现场全山胚胎杂交线虫

本桥友子、平野庆子和小原裕二
基因组生物学实验室
遗传资源信息中心
国家遗传学研究所
三岛411-8540，日本

由Ikuko Muramatsu、Masumi Obara、Wakako Shimizu、Aya Hamakawa和Yuji Kohara（2005年4月27日）
通信：Ikuko Muramatsu<isugiura@lab.nig.ac.jp>,小原裕治<ykohara@lab.nig.ac.jp>

内容：

  1. 原位杂交用DIG标记DNA探针的制备
  2. 固定少量蠕虫的胚胎
  3. 大规模胚胎固定
  4. 杂交和信号检测
  5. 试剂

A.DIG标记DNA探针的制备就地杂交

I.线性PCR标记DIG

  1. 1.制作以下反应混合物（总计10μl）；
    蒸馏水4.4微升
    锚定寡核苷酸引物*3.0微升
    10 x Taq缓冲器1μl
    聚合酶0.1μl
    10 x DIG-dUTP/dNTP混合物**1.5微升
    从yk克隆扩增的cDNA插入物（>3.5纳克/μl）使用T7/T3引物0.6微升
    *锚定寡核苷酸引物
    5.3微米（dT）17dG/5.3微米（dT）17数据中心/21.3微米（dT）17数字助理
    （这是为了避免poly-A拉伸的影响。可以使用其他载体引物。）
    **10 x DIG-dUTP/dNTP混合物
    0.35mM DIG-dUTP/0.65mM dTTP/1mM每个d（A、G、C）TP
  2. 进行热循环；
     95热启动哦C持续45秒
     95哦C x 15秒
     45哦C x 1分钟
     72哦C x 1分钟
    50次循环
  3. 添加10μl 10mM EDTA。
  4. 通过G-50旋转柱色谱（约250μl床层体积）。
  5. 添加5μl TSE。

二、。通过DNaseI消化切割探针

  1. 在冰上制备以下反应混合物（总计25μl）；
    G-50洗脱液20微升
    10mg/ml鲑鱼精子DNA1 μ
    蒸馏水0.5微升
    10 x DNA酶缓冲液*2.5微升
    DNA酶I（16μg/ml）**1微升
    *10 x DNA酶缓冲液：0.5M TrisHCl pH 7.5，0.1M MgCl2
    **用0.1M NaCl稀释储备液（1mg/ml）
    （注：探头的最佳尺寸约为100个底座。较长的探头可能会导致高背景。酶的浓度应通过以下方式进行优化试点试验。）
  2. 37岁时孵化哦C持续30分钟。
  3. 在冰上转移。
  4. 添加5μl 0.1M EDTA。
  5. 75度加热哦C持续5分钟。
  6. 通过碱性琼脂糖凝胶电泳和DIG检测检查尺寸，如有必要。
  7. 冷冻保存。

B.固定少量蠕虫的胚胎

  1. 取硅化1.5 ml eppendorf试管。
  2. 将约100μl蒸馏水放在盖子顶部（内侧）。
  3. 采集40-50条妊娠蠕虫并转移到水中。如果你需要非常晚期的胚胎；
    1. 在S-basic中添加50μl大肠杆菌OP50悬浮液。
    2. 用管体盖住盖子。
    3. 让我们20点起立哦C过夜。
  4. 把虫子打下来。
  5. 加入等量的2 x碱性浸出液，并充分混合。
  6. 在室温下放置10分钟，以溶解成人尸体。
  7. 在4处添加1ml M9缓冲液哦C、。
  8. 以2500 rpm离心30秒，4哦摆动转子中的C。
  9. 小心地取下汤汁，留下约100μl汤汁不取下胚胎。
  10. 重复7.-9.再重复三次。
  11. 添加等量的3 mg/ml几丁质酶。
  12. 混合并在室温下培养3分钟。
  13. 以2500转/分的速度旋转30秒，转速为4哦C、。
  14. 将体积减少至约50μl。
  15. 使用硅化吸管头。
  16. 加入一半体积的4%明胶和2%牛血清白蛋白，用移液管轻轻搅拌。
  17. 静置几分钟，让胚胎沉降到底部。
  18. 用盖玻片盖住（24 x 40 mm）。
  19. 把它放在干冰块的顶部。
  20. 在-70℃下冷冻7分钟哦C、。
  21. 迅速剥下盖玻片。
  22. 将载玻片浸泡在-20℃冷却的甲醇中哦C持续5分钟。
  23. 将载玻片浸泡在以下一系列溶液中进行复水4时预冷哦C类；
    甲醇持续5分钟
    甲醇：甲醛-Hepes-PBS*=35:15持续2分钟
    甲醇：甲醛-Hepes-PBS*=25:25持续2分钟
    甲醇：甲醛-Hepes-PBS*=15:35持续2分钟
    甲醛-Hepes-PBS*持续20分钟
    *甲醛-Hepes-PBS
     Hepes公司200毫升
     10个PBS25毫升
     甲醛25毫升
  24. 将载玻片浸泡在下列溶液中进行脱水在r.t。；
    乙醇：PBS=15:35持续5分钟
    乙醇：PBS=25:25持续5分钟
    乙醇：PBS=35:15持续5分钟
    乙醇5分钟x 2次
  25. 储存在-20℃的乙醇中哦C、。

C.胚胎的大规模固定

一、胚胎的采集

  1. 从混合阶段种群中获取大量蠕虫。
  2. 用M9缓冲液清洗蠕虫2次。
  3. 通过50μm尼龙网筛分收集L1-L3。
  4. 让收集到的蠕虫在液体培养中成长为年轻的成年人。
  5. 从培养物中取出1毫升包装好的蠕虫，这将为现场。
  6. 在15ml Falcon管（透明型）中的4ml水中重新悬浮蠕虫。
  7. 加入5ml 2 x碱性浸出液，搅拌均匀，静置10分钟。
  8. 将蠕虫穿过23号针头推到尼龙网上。
  9. 通过使用摆动转子以800 x g的速度旋转滤液来收集胚胎。
  10. 用M9清洗胚胎4次，然后转移到硅化物中eppendorf管。

二、。固定

  1. 取100μl（装量）胚胎，调节体积至200μl含M9。
  2. 加入200μl乙酰胆碱酯酶（0.3M甘露醇中的15mg/ml）并剧烈摇晃持续75秒。
  3. 用EH缓冲液（胚胎处理缓冲液）清洗胚胎3次。
  4. 用碱性EH缓冲液清洗胚胎。
  5. 将胚胎重新放入1ml碱性EH缓冲液中。（注：为了成功，需要20-30%的胚胎在这一步中进行了脱碲化。）
  6. 将30μl/孔的碱性EH缓冲液置于每孔的聚-l-赖氨酸上涂有涂层的8孔载玻片。
  7. 将5μl/孔胚胎悬浮液注入每个孔的缓冲液中。
  8. 4点静置10分钟哦C将胚胎沉淀到底部。
  9. 取出缓冲液，立即浸入-20度的甲醇中哦C持续5分钟。
  10. 将载玻片浸入以下系列中，使胚胎复水在4哦C.溶液必须在4时预冷哦C、。
    甲醇5分钟
    甲醇：庚烷中3.7%甲醛-PBS=7:3 2分钟
    甲醇：3.7%甲醛在庚烷PBS中=1:1 2分钟
    甲醇：庚烷中3.7%甲醛-PBS=3:7 2分钟
    庚烷PBS中3.7%甲醛 22时75分钟哦C
  11. 将载玻片浸入以下系列，使胚胎脱水在r.t。
    乙醇：PBS=3:75分钟
    乙醇：PBS=1:15分钟
    乙醇：PBS=7:35分钟
    乙醇5分钟x 2次
  12. 12.储存在-20度的乙醇中哦C、。

D.杂交和信号检测

一、蛋白酶K处理

  1. 通过浸泡以下乙醇系列使胚胎复水；
    0.03%H2O（运行）2乙醇中：PBS=7:3 2分钟
    乙醇：PBS=1:15分钟
    乙醇：PBS=3:75分钟
  2. 将载玻片浸入PBT中5分钟，清洗载玻片一次。
    *对于晚期胚胎，额外的HCl治疗是有效的切割出现在晚期胚胎上的蛋白多糖的糖苷键。
    1. 将载玻片在0.2N HCl中浸泡20分钟。
    2. 将载玻片在PBT中清洗2次，持续5分钟。
  3. 将载玻片浸入蛋白酶K（PBT中10μg/ml）中并孵育在r.t.下保持11分钟。
  4. 将载玻片浸入2 mg/ml甘氨酸PBT中，停止消化2分钟。
  5. 将载玻片浸泡在PBT中，每次2分钟，清洗两次。
  6. 通过将载玻片浸泡在3.7%甲醛中的庚烷-PBS中进行重新安装。持续50分钟。
  7. 将载玻片在PBT中清洗两次，每次5分钟。
  8. 将载玻片在2 mg/ml甘氨酸中浸泡在室温下的PBT中5分钟。
  9. 在PBT中清洗载玻片5分钟。

二、。预混合

  1. 将载玻片浸入以下一系列混合物中；
    50%甲酰胺，5xSSC，肝素，0.1%吐温：PBT=1:1 10分钟
    50%甲酰胺、5xSSC、肝素、0.1%吐温 10分钟
  2. 擦掉幻灯片
  3. 用免疫笔在样品井周围画一个矩形形成山脊。
  4. 添加250μl变性的热量（在99哦C冷却10分钟并快速冷却5分钟）杂交溶液。
  5. 将幻灯片放在一个潮湿的室内，室内有一条纸巾，用50%甲酰胺，5XSSC。（无需使用盖玻片。）
  6. 48岁时孵化哦C持续1小时。

三、 杂交

  1. 为每张幻灯片添加50μl热变性DNA探针。（探针的最终浓度约为0.06μg/ml。）
  2. 用副膜盖玻片盖玻片以减少蒸发。
  3. 在48℃培养载玻片哦C在潮湿的室内过夜。

四、 清洗

  1. 在48哦C轻微搅拌。
    50%甲酰胺，5xSSC，肝素，0.1%吐温：PBT=1:1
    （对于每个载玻片，首先在单独的容器中进行清洗。）    		 2分钟
    50%甲酰胺，5xSSC，肝素，0.1%吐温：PBT=1:1 10分钟x 2次
    0.8xPBS，0.1%CHAPS 20分钟x 4次
  2. .在室温下用PBT清洗载玻片两次5分钟，以去除CHAPS。

五、探头检测

  1. 在PBtr（PBS，0.1%Triton-X100，0.1%BSA，0.01%氮化钠三)在r.t.下持续1.5小时。。
  2. 用250μl抗DIG结合物覆盖胚胎（稀释1:2500）/8孔载玻片。
  3. 在室温下在潮湿的室内培养2小时。（无需使用盖玻片。）
  4. 用PBtr轻轻搅拌，将载玻片清洗4次。
  5. 用染色缓冲液清洗载玻片两次，每次5分钟每个在r.t。。
  6. 颜色开发
    1. 将180μl NBT和140μl BCIP混合在40 ml染色缓冲液中。
    2. 22将载玻片浸入混合物中1小时哦中的C黑暗，监测染色程度。
  7. 用PBS、20mM EDTA清洗载玻片三次，以停止反应。
  8. 如有必要，将载玻片在Tris缓冲液中的1μg/ml DAPI中孵育在4哦C持续30分钟。

六、 安装

六、 A.永久安装1。

  1. 在胚胎中添加约90μl“MOUNT-QUICK AQUEOUS”在幻灯片上。
  2. 用盖玻片盖住。
  3. 让我们站一天把它弄干。
  4. 用指甲油封住盖玻片的边缘。

六、 B.永久安装2。

  1. 用以下乙醇系列进行脱水；
    乙醇：PBS=3:75分钟
    乙醇：PBS=1:15分钟
    乙醇：PBS=7:35分钟
    乙醇5分钟x 2次
  2. 用乙醇清洗一次：组织-清除（国家诊断）=1:1。
  3. 用Histor-Clear清洗一次。
  4. 在胚胎上滴上几滴Mount-Quick，并用盖玻片盖住。
  5. 让幻灯片停留在40哦持续数小时。
（注：此方法的杂交信号往往比其他方法和扩散，但保存形态优于其他方法。）

六、 C.甘油支架

  1. 在胚胎上滴入90%甘油、10mM Tris、1%没食子酸正丙酯。
  2. 用涂有凡士林的盖玻片覆盖：固体石蜡=9:1，在4个角作为垫片。

E.试剂

M9型
千赫2人事军官43克
纳2高性能操作46克
100万硫酸镁41毫升
将DW添加到总1升中，并自动Clave
S-基底
氯化钠69克
100万K-PO4（pH6）100毫升
胆固醇（5 mg/ml乙醇溶液）2毫升
将DW添加到总计2升和autoClave中
2 x碱浸溶液
氯化钠3毫升
500万KOH2.5毫升
数据仓库19.5毫升
美国公共广播电视公司
氯化钠137百万
KCl公司2.7百万
纳2高性能操作4430万
千赫2人事军官41.5毫米
将pH值调节至7.2并自动清洗
PBT公司
PBS+0.1%吐温20
EH缓冲器（胚胎处理缓冲器）
甘露醇30万
肝素pH值7.250毫米
氯化钠10毫米
氯化镁210毫米
EGTA公司0.04%
全日空航空公司4不三2毫米
明胶0.1%
DTT公司2毫米
基本EH缓冲器
（=无EGTA、NH的EH缓冲器4不三、明胶和DTT）。
PBT中的甘氨酸
在PBS中的甘氨酸2 mg/ml
AutoClave，然后添加0.1%吐温20
庚烷PBS中3.7%甲醛
hepes缓冲液*：福尔马林：10 x PBS=8:1:1
*hepes缓冲液
 赫普斯100毫米
 硫酸镁42毫米
 EGTA公司0.04%
向pH6.9和autoClave中添加NaOH
杂交溶液
甲酰胺50%
SSC（pH7，自动包覆）5倍
声波鲑鱼睾丸DNA100微克/毫升
酵母tRNA100微克/毫升
肝素100微克/毫升
吐温200.1%
yatalase（15 mg/ml）和几丁质酶（1mg蛋白质/ml=5 mg粗品/ml）
  1. 乙酰胆碱酯酶（TAKARA No.T017）或几丁质酶溶解粉末（SIGMA编号C-6137）在0.3M甘露醇、50mM Hepes pH 7.2、10mM NaCl、，10毫米氯化镁2，2毫米DTT
  2. 通过0.45μm注射器过滤器过滤。
  3. 存储在-20哦C、。
地高辛-11-dUTP
（罗氏1570013）
PBT公司
PBS中0.1%吐温-20（0.01%DEPC处理）
PBtr公司
0.1%BSA（V组分），0.1%Triton X-100（PBS）
蛋白酶K原液
20 mg蛋白酶K（罗氏30U/mg）/ml水
染色缓冲液（碱性磷酸酶反应缓冲液）
100毫米氯化钠
500万氯化镁2
100毫米三氯化氢pH 9.5
1毫米左旋咪唑
0.1%吐温-20
聚-L-赖氨酸涂层载玻片
  1. 将玻璃载玻片浸入厨房清洁剂溶液中20分钟。
  2. 用自来水冲洗1小时。
  3. 在离子交换水中清洗。
  4. 蒸压并在80℃下干燥哦C、。
  5. 将聚-L-赖氨酸溶液（SIGMA P-8920）滴到幻灯片。
  6. 静置25分钟。
  7. 吸出多余的溶液（仅当使用3孔载玻片时）。
  8. 65岁时干涸哦C持续1小时。
胸膜盖玻片
  1. 沿着方形块边缘滴橡胶水泥珠副胶片。
  2. 35-40度短暂干燥哦C、。

如果在上述文档中看不到希腊字符（例如微升、微克…），请单击在这里.

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