半部的氙结合β-当与已测定氙络合物的其他CuAO进行比较时。这些观察结果表明，N-末端结构域在ECAO催化过程中不起氧气进入的作用，这与跨CuAO的N-末端结构区缺乏守恒一致。